技术领域本发明涉及分析男性精液粘稠度正常与否的快速简便判定方法。采用一定粗糙表面的载玻片，使精液样品从一定倾斜角度的载玻片的固定位置浓度开始靠重力作用下自然流淌，在规定时间内检查精液流淌前端是否超过标志线，以此结果判定精液样品的粘稠度是否达到男性生育的最低标准。本方法的定性判定结果有助于分析男性不育的原因。
背景技术：
男性不育症是人类生殖的最重要的问题之一，更是男科学最常见的临床问题和严重挑战。由于近30～50年以来男性精子质量与数量下降，睾丸癌、睾丸下降不良、尿道下裂和不育症的发病率不断升高的趋势，男性不育症备受重视。尽管近年来对男性不育症的诊断和治疗取得了明显的进展，但是男性不育症依然是迄今为止男科临床医生面临的一个极为困难的问题，其原因是人们对男性生殖，特别是精子发生的认识远不清楚，同时不育症并非是独立的病种，受到环境、遗传等多种因素的影响，男性不育症中超过50％的病人的实际病因仍属未知，这就必然加大了临床工作中的难度。引起夫妇不育的因素众多、复杂，涉及男女生殖以及整体健康状况，而对任何病种明确特异病因不仅是选择合理和有针对性的治疗方案所必需，也是判断预后的客观依据。世界卫生组织(WHO)在25个国家9000对不育夫妇的多中心研究中发现，50％的男性不育症是特发性精子异常，其中40％左右的人精子活力不足(弱精症)。弱精症可能与精索静脉曲张、泌尿生殖系的非特异性感染(如大肠杆菌感染)，某些代谢药、抗疟药、雌激素、氧化氮芥等因素的有关，因此伴随环境污染和药物滥用，男性精子活力不足的问题将趋于加重。精子必须在精液提供的液体环境中游动，离开精液无法移动，因此精液的粘稠度严重影响精子的游动，进而影响精子活力和受孕。液化后的精液如果粘稠度过高，在一定程度上会导致不育，据估计，男性不育中大约有9％左右是由于精液粘稠度过高导致的。世界卫生组织2011人类精液检查与处理实验室手册推荐的精液粘稠度检查方法有两种，分别是滴管法和玻璃棒拉丝法，通过观察拉丝的长度判断精液样品的粘稠度正常与否。当拉丝长度小于2厘米时，即认为精液样品粘稠度正常，当拉丝长度超过2厘米时，即认为精液样品粘稠度异常(不正常)。WHO推荐的方法尽管简便，但需要比较专业的器材，比如广口径(直径约为1.5mm)的一次性塑料吸液管，或者玻璃棒，而拉丝会在短时间内形成后瞬间消失，准确测量其长度比较困难，而且无法在案边自行完成，因此需要在专业实验室、由经验丰富的技师完成。然而男性精液因为涉及个人隐私问题，怀疑精子浓度和活力有问题的男性往往对涉及自己雄性能力的敏感问题讳莫如深，极不愿情愿需要第三方介入的检测。本发明着眼于男性精液粘稠度的分析，公开了一种快速简便、自助完成的男性精液粘稠度正常与否的判定方法，使男性在需要的情况下在自己家中非常隐私地完成精液粘稠度正常与否的分析，随时监控自己精液状况，协助评价自己生育能力和生殖系统健康状况，指导优生优育和不育的诊断治疗，提高了不育症的受检率，为提早发现提早治疗提供了可能，为家庭和社会和谐提供保障。
技术实现要素：
本发明公开了一种涉及分析男性精液粘稠度正常与否的快速简便判定方法。采用一定粗糙表面的载玻片，使精液样品从一定倾斜角度的载玻片的固定位置浓度开始靠重力作用下自然流淌，在规定时间内检查精液流淌前端是否超过标志线，以此结果判定精液样品的粘稠度是否达到男性生育的最低标准。本方法的定性判定结果有助于分析男性不育的原因。本发明的申请人使用不同粗糙度的载玻片，在表面采用颜色标出明显的滴样点和参考线，一滴液化后的精液原始样品(40～50μl)被滴到点样圈上，然后将载玻片倾斜一定角度的架子上，使得精液样品从滴样点开始靠重力作用下自然流淌，在规定时间内检查精液流淌前端是否超过参考线。如果精液流淌前端在规定时间超过参考线，则判定次样品粘稠度正常，即满足生育的基本条件；反之，如果精液流淌前端在规定时间未超过参考线，则判定此样品粘稠度不正常(异常)，即可能不满足生育的基本条件，建议进一步检查诊断。本方法暂时命名为载玻片流淌法。同一样本采用WHO推荐的任意方法和载玻片流淌法同时检查粘稠度正常与否，两种方法完成一定数量的样本后，统计分析检查结果，判定两种方法获得的粘稠度正常与否的一致性是否具有统计学差异。结果表明，载玻片流淌的方法获得的精液粘稠度正常与否的判定结果与WHO推荐的滴管法判定结果没有统计学差别，也与WHO推荐的玻璃棒方法判定结果没有统计学差别，说明上述载玻片流淌法可以用于精液样品粘稠度正常与否的快速检查，并协助评价男性精子活力。更重要的是，使用专用的载玻片和一定倾斜角度的支架，配合简单易懂的说明书，就可以实现受试人案边自行操作，完成精液粘稠度评价，为不育症的进一步筛查提供参考。本发明的方法包括以下内容：首先进行样品和染料的准备1.按照世界卫生组织的建议获得精液样品2.载玻片：使用符合国家标准的医用检验载玻片，通过一定的方法处理，获得粗糙表面。在载玻片一端划上样品位置，垂直方向一定距离划上标志线3.倾斜支架：一个能够使载玻片保持一定倾斜的架子或者依靠物，保证倾斜角度在30～90度范围内4.计时器：能够精确到秒的计时器，手表或定时器。WHO推荐的方法判定精液样品粘稠度是否正常采用液化良好的精液样品，混合充分。按照世界卫生组织2011《人类精液检查与处理实验室手册》载录的滴管法或玻璃棒拉丝法，通过观察拉丝的长度判断精液样品的粘稠度正常与否。当拉丝长度小于2厘米时，即认为精液样品粘稠度正常，当拉丝长度超过2厘米时，即认为精液样品粘稠度异常(不正常)。载玻片流淌法精液样品粘稠度是否正常针对同一样品，将一滴精液样品滴在粗糙表面预先划定样品位置，将载玻片放置在倾斜支架上保持一定的倾斜度，开始计时，规定时间(如1min)后检查精液样品向下流淌的液体前沿是否超过载玻片上预先划定的标志线，如果超过，即认为精液样品粘稠度正常，如果没有超过，即认为精液样品粘稠度异常(不正常)。统计学分析将两种染色方法针对一定数量的同一批样品判定结果进行卡方检验(kappa检验)，分析两种方法获得的粘稠度正常与否的一致性是否具有统计学差异。P<0.05则说明两种方法在分析精液样品粘稠度正常与否方面一致，P≥0.05则说明两种方法在分析精液样品粘稠度正常与否方面不一致。因为滴管法或玻璃棒拉丝法是世界卫生组织推荐的标准方法，因此P<0.05时证明载玻片流淌法可以作为判定精液样品粘稠度正常与否的方法。结论液化好的精液样品能够在一定倾斜角度、一定粗糙度的表面依据重力方向向下流淌，粘稠度越低，规定时间流淌距离越远，粘稠度越高，流淌越慢，在规定时间流淌距离越近。载玻片流淌法判定精液样品粘稠度正常与否的结果与滴管法判定结果没有统计学差别，也与玻璃棒方法判定结果没有统计学差别，可以使用载玻片流淌法用于精液样品粘稠度正常与否的快速判定。而且，载玻片流淌法相比较于滴管法和玻璃棒方法中涉及的拉丝长度测量，简便准确，快捷高效。附图说明图1：载玻片精示意图，圆圈为样品位置，直线为标志线。图2：倾斜支架示意图，A面为水平，B面为倾斜面，支持良好，C面为水平面，B面和C面的夹角固定或可以调节。具体实施方式实施例一载玻片流淌法用于精液样品粘稠度正常与否-与滴管法比较材料与方法：1.获得人类精液样品采用的精液样品为志愿者提供，因此需要健康男性志愿者若干，按照下面的要求提供精液样品：1)样品为正常手淫射精的样品，不能为避孕套中获取2)样品的获得，必须严格控制在上次射精3～7天内3)精液样品直接收集进入专门提供的样品杯中，填上射精时间和志愿者编号，盖紧样品杯盖后，在规定的时间内送到实验室或指定地点4)一次射精后所有样品必须全部收集进样品杯中，不得有遗漏，也不得有任何非精液成份物质混入5)精液样品离开身体后应该在样品杯中完好保存，防止污染。注意：人类精液属于潜在生物危险物品，请按照国际组织和国家相关法律法规处置。建议贴身保温携带，温度过低或过高可能影响精液样品粘稠度判定结果6)确保精液样品已经液化良好：精液样品室温下会在半小时以内完成液化，因此建议精液离开身体后半小时以后开始试验。同时，精液样品不适宜室温长期保存，因此建议精液离开身体后最长24小时内完成试验。2.载玻片：河南顺达塑业有限公司提供的显微镜用载玻片(JB/T8230.3-1997)，通过化学蚀刻法获得Ra值为12.5μm左右的粗糙表面，在载玻片一端用彩色水笔划上直径为0.6cm的圆圈，作为样品位置，距离圆心垂直方向2cm处用彩色水笔划上一条细线。(如附图1)3.倾斜支架：中间镂空或者透明的金属或塑料支架，架子或者依靠物，能够承受载玻片斜靠，底层可预先铺上吸水纸，用以吸收流淌下来的精液样品。倾斜的角度为65°(如附图2，在A面铺上吸水纸，而B面和C面的夹角固定或者可以调节)4.计时器：能够精确到秒的计时器，手表或定时器。5.吸液管：临床上用以吸取血液等液体样品的直径约为1.5mm的广口径一次性塑料吸液管，另一端膨大，作为吸球6.直尺：精确到毫米的透明直尺精液样品液化精液样品离开身体后室温或近体温保存，30min后检查，确认已经液化良好(精液样品液化与否的判定，参照世界卫生组织2011《人类精液检查与处理实验室手册》载录的方法)。液化良好的样品在23小时内完成下述试验。吸液管法判定精液样品粘稠度正常与否将一次性塑料吸液管开放一端浸入液化良好的精液样品中，轻轻挤压另一端的膨大部分，将一些精液样品吸入塑料吸液管内，随后松手。在吸水纸或者废液缸的上方，再次轻轻挤压吸液管另一端的膨大部分，让一滴精液样品从吸液管开放口滴下，观察液滴拉丝情况，通过垂直立在附近的直尺，测量拉丝长度。如果拉丝长度超过2cm，视为精液样品粘稠度不正常(异常)，如果拉丝长度未超过2cm(小于等于)，视为精液样品粘稠度正常。如拉丝形成太快无法准确测量时，可重复滴液，重复测量，直到能够准确判定拉丝长度是否超过2cm。载玻片流淌法判定精液样品粘稠度正常与否将一次性塑料吸液管开放一端浸入液化良好的精液样品中，轻轻挤压另一端的膨大部分，将一些精液样品吸入塑料吸液管内，随后松手。在载玻片上方，再次轻轻挤压吸液管另一端的膨大部分，让一滴精液样品从吸液管开放口滴到载玻片上预先划上的样品圆圈内。将载玻片小心安放在倾斜支架上，样品点在上，标志线在下。立刻计时，1min后观察精液样品向下流淌的液体前沿是否超过载玻片上预先划定的标志线，如果超过，即认为精液样品粘稠度正常，如果没有超过，即认为精液样品粘稠度异常(不正常)。标记样品位置的圆圈上彩色水笔的颜料混入精液样品，不影响样品粘稠度正常与否的判定，反而增加了色彩对比，有利于是否越过标志线的判定。统计分析将两种判定方法针对同一组精液样品的判定结果进行统计分析，采用SAS统计分析软件(8.01版本)，行χ2检验之kappa检验，即一致性分析，根据χ2值计算P值，P≥0.05就可以认为两种方法在判定精液粘稠度正常与否方面有显著差异，P<0.05就可以认为两种方法在判定精液粘稠度与否方面没有差异，可以采用载玻片流淌法判定精液样品粘稠度正常与否。结果表1.两种方法判定样品粘稠度正常与否的结果汇总分析结果：Kappa＝0.708，ASE＝0.137，U＝5.188，P＝0.0001，说明针对这52个样品，载玻片流淌法判定结果与塑料吸管法判定结果的一致性相同。结论针对同一批精液样品，采用载玻片流淌法逐一判定其粘稠度正常与否，同时WHO推荐的塑料吸管法判定粘稠度正常与否，对两种判定结果进行一致性检验，结果显示两种方法在判定同一组精液样品粘稠度正常与否的结果一致性相同，可以采用载玻片流淌法判定精液样品粘稠度是否正常。实施例二载玻片流淌法用于精液样品粘稠度正常与否-与滴管法比较材料与方法：1.获得人类精液样品采用的精液样品为志愿者提供，因此需要健康男性志愿者若干，按照下面的要求提供精液样品：1)样品为正常手淫射精的样品，不能为避孕套中获取2)样品的获得，必须严格控制在上次射精3～7天内3)精液样品直接收集进入专门提供的样品杯中，填上射精时间和志愿者编号，盖紧样品杯盖后，在规定的时间内送到实验室或指定地点4)一次射精后所有样品必须全部收集进样品杯中，不得有遗漏，也不得有任何非精液成份物质混入5)精液样品离开身体后应该在样品杯中完好保存，防止污染。注意：人类精液属于潜在生物危险物品，请按照国际组织和国家相关法律法规处置。建议贴身保温携带，温度过低或过高可能影响精液样品粘稠度判定结果6)确保精液样品已经液化良好：精液样品室温下会在半小时以内完成液化，因此建议精液离开身体后半小时以后开始试验。同时，精液样品不适宜室温长期保存，因此建议精液离开身体后最长24小时内完成试验。2.载玻片：河南顺达塑业有限公司提供的显微镜用载玻片(JB/T8230.3-1997)，通过金刚砂打磨法获得Ra值为25μm左右的粗糙表面，在载玻片一端用彩色水笔划上直径为0.6cm的圆圈，作为样品位置，距离圆心垂直方向2cm处用彩色水笔划上一条细线。3.倾斜支架：中间镂空或者透明的金属或塑料支架，架子或者依靠物，能够承受载玻片斜靠，底层可预先铺上吸水纸，用以吸收流淌下来的精液样品，倾斜的角度为70°。4.计时器：能够精确到秒的计时器，手表或定时器。5.玻璃棒：实验室用以搅拌混匀的透明玻璃棒，直径3mm，一端经高温融化和冷却处理而变光滑，另一端不拘，高温消毒。6.直尺：精确到毫米的透明直尺精液样品液化精液样品离开身体后室温或近体温保存，30min后检查，确认已经液化良好(精液样品液化与否的判定，参照世界卫生组织2011《人类精液检查与处理实验室手册》载录的方法)。液化良好的样品在23小时内完成下述试验。玻璃棒法判定精液样品粘稠度正常与否将玻璃棒光滑一端浸入液化良好的精液样品中，轻轻挑起精液样品，观察玻璃棒下拉丝情况，通过垂直立在附近的直尺，测量拉丝长度。如果拉丝长度超过2cm，视为精液样品粘稠度不正常(异常)，如果拉丝长度未超过2cm(小于等于)，视为精液样品粘稠度正常。如拉丝形成太快无法准确测量时，可挑取，重复测量，直到能够准确判定拉丝长度是否超过2cm。载玻片流淌法判定精液样品粘稠度正常与否将一次性塑料吸液管开放一端浸入液化良好的精液样品中，轻轻挤压另一端的膨大部分，将一些精液样品吸入塑料吸液管内，随后松手。在载玻片上方，再次轻轻挤压吸液管另一端的膨大部分，让一滴精液样品从吸液管开放口滴到载玻片上预先划上的样品圆圈内。将载玻片小心安放在倾斜支架上，样品点在上，标志线在下。立刻计时，1min后观察精液样品向下流淌的液体前沿是否超过载玻片上预先划定的标志线，如果超过，即认为精液样品粘稠度正常，如果没有超过，即认为精液样品粘稠度异常(不正常)。标记样品位置的圆圈上彩色水笔的颜料混入精液样品，不影响样品粘稠度正常与否的判定，反而增加了色彩对比，有利于是否越过标志线的判定。统计分析将两种判定方法针对同一组精液样品的判定结果进行统计分析，采用SAS统计分析软件(8.01版本)，行χ2检验之kappa检验，即一致性分析，根据χ2值计算P值，P≥0.05就可以认为两种方法在判定精液粘稠度正常与否方面有显著差异，P<0.05就可以认为两种方法在判定精液粘稠度与否方面没有差异，可以采用载玻片流淌法判定精液样品粘稠度正常与否。结果表2.两种方法判定样品粘稠度正常与否的结果汇总分析结果：Kappa＝0.516，ASE＝0.172，U＝3.008，P＝0.00263，说明针对上述60个样品，载玻片流淌法判定结果与玻璃棒法判定结果的一致性相同。结论针对同一批精液样品，采用载玻片流淌法逐一判定其粘稠度正常与否，同时WHO推荐的玻璃棒法判定粘稠度正常与否，对两种判定结果进行一致性检验，结果显示两种方法在判定同一组精液样品粘稠度正常与否的结果一致性相同，可以采用载玻片流淌法判定精液样品粘稠度是否正常。