本发明涉及烟草中类黄酮类检测，具体是一种检测鲜烟叶中多种类黄酮代谢组学方法，包括芦丁、槲皮素、柚皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、异甘草素七种类黄酮化合物的同时定量检测，可用于植物类黄酮类物质代谢途径及基因功能研究。
背景技术：
类黄酮是一类重要的植物天然产物，在植物体内扮演诸多功能，比如色素，转运因子和信号分子等，同时在植物对抗生物和非生物胁迫时候起到重要作用。近年来，类黄酮受到越来越广泛的关注，其中一个原因是植物类黄酮提取物可以在体外起到重要的保健作用，比如降低心脏病和癌症等的风险。这些性质可能和类黄酮的抗氧化性相关。类黄酮是烟草中一类低分子量多酚类次生代谢物，与烟叶色泽及品质有关，可以保护烟草抵御外界的生物及非生物胁迫，在烟草生长发育过程中具有重要作用，同时还是烟草中一类重要香气前体物，其在烟叶调制过程中可以与烟叶中氨基酸或蛋白质通过棕色化反应形成棕色或褐色物质，影响烟叶外观品质，在烟叶醇化和燃烧过程中可以产生对烟草香气有直接影响的二元酚类醛类衍生物，提升烟叶香气品质。另外，由于类黄酮类物质的生物活性及烟草高生物学产量的特性，以烟草作为生物反应器生产具有生物活性的类黄酮药物是烟草未来的重要应用方向。国内外关于烟草类黄酮物质的分离、鉴定及检测取得了一定进展，但是仍然滞后于研究需求及生产实践。目前，尚缺乏对于烟草主要类黄酮物质进行全面检测分析的方法体系，目前针对烟草类黄酮的检测最常用的方法是比色法和色谱法，比色法用时少，成本低，但是由于烟草成分复杂，会有其他物质对比色结果相互干扰，所以结果准确度不高。目前国内外广泛开展的烟草基因组学及代谢组学研究需要对烟叶中多种类黄酮类物质进行精确检测，以期阐明烟草类黄酮物质的代谢规律及调控机制。因此，目前基础研究及生产实践都亟需建立烟草类黄酮类物质检测分析方法。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种具备准确且能够同时检测烟草鲜叶片内七种重要类黄酮（芦丁、槲皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、柚皮素、异甘草素）的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测鲜烟叶中多种类黄酮代谢组学方法，采用超声萃取法提取烟叶中的类黄酮成分，通过UPLC-QqQ-MS/MS实现新鲜烟叶中芦丁、槲皮素、柚皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、异甘草素的检测，具体步骤如下：（1）将新鲜烟叶冻干粉末，用浓度60%-90%甲醇混匀，20℃-30℃超声水浴20min；离心弃沉淀，经0.22μm有机膜过滤后储存备用，作为待测样品；新鲜烟叶冻干粉末与浓度80%甲醇的比例为质量体积比1∶50-100，单位g/ml。（2）配制上述七种物质的标准工作溶液；标准工作溶液为七种物质的混合标准溶液，其中芦丁的质量浓度为0.01,0.1,1,20,40,60,80,100,200,400mg/L，其他标准溶液浓度为0.01,0.1,1,20,40,60,80,100mg/L，其中200mg/l、400mg/l浓度的标准溶液只含芦丁和内标。（3）采用UPLC-QqQ-MS/MS对加入内标的标准工作溶液和加入内标的待测样品溶液进行检测，所述内标为木荆黄素；所述内标由萃取液甲醇配制，内标溶液的终浓度为12mg/mL。（4）色谱与质谱条件如下：色谱条件：色谱柱为zorbaxsb-c18column，规格为100mm×2.1mm×1.8m；流动相为A相为水/甲酸，体积比99.9:0.1；B相为乙腈/甲酸，体积比99.9:0.1；流速维持在0.3mL/min，柱温30℃，梯度洗脱：0～2.0min，5％B；2．0～10.0min，5％B→25％B；10.0～12.0min，25％B→95％B；12.0～15.0min，95％B，进样量3μL；质谱条件：氮气温度350℃，干燥气流速11L/min，毛细管电压3.0kV，雾化气压45psi.MRM模式下扫描的离子对分别是：芦丁m/z611.2→303.1、槲皮素m/z303.1→152.9、山奈酚苷m/z595.2→287.0、紫云英苷m/z449.1→287.0、柚皮苷m/z581.2→273.1、柚皮素m/z273.1→153.1、异甘草素m/z257.1→137.1、木荆黄素m/z433.1→313.1；（5）通过数据分析软件如MassHunterAgilent2003–2007DataAcquisitionforTripleQuadB.01.04(B84)software或其他功能类似软件分析原始数据。本发明相比现有技术的优点在于：准确度高，灵敏度高，重复性好，对七种类黄酮的检测限可低至0.14-4.05μg/L的水平，定量限可低至0.47-13.49μg/L，重复性的RSD%范围低至1.23-2.90%，日内紧密度的RSD%范围低至0.37-2.32%，日间紧密度的范围低至0.53-4.58%，稳定性测试的RSD%范围在0.27-4.9%。高，中，低三个水平的加标回收率良好，范围在85.5-109%之间。综上可见，本发明适用于植物中这七种类黄酮化合物的同时定量检测，可用于植物类黄酮类物质代谢途径及基因功能研究。附图说明图1.七种类黄酮和木荆黄素（内标）的MRM色谱图，图中：Rutin:芦丁，Quercetin:槲皮素，Kaempferol-3-rutinside:山奈酚苷，Kaempferol-glucopyranoside:紫云英苷，Naringin:柚皮苷，Naringenin:柚皮素，Isoliquiritigenin:异甘草素，Vitexin：木荆黄素。具体实施方式本发明以下结合具体实施例做进一步描述，但并不限制本发明内容。实施例包括标准曲线测定，方法的线性范围，检出限，定量限，转基因烟草及对照样品中七种类黄酮含量的测定一、主要实验材料，仪器与试剂：（1）植物材料：所用转基因烟草叶片材料取自于旺长期过表达查尔酮合成酶基因(CHS）的栽培烟草K326，由本实验室前期构建，验证并保存。CHS基因是类黄酮代谢途径中的第一个关键基因，过表达CHS基因可以提升植物体内类黄酮物质的含量。对照烟草叶片取自于旺长期普通K326烟草。取自转基因烟草的叶片分别命名为F1、F2、F3、F4，取自对照烟草的叶片分别命名为C1、C2、C3。（2）仪器：LC/MSQQQ6490液质联用系统（美国安捷伦公司），色谱柱为zorbaxsb-c18column，规格为100mm×2.1mm×1.8m（美国安捷伦公司）（3）试剂：类黄酮标准品（芦丁、槲皮素、山奈酚苷、紫云英苷、柚皮苷、柚皮素、异甘草素）和内标木荆黄素浓度均不小于98%，购自北京豫鼎鑫捷科技有限公司，乙腈，甲醇，乙醇，甲酸均为HPLC级，购自J.T.Baker。二、实验如下：（1）在本实施例中，用七种类黄酮标准品摸索并确定最佳的色谱和质谱条件。往待测样品中添加标准品，测定方法的检测限，定量限，重复性，精度，稳定性，回收率。（2）用已确立的方法检测转基因和对照样品，确定样品中的七种类黄酮的含量。三、实验方法：（1）样品中类黄酮的提取使用超声萃取法提取转基因烟叶F1、F2、F3、F4和对照烟叶C1、C2、C3中的类黄酮成分，分别将10-50mg新鲜烟叶冻干粉末，0.8-4mL80%甲醇混匀，30℃超声水浴20min。离心弃沉淀，经0.22μm有机膜过滤后储存备用。（2）色谱与质谱条件色谱条件：流动相为A相为水/甲酸（99.9:0.1体积比），B相为乙腈/甲酸（99.9:0.1体积比），流速维持在0.3mL/min，柱温30℃，梯度洗脱：0～2．0min，5％B；2．0～10．0min，5％B→25％B；10．0～12．0min，25％B→95％B；12．0～15．0min，95％B。进样量3μL。质谱条件：氮气温度350℃，干燥气流速11L/min，毛细管电压3.0kV，雾化气压45psi.MRM模式下扫描的离子对分别是：芦丁m/z611.2→303.1、槲皮素m/z303.1→152.9、山奈酚苷m/z595.2→287.0、紫云英苷m/z449.1→287.0、柚皮苷m/z581.2→273.1、柚皮素m/z273.1→153.1、异甘草素m/z257.1→137.1、木荆黄素（内标）m/z433.1→313.1.四、实验结果（1）标准曲线绘制,检测限，定量限用预先加入内标的萃取液配制得到各浓度的混合标准液，芦丁的质量浓度为0.01,0.1,1,20,40,60,80,100,200,400mg/L，其他标准溶液浓度为0.01,0.1,1,20,40,60,80,100mg/L。在所述色谱与质谱条件下测定，记录峰面积，绘制标准曲线。样品的检测限和定量限分别为信噪比的3倍和10倍。表1.七种类黄酮物质的标准曲线，检测限，定量限。（2）方法的精密度，重复性，和稳定性方法的精密度由日内精密度，日间精密度分别验证，RSD表示相对标准偏差。具体方法是对转基因样品T1中七种类黄酮进行检测，由T1烟叶制备类黄酮萃取溶液，分成六份，连续三天测定，每天检测两针。重复性和稳定性也有RSD表示，重复性由六份分别由T1烟叶制备的类黄酮萃取溶液测定，稳定性所用样品为同一份T1烟叶类黄酮萃取液，连续三天之内测定。表2.方法的重复性，精密度，稳定性。（3）方法的回收率为了验证方法的回收率，在高中低三个水平分别进行了加样回收实验（对叶片C1）。加入的物质随后被萃取并定量。高中低三个水平分别进行三个重复。表3.七种类黄酮在低中高三种水平的回收率（4）检测转基因和对照样品中的七种类黄酮含量取自转基因烟草的叶片分别命名为F1、F2、F3、F4，取自对照烟草的叶片分别命名为C1、C2、C3。按本实施例之前叙述的色谱和质谱方以及标准曲线测定并计算这些叶片中的七种类黄酮含量。表4.检测转基因烟草叶片F1、F2、F3、F4和对照转基因烟草叶片C1,C2,C3中的七种类黄酮含量（ND表示低于未检测出）