技术领域本发明涉及基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置及实现方法。
背景技术：
一种基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的检测方法便捷、精度高，非接触、非破坏性检测样品，可直接观察并采集微量样品的表面形貌与反射干涉信号。其中，反射干涉光谱频谱法不需要相干光源，使得其结构简单，抗干扰能力更强，可很好应用于微量样品的检测，反射干涉光谱成像技术更具有现实意义和实用价值。例如，在微生物学领域，反射干涉光谱成像系统通过检测微生物，对其种类和数量进行研究；在食品安全领域，通过对指标微生物监控可评估食品安全状况；在生态监测领域，用于监控生态环境中相关微生物菌群的变化。在材料领域，可直接观察并采集样品的表面形貌与反射、吸收、透射等光谱数据，可满足大多数生物、物理实验要求。因此，基于反射干涉光谱成像系统的光学传感检测装置在诸多领域都有着广泛应用，市场应用前景十分可观，已成为国内外的热门研究课题。目前，国内外有少数关于反射干涉光谱成像系统的装置及实现方法的相关报道。浙江大学邬建敏课题组采用多孔硅材料微流控系统的反射干涉光谱技术，实时检测微生物大肠杆菌(E.coil)的生长和新陈代谢，其缺点是多孔硅材料在水环境和相应的PH生理环境下不稳定和没有光学显微成像系统，不能准确定位测试的位置。澳大利亚，Dusanetal.以多孔氧化铝为基底材料，利用反射干涉频谱法检测循环肿瘤细胞，该装置利用光纤探头来检测生物芯片中光的反射干涉信号。该方法运用光纤探头探测样品获得干涉光谱信号，无法准确定位微小样品的测试位置及形貌特征。
技术实现要素：
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置及实现方法，可以原位、实时动态观察并采集由纳米孔阵列结构组成的微米通道内底部表面上样品的形貌及其反射干涉光谱。为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案：基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置，包括微流泵、微流控样品池系统、光学显微镜、C口光路切换器、CCD传感器、计算机、光谱仪和定位光源，其中，C口光路切换器连接光学显微镜，光学显微镜的物镜正对微流控样品池系统，C口光路切换器通过光纤分别与定位光源、CCD传感器和光谱仪连接，CCD传感器和光谱仪均与计算机连接。进一步地，所述微流泵的液体流速大于0.001ml/min。进一步地，所述微流控样品池系统为微纳复合结构，微米通道的宽、高范围均为：10μm～100μm。进一步地，所述微流控样品池系统为微纳复合结构，微米通道的底部由纳米孔阵列结构构成，单个纳米孔直径为20-180nm，纳米孔阵列厚度为2μm-10μm。进一步地，所述光学显微镜的物镜的放大倍数为5-100倍，数值孔径大于0.3。进一步地，所述探测光源为光强均匀分布的光源，功率为1-100W，波段为200nm-2800nm。进一步地，C口光路切换器的适用波段为200nm-2500nm，适用显微镜接口为C口。进一步地，CCD传感器采用携带变焦镜头的高分辨率CCD相机，其变焦镜头焦距范围为12-36mm，像素数大于1024×1024，像元尺寸小于5.2μm×5.2μm。进一步地，光谱仪的波段为200-2800nm，信噪比为大于等于1000:1。基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置进行反射干涉光谱成像的实现方法，具体包括以下步骤：步骤一，微流控样品池系统固定在光学显微镜的载物台上，微流泵将样品定量注射在微流控样品池系统中；步骤二，探测光源发出的光线经过光学显微镜的物镜照射到微流控样品池系统中的样品上，样品反射干涉光汇集到物镜上，并依次经过光学显微镜和C口光路切换器；步骤三，经过C口光路切换器的反射干涉光分成两束光，一束光经由CCD传感器进行单元阵列图像采集，采集到的信息经由光纤传递到计算机中，另一束光经由光谱仪转换得到强度-波长的光谱信号，强度-波长的光谱信号经由光纤传递到计算机中，通过软件系统分析得到反射干涉谱图；步骤四，定位光源发出的光线经过C口光路切换器和光学显微镜的物镜照射到样品上，样品反射干涉光汇聚在物镜上，汇聚的样品反射干涉光经过C口光路切换器，经由CCD传感器进行单元阵列图像采集，采集到的信息经由光纤传递到计算机中，通过计算机显示成像；实现样品的反射干涉检测和形貌成像。与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：1、本发明中设计有微流泵，能够对微量进样进行定量控制，从而实现了动态检测。2、本发明中使用显微镜的物镜作为光学探头，与现有技术中采用探头的手段相比，不需要设置用于固定探头的固定装置，为显微镜连接成像定位系统提供了可能，提高系统光路集成化程度。3、本发明中，光干涉光谱系统光路与成像定位系统光路两者共用一个显微镜光路，实现了样品的光谱采集与成像的实时、原位探测，增加的成像定位系统可清晰地观察所测样品的形貌特征。4、本发明中增加了成像定位系统，能够确定样品的具体位置，使检测结果更加精确；并实现了样品的形貌特征成像与反射干涉光谱采集的实时切换和实时检测。5、本发明中采用了C口切换器，C口光路切换器通过光纤分别与定位光源、CCD传感器和光谱仪连接，能够实现光谱采集与成像定位的同步进行。综上，本发明实现了样品的形貌特征成像与反射干涉光谱采集的实时切换和原位、实时动态检测，获取的微弱信号光学信息全面，同时，本发明的检测过程便捷、快速，精度高。附图说明图1为本发明的整体结构示意图；图2为微流控样品池系统中微通道内底部多孔纳米氧化铝基底的扫描电镜形貌图，(a)为表面形貌图；(b)为截面图；图3为微流控样品池系统探测固化在纳米多孔壁上的单链DNA分子的反射干涉光谱图，(a)反射干涉光谱图，(b)快速傅里叶变换图谱；图4为微流控样品池系统探测探针单链DNA分子与具有单碱基错配和三碱基错配的互补DNA序列杂化的反射干涉光谱图，(a)反射干涉图谱，(b)快速傅里叶变换图谱。图中标号代表：1—微流泵，2—微流控样品池系统，3—物镜，4—光学显微镜，5—C口光路切换器，6—CCD传感器，7—计算机，8—光谱仪，9—定位光源。下面结合附图和实施例对本发明的方案做进一步详细地解释和说明。具体实施方式遵从上述技术方案，参见图1，本发明的基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置，包括微流泵1、微流控样品池系统2、光学显微镜4、C口光路切换器5、CCD传感器6、计算机7、光谱仪8、定位光源9，其中，C口光路切换器5连接光学显微镜4，光学显微镜4的物镜3正对微流控样品池系统2，C口光路切换器5通过光纤分别与定位光源9、CCD传感器6和光谱仪8连接，CCD传感器6和光谱仪8均与计算机7连接。检测数据由计算机软件统一采集并分析本发明的装置工作原理为：显微镜反射装置内置的探测光源发出的光线通过光纤经过光学显微镜4的物镜3照射在微流控样品池系统2的样品上；样品反射干涉光汇聚到物镜3上，汇聚的样品反射干涉光依次经过光学显微镜4和C口光路切换器5；经过C口光路切换器5的反射干涉光分成两束光，一束光经由CCD传感器6进行单元阵列图像采集，采集信息经由光纤传递到计算机中由计算机相应成像软件进行成像；另一束光经由光谱仪8转换得到强度-波长的光谱信号，强度-波长的光谱信号经由光纤传递到计算机7中由计算机相应光谱软件系统进行数据采集分析。用于成像定位的参考光路，由定位光源9发出的光经由光纤传送到C口光路切换器5，经过光学显微镜4的物镜3照射在样品上；样品反射干涉光汇聚在物镜3上，汇聚的样品反射干涉光经过光学显微镜4的物镜3和C口光路切换器5，经由CCD传感器6进行单元阵列图像采集，采集到的信息经由光纤传递到计算机7中，通过计算机相应成像软件进行样品成像。本发明的装置设置微流泵1，能够对微量进样进行定量控制，从而实现了动态检测；本发明的装置中使用显微镜的物镜作为光学探头，与现有技术中采用探头的手段相比，不需要设置用于固定探头的固定装置，为显微镜连接成像定位系统提供了可能，使得光路集成化程度较高；本发明中，光干涉光谱系统和成像定位系统的光路共用一个显微镜光路，实现了样品的光谱采集与成像的原位、动态实时的探测；增加的成像定位系统可清晰地观察所测样品的形貌特征，实现样品的形貌特征成像与反射干涉光谱采集实时切换和原位、动态实时检测。所述微流泵1，液体流速为0.004ml/min；所用配件为塑料纳米拧紧配件，所用管子为PEEK管子1/16OD。所述微流控样品池系统2为微纳复合结构，微米通道的宽、高范围均为：10μm～100μm。微米通道的底部由纳米孔阵列结构构成，单个纳米孔直径为20-180nm，纳米孔阵列厚度为2μm-10μm。微米结构为小于25μm×10μm×15μm，纳米结构直径为小于等于50nm，厚度为大于8um。所述光学显微镜4的物镜3的放大倍数为10倍，数值孔径0.7；所述探测光源为均匀光源卤素灯，功率为100W，波段：350～1100nm。为了保证光谱采集与成像定位能够同步进行，C口光路切换器5(50％-50％)的适用波段为200nm～2500nm，适用显微镜接口为C口。CCD传感器6采用携带变焦镜头的高分辨率CCD相机，其变焦镜头焦距范围为12～36mm，像素数大于1024×1024，像元尺寸小于5.2μm×5.2μm。光谱仪8为制冷型面阵背照式光谱仪，采集来自样品的光信号，将光干涉信号转换成强度-波长的光谱信号。光谱仪的波段为325～1100nm，信噪比为1000:1。为了确定测试样品的具体位置，使得检测结果更加精确，定位光源9为HL2000卤素光源，波段范围为350～2500nm，色温为2915K。本发明的应用所述的基于微流控反射干涉光谱成像系统的装置进行反射干涉光谱成像的实现方法，具体包括以下步骤：步骤一，微流控样品池系统2固定在光学显微镜4的载物台上，微流泵1将样品定量注射在微流控样品池系统2中。步骤二，光学显微镜的反射装置内置的探测光源发出的光经过光学显微镜4的物镜3照射到微流控样品池系统2中的样品上，样品反射干涉光汇聚到物镜3上，并依次经过光学显微镜4和C口光路切换器5。步骤三，经过C口光路切换器5的反射干涉光分成两束光，一束光经由CCD传感器6进行单元阵列图像采集，采集到的信息经由光纤传递到计算机中由相应的软件系统对样品进行成像，另一束光经由光谱仪8转换得到强度-波长的光谱信号，强度-波长的光谱信号经由光纤传递到计算机7中由计算机相应的软件系统进行数据采集和分析。步骤四，定位光源9发出的光经过C口光路切换器5和光学显微镜4的物镜3照射到样品上，样品反射干涉光汇聚在物镜3上，汇聚的样品反射干涉光经过C口光路切换器5，经由CCD传感器6进行单元阵列图像采集，采集到的信息经由光纤传递到计算机7中，通过计算机7显示成像；至此实现样品的反射干涉和成像。本发明的反射干涉光谱成像的实现方法，能够准确定位样品的具体位置，提高检测精度；实现样品的形貌特征成像与反射干涉光谱数据采集的实时切换和原位、动态实时检测。实施例：以下给出基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置及实现方法的实施例。本实施例中，基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置包括微流泵1、微流控样品池系统2、光学显微镜4、C口光路切换器5、CCD传感器6、计算机7、光谱仪8、定位光源9和探测光源。微流泵，流速范围0.004ml/min；微流控样品池系统2为微纳结构，微米结构为25μmx10μmx15μm,纳米结构直径为50nm,厚度为8um；光学显微镜4的物镜3的放大倍数为10倍，数值孔径0.70；光学显微镜4的探测光源为均匀光源卤素灯，功率为100W,波段：350～1100nm；C口光路切换器5(50％-50％)的适用波段为200nm～2500nm；适用显微镜接口为C口；CCD传感器6采用携带变焦镜头的高分辨率CCD相机，其变焦镜头焦距范围为12～36mm，像素数1024×1024，像元尺寸5.2μm×5.2μm；光谱仪8用于测试样品，制冷型面阵背照式光谱仪采集来自样品的光信号，将光干涉信号转换成强度-波长的光谱信号。其中光谱仪的波段：325～1100nm；信噪比为1000:1；定位光源9用于探测光探测样品的具体位置，光源为HL2000卤素光源，波段范围：350～2500nm；色温：2915K。本实施例的光学干涉的实现方法，具体包括以下步骤：步骤一，采用直径为50nm,厚度为8μm的多孔纳米阳极氧化铝的纳米结构和25μmx10μmx15μmPMMA通过阳极键结合作为微流控样品池系统2。样品单链DNA由移液枪进入微流控样品池系统2中并固定在池中作为探针，微流泵1以0.004ml/min的速度定量的将样品互补DNA进入微流控样品池系统2；步骤二，探测光源为1000W的卤素灯，出射光经过光学显微镜4的反射光路，通过放大倍数为10倍且数值孔径0.70的物镜3，照射在厚度约为8μm的纳米多孔氧化铝样品上；样品反射干涉光汇聚在物镜3上，汇聚的光经过光学显微镜4和C口光路切换器5(50％-50％)；步骤三，汇聚的光经过C口光路切换器5分成两束光，一束光经由像素数大于1024×1024的CCD传感器6转换后，经由光纤将采集到的图像信息传递给计算机7；另一束光经由波段范围为360～2500nm，芯径为600μm，长度为2.0m的微区光纤传递到光谱仪8内，光在光谱仪8内转换后由光纤将信息传递给计算机7；步骤四，由功率为1000W的卤素灯定位光源9经由C口光路切换器5和光学显微镜4的物镜3照射在样品上；样品反射干涉光汇聚在物镜3上，汇聚的样品反射干涉光经过C口光路切换器5，经由CCD传感器6转换后传递到计算机7中，在计算机7中显示成像；至此实现基于反射干涉光谱成像系统的样品的反射干涉谱图和成像。实验分析：图2为本发明的装置获取上述实施例的微流控样品池系统的多孔纳米阳极氧化铝基底的扫描电镜(SEM)表面形貌图和截面图。图3为微流控样品池系统探测固化在纳米多孔孔壁上的单链DNA分子反射干涉光谱图，通过光谱识别后的反射干涉光谱图，通过快速傅里叶变换(FFT)数据处理后的FFT图谱，其中，峰值横坐标对应有效光学厚度(EOT)图谱来探测在微流控样品池系统中，样品单链DNA的固化状况；图3中的(a)图和(b)图，线段按照峰值由高到低分别表示AAO+Au和probeDNA。图3中的(a)图是基底与探针DNA分子的原位反射干涉光谱(RIFS)图，由RIFS的原理法布里-珀罗方程mλ＝2nL，有效光学厚度OTeff＝nL，随着DNA分子固化在基底孔壁上，随着折射率n和L的变化，导致DNA探针分子的RIFS相对于基底材料向右移动，为了增加RIFS的信噪比和辨识度，采用快速傅里叶变化(FFT)，能够更加直观的观察随着DNA等生物分子进入纳米材料，引起光学干涉(OTeff)的变化，参见图3中的图(b)。图4为本发明装置获取上述实施例的探针DNA与具有三碱基错配和单碱基错配的互补DNA序列杂化后探测的反射干涉光谱图，和通过快速傅里叶变换(FFT)数据处理后的FFT谱图，其中，峰值横坐标对应有效光学厚度(EOT)图谱来探测在微流控样品池系统中DNA分子之间相互作用的检测；图4中的(a)图和(b)图中，线段按照峰值由高到低分别表示compDNA、MMC和MM3C。图4是探针DNA用于实际的检测中，用探针DNA分子捕获互补的DNA分子，以及具有三碱基错配和单碱基错配的互补DNA单链。从(b)图中我们发现不同碱基错配会引起不同变化，以此说明RIFS技术的可行性、灵敏性和特异性。