一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法与流程

本发明属于药物检测分析领域，具体涉及一种检测血样中羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法。

背景技术：
:

红花是菊科植物红花Carthamustinctorius L.的干燥花。红花黄色素(SY)存在于红花的水溶性提取部位，被认为是红花的主要效应物质，其中羟基红花黄色素A(HSYA)含量较高，是发挥药理作用的有效单体成分，具有抑制二磷酸腺苷(ADP)或胶原诱导的血小板聚集作用，有防止血栓的形成和发展或促进血栓溶解作用。

谷红注射液(国药准字H22026638)为乙酰谷酰胺和红花提取物制成的灭菌水溶液，是临床常用的中西结合制剂，具有活血化瘀，通脉舒络功效，临床用于瘀血闭阻所致的胸痹、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性脑病、脑血栓及肺心病所致血瘀诸证。

药物进入生物体内经历吸收、分布、生物转化和排泄等过程。药物被机体吸收后，在机体作用下，通过氧化、还原、水解(Ⅰ相代谢)和结合(Ⅱ相代谢)代谢反应，发生化学结构转化，药物对机体作用的结果是机体反应的表现即药效，

目前对谷红注射液、红花等的体内研究，主要选择代表成分羟基红花黄色素A(HSYA)在体内的药物浓度的动态变化，绘制药时浓度曲线，开展体内药物代谢研究，但均没有对药物进入体内后的代谢产物及途径开展深入研究。了解羟基红花黄色素A的代谢产物和途径对于羟基红花黄色素A的临床运用具有重要意义。

技术实现要素：
:

本发明的目的是提供一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法，具体采用“杆-阱”扫描IDA工作模式在一针进样中同时完成谷红注射液的代谢物的检测方法。

pMRM-IDA-EPI是检测目标性低含量代谢物最灵敏有效的方式，可同时定性定量，可以选择性的全面覆盖具有特征碎裂规律化合物的代谢转化形式。MIM-IDA-EPI可以对高含量的代谢物，不符合经典碎裂规律的代谢物进行高通量的筛查。LightSight TM软件可以辅助建立多种灵活的IDA方法，简化数据处理。

本发明采用的技术方案如下：

一种羟基红花黄色素A代谢物产物的检测方法，

所述方法包括以下步骤：

(1)取谷红注射液静脉注射SD大鼠，注射量为10～15mg/kg，在5min～8h内眼眶采血，血样置肝素化离心管中，离心分离血浆；

(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆，加入乙腈，血浆与乙腈的体积比为1：3～3.5；涡旋混匀后离心，取上清液氮气吹干，再用乙腈溶解，离心，取上清作为样品待测；

(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：

a、色谱条件：Shimadzu 20ADXR

流动相A:2mM乙酸铵的水溶液

流动相B:乙腈、水体积比90:10，含2mM乙酸铵

色谱柱及洗脱方式：PoroShell 120EC-C18色谱柱

梯度洗脱程序如下表1：

表1

梯度洗脱中，流动相A和流动相B的体积分数之和为100％

b、质谱条件：AB SCIEX Qtrap 4500

ESI Negative Mode负离子模式

气帘气CUR:25psi

喷雾电压IS:5500V

离子源温度TEM:575℃

雾化气GS1:60psi

辅助加热气GS2:60psi

碰撞气CAD:Medium

(4)采用p-MRM-IDA-EPI模式来分析代谢产物，其中MRM扫描的IDA阈值为1000cps，EPI扫描速率为10000amu/s，CE为-45eV，DP为-60V，驻留时间10ms；MRM离子对根据羟基红花黄色素A的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子。

进一步，所述步骤(3)中，PoroShell 120EC-C18色谱柱的尺寸为4.6mm×150mm，填料粒径2.7μm。

所述步骤(3)中，高效液相色谱的柱温优选40℃，流速优选0.4mL/min。所述步骤(1)中，谷红注射液静脉的注射量优选为12mg/kg。

所述步骤(1)中，离心分离血浆优选在4℃下5000r·min^-1离心10min，分离得到血浆。

所述步骤(2)优选按以下方法操作：微量加样器吸取血浆，加入乙腈，血浆与乙腈的体积比为1：3；涡旋混匀后，6000r/min离心10min，取上清液氮气吹干，再用乙腈溶解，10000r/min离心，取上清作为样品待测。

所述步骤(2)更优选按以下方法操作：微量加样器吸取血浆0.3mL，置于1.5mL离心试管中，准确加入0.9mL乙腈，涡旋混匀2min，6000r/min离心10min，取上清0.6mL，氮气吹干，再用0.3mL乙腈溶解，10000r/min离心，取上清作为样品待测。

所述步骤(3)中，所述高效液相色谱的进样量为5.0μL。

更具体的，优选本发明方法按以下步骤操作：

(1)取谷红注射液静脉注射SD大鼠，注射量为12mg/kg，分别在5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h时间点眼眶采血0.5mL，血样置肝素化离心管中，4℃下5000r·min^-1离心10min，分离血浆，-80℃下冰箱冰冻保存待分析；

(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆0.3mL，置于1.5mL离心试管中，准确加入0.9mL乙腈，涡旋混匀2min，6000r/min离心10min，取上清0.6mL，氮气吹干，再用0.3mL乙腈溶解，10000r/min离心，取上清作为样品待测；

(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：

a、色谱条件：Shimadzu 20ADXR

柱温:40℃

流速:0.4mL/min

流动相A:2mM乙酸铵的水溶液

流动相B:乙腈、水体积比90:10，含2mM乙酸铵

色谱柱及洗脱方式：PoroShell 120EC-C18色谱柱(4.6mm×150mm，2.7μm)

梯度洗脱程序如下表1

表1

梯度洗脱中，流动相A和流动相B的体积分数之和为100％

b、质谱条件：AB SCIEX Qtrap 4500

ESI Negative Mode负离子模式

气帘气CUR:25psi

喷雾电压IS:5500V

离子源温度TEM:575℃

雾化气GS1:60psi

辅助加热气GS2:60psi

碰撞气CAD:Medium

(4)采用p-MRM-IDA-EPI模式来分析代谢产物，其中MRM扫描的IDA阈值为1000cps，EPI扫描速率为10000amu/s，CE为-45eV，DP为-60V，驻留时间10ms；MRM离子对根据羟基红花黄色素A的结构及在体内可能发生的化学反应，预测其代谢产物的母离子及碎片离子。

在负离子模式下，根据母药二级碎裂的特点，质谱采用p-MRM方法检测。

具体的，所述p-MRM-IDA-EPI模式的操作方式是：利用母药的母离子及其特征性的碎片子离子的质荷比，理论预测并创建代谢物的MRM离子对，仪器及软件根据方法设定参数自动进行采集，进行扫描检测，过程包括以pMRM(预测性多元反应监测)作为预扫描，设置相应的IDA Criteria Level1(IDA一级标准)进行评估，以触发增强型子离子扫描(EPI)。采集当前MRM通道母离子的二级谱图，以及根据当前化合物的强度，以及当前化合物是否在出峰(DBS,动态背景扣除功能)判断，软件自己决定是否要切换到EPI模式。根据软件两个列表，即Include list和Exclude list.这两个表规定哪些母离子出现是必须采集EPI谱的，而另一些即使符合IDA判据也不会去采集EPI谱图。

通过以上p-MRM方法，可以得到目标下这些离子对是否出峰，如果出峰则可能是潜在的代谢物，而EPI谱图可以帮助判断这些潜在代谢物的真伪与可能结构。将这些数据导入软件，软件可以通过给定的生物转化模式自动创建代谢物的MRM离子对，自动帮助判断哪些峰是代谢物。

采用MRM-IDA-EPI模式分别测定样品待测液和空白对照组，针对预设定的每一组离子对，对比分析样品待测液和空白对照组的MRM提取离子流色谱图的差异性，对代谢产物的准分子离子、保留时间和提取离子对进行分析，找出羟基红花黄色素A的可能的代谢产物，同时结合MS²的EPI质谱图，对其碎片离子进行质谱分析，最后再根据羟基红花黄色素A的分子结构推测代谢产物的结构。

本发明属于药物检测分析领域，通过质谱采用p-MRM方法结合软件快速鉴定分析血样中多个羟基红花黄色素A代谢物产物的结构及代谢途径，比目前采用化学结构分析手段更快速、更灵敏。

为对谷红注射液、红花等药物体内的成分变化、结构改变等进行深入分析，我们采用液质联用仪LC-MS(AB 4500质谱仪、Shimadzu 20ADXR液相色谱仪)，并采用p-MRM方法检测，软件分析，开展了SD大鼠静脉注射谷红注射液后，血浆中各个成分变化及结构改变等代谢变化跟踪，结果发现羟基红花黄色素A代谢产物11个，完成了羟基红花黄色素A及11个代谢产物在血浆中的时间变化曲线图，并成功推断鉴定了其中羟基红花黄色素A的7个代谢产物及同分异构体的分子结构。

Qtrap系列仪器结合软件实现了一机多用，高质量和独特的“杆-阱”扫描的IDA工作模式可在一针进样中完成代谢物的发现和确证，并可以同时进行定性定量工作。采用Qtrap 4500pMRM扫描方式，检测出11种羟基红花黄色素A谢产物，并触发收集EPI谱图而推导了其代谢物结构信息。

附图说明

图1：羟基红花黄色素A在质谱负离子模式下得到的二级谱图。

图2：羟基红花黄色素A在负离子模式下的可能碎裂规律示意图。

图3：LightSight软件分析样品羟基红花黄色素A中氧化代谢物的工作界面图。

图4：LightSight软件分析样品羟基红花黄色素A中Ox-2H代谢物的分析界面图。

图5：推测样品羟基红花黄色素A中Ox-2H代谢物的示意图。

图6：母药羟基红花黄色素A与11种主要代谢物在血浆中的时间变化曲线图。

图7：羟基红花黄色素A的代谢物：异构体、M1-M3、M7-M10可能结构式。

图8：羟基红花黄色素A的三种脱水代谢物M4-M6同分异构体的可能结构式。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案、积极效果更加清楚明白，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下对于具体实施方案的描述仅用于解释本发明，并不限定本发明。

实施例一：

一、仪器条件：液质联用仪LC-MS

配置：1.质谱仪：AB 4500

2.液相色谱仪：Shimadzu LC-20ADXR

二、样品信息

“谷红注射液”静脉注射SD大鼠(约200g/只)，注射量为12mg/kg。分别在5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h时间点眼眶采血0.5mL，血样置肝素化离心管中，4℃下5000r·min^-1离心10min，分离血浆，-80℃下冰箱冰冻保存待分析。

血样处理方法：微量加样器吸取血浆0.3mL，置于1.5mL离心试管中，准确加入0.9mL乙腈，涡旋混匀2min，6000r/min离心10min，取上清0.6mL，氮气吹干，0.3mL乙腈溶解，10000r/min离心，取上清待测。

三、分析条件

1、质谱条件：AB SCIEX Qtrap 4500

ESI Negative Mode负离子模式

气帘气CUR:25psi

喷雾电压IS:5500V

离子源温度TEM:575℃

雾化气GS1:60psi

辅助加热气GS2:60psi

碰撞气CAD:Medium

2、色谱条件：Shimadzu 20ADXR

柱温:40℃

流速:0.4mL/min

流动相A:水(含2mM乙酸铵)

流动相B:乙腈(含10％水，2mM乙酸铵)

色谱柱及洗脱方式：PoroShell 120EC-C18色谱柱(4.6mm×150mm，2.7μm)

梯度洗脱

四、分析方法

在负离子模式下，根据母药二级碎裂的特点，质谱采用p-MRM方法检测。利用母离子及其特征性的碎片子离子的质荷比，理论预测并创建代谢物的MRM离子对，仪器及软件根据方法设定参数自动进行采集，进行扫描检测，包括pMRM(预测性多元反应监测)，IDA Criteria Level1(IDA一级标准)进行评估，扫描EPI(增强型产物离子)等过程。

采集当前MRM通道母离子的二级谱图，及主要根据当前化合物的强度，以及当前化合物是否在出峰(DBS,动态背景扣除功能)判断，软件自己决定是否要切换到EPI模式。根据软件两个列表，即Include list和Exclude list.这两个表规定哪些母离子出现是必须采集EPI谱的，而另一些即使符合IDA判据也不会去采集EPI谱图。

通过以上p-MRM方法，可以得到目标下这些离子对是否出峰，如果出峰则可能是潜在的代谢物，而EPI谱图可以帮助判断这些潜在代谢物的真伪与可能结构。将这些数据导入软件，软件可以通过给定的生物转化模式自动创建代谢物的MRM离子对，自动帮助判断哪些峰是代谢物。

1、羟基红花黄色素A在质谱负离子模式下得到的二级谱图如图1所示，并开展碎裂规律分析其碎片断裂情况，指出相关碎片离子。

羟基红花黄色素A在负离子模式下的可能碎裂规律示意图如图2所示。

2、图3为LightSight软件分析样品羟基红花黄色素A中氧化代谢物的工作界面图：在一个工作区，软件自动关联MS和MS/MS，对pMRM方法得到的数据进行快速浏览，对代谢物与母药MS/MS图谱进行比较，进行代谢物结构鉴定，软件自动分析。图4为LightSight软件分析样品羟基红花黄色素A中Ox-2H代谢物的分析界面图。

图5为推测样品羟基红花黄色素A中Ox-2H代谢物的示意图。

3、采用p-MRM方法结合中性丢失分析方式，根据软件分析及推测共发现羟基红花黄色素A代谢产物11个，包括异构体1个和M1-M10的代谢产物，如下表2所示。

表2:检测到的潜在代谢物结果列表

4、结合代谢产物的结构，开展了母药羟基红花黄色素A与监测到的11种主要代谢物在血浆中的时间变化曲线。

分别在5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h不同时间点采集的血样，采用Shimadzu 20ADXR液相色谱、AB SCIEX Qtrap 4500质谱联用仪开展对母药及各代谢产物开展定量分析，测定不同时间点的血药浓度，绘制时间变化曲线图，如图6所示。

5、根据结构断裂规律，软件分析推断羟基红花黄色素A代谢物的可能结构式如图7所示。其中的M4、M5、M6为脱水的同分异构体，可能结构式如图8所示的，需要进一步通过其他仪器分析来分别确定各异构体的结构。