本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种肉制品中磺胺类药物残留的测定方法，尤其是基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法。
现有技术
现有磺胺类药物残留检测的样品前处理仅对特定基质，适用范围较窄，测定种类有限，而且很多前处理方法操作繁琐，需要大量有毒有害的试剂，耗费大量的前处理时间。
现有技术一般采用液相或液质联用法技术居多，选用乙酸乙酯、甲醇、乙腈、高氯酸等溶剂进行提取之后，用C18、HLB、MCX等固相萃取柱进行净化，前处理较为繁琐，样品前处理周期长，受人工技术影响大。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法。它要解决传统分析技术多种磺胺类药物操作繁琐的前处理方法、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证以及多种磺胺类药物同时分析时很难满足待测药物均取得很好的定性定量效果的问题。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.1mL 1.0mg/mL的各磺胺类药物储备液至10mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1 mL混合液至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容，制成1 mg/L的混合标准品工作溶液，于4℃下保存备用；
2）同位素内标工作溶液的配制：精密移取0.1 mL 1.0mg/mL的内标储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取0.1 mL定容的容量瓶中内标储备液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得20 ng/mL的内标工作溶液，于4℃下保存备用；
3）样品溶液的制备：取待测肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入步骤2）得到的同位素内标工作溶液和复合溶剂，高速匀浆1-3 min，于3500-4500 r/min离心4-6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得样品溶液备用；
4）线性溶液的制备：称取不含磺胺类药物的肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入复合溶剂，高速匀浆1-3 min，于3500-4500 r/min离心4-6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得空白基质溶液，精密吸取不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液和相同量的步骤2）制得的同位素内标工作溶液，由空白基质溶液稀释得到各磺胺药物浓度分别为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL，内标浓度均为2 ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；
5）空白溶液的制备：取不含磺胺类药物的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入步骤2）得到的同位素内标工作溶液和复合溶剂，高速匀浆1-3 min，于3500-4500 r/min离心4-6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得空白溶液，供色谱测定；
6）加标回收试验样品溶液的制备：取不含磺胺类药物的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1）制得的的混合标准品工作溶液，获得检出限为1ng/mL、定量限为2ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入100µL步骤2）制得的同位素内标工作溶液，精密加入15-25 mL复合溶剂，高速匀浆1-3 min，于3500-4500 r/min离心4-6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得加标回收试验样品溶液，供色谱测定；
7）用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液
a 测定：进样过程：由进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；
b 曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
以线性溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积定量，得到曲线方程A=aC+b，
式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积比内标化合物峰面积比；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；
c 结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一磺胺类药物的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该磺胺类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C=(A-b)/a
式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积；
a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120%，证明该检测方法可行。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于各磺胺类药物包括磺胺二甲基异嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺苯甲酰、磺胺二甲氧嘧啶及磺胺甲基异恶唑。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于步骤2）中的内标为磺胺甲基嘧啶-13C6。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于步骤3）中的复合溶剂为0.1%甲酸80%乙腈水溶液。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于步骤3）中的样品溶液用0.22 μm的滤膜过滤。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于溶液制备时，高速匀浆2 min，于4000 r/min离心5 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用0.75mL10%甲醇水溶液复溶。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现磺胺类药物残留的在线净化。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于色谱条件如下：
1）一维液相条件：
色谱柱：Agilent Bio SEC-5 5μm，150Å，4.6×150mm，
流动相：磷酸盐缓冲液(pH7.4)，等度洗脱，
磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L 氢氧化钠溶液79mL，用水稀释至200mL得到，
流速：0.35mL/min，富集柱：XBridge C8 Direct Connect HP 10μm；
2）二维液相条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1×50 mm，1.7μm，
流动相：A相：0.1 %甲酸水，B：0.1 %甲酸甲醇，梯度洗脱，
柱温：25 ℃，进样量：5 μL，
3）质谱条件：
质谱仪：三重四级杆串联质谱仪，离子源：电喷雾离子源，
扫描方式：正离子扫描，检测方式：多反应监测，
脱溶剂温度(℃)：500，源温度(℃)：150，
脱溶剂流速(L/hr)：800，锥孔流速(L/hr)：150。
所述的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于进样分析具体过程如下：在四元泵的作用下，由自动进样器向一维色谱柱进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，左切换阀和右切换阀在0-5.2min均保持初始状态，即左切换阀2号位和3号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀2号位与3号位相通，切至废液池的状态；在5.2-11.2min左切换阀切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱中进行富集，在11.2min左切换阀切换至位置2，二元泵将富集柱上的目标化合物反冲至二维色谱柱上进行分离，右切换阀位置不变，利用二元泵流动相将富集柱上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在16.2min时右切换阀切换至位置1，即2号位与1号位相通，进入质谱检测器进行分析。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明的基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，通过采用复合溶剂对肉制品中的残留磺胺类药物进行有效提取，大大简化前处理方式，通过采用三柱二维液质联用法，利用在线柱切换液相-质谱联用技术，实现磺胺类药物残留的在线净化目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，解决了传统分析技术多种磺胺类药物操作繁琐的前处理方法、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证以及多种磺胺类药物同时分析时很难满足待测药物均取得很好的定性定量效果的问题，同时由于采用水相凝胶色谱，其流动相是水，因此也实现磺胺类药物残留检测的绿色环保；
2）本发明通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析。通过在线柱切换液相-质谱联用技术实现磺胺类药物残留的在线净化目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，同时由于采用水相凝胶色谱，其流动相是水，因此也实现磺胺类药物残留检测的绿色环保；
3）本发明通过将凝胶色谱应用于磺胺类药物残留的检测，建立了一个全新的快速的磺胺类药物残留的检测方法，可有效监测和应对相应多种磺胺类药物残留的食品安全突发事件，避免和降低多种磺胺类药物残留食品安全风险带来的危害。同时，作为一种新的快速检测技术，不仅减少了有毒有害化学试剂的接触，降低了实验的成本，也有利于实验人员的自身健康和安全，达到绿色检测的目的，通过针对多种磺胺类药物残留检测的二维液质联用法的项目研究，能提升兽药残留的检测能力，为政府行政部门的分析决策提供先进技术支撑。
附图说明
图1为本发明的三柱二维液质联用工作原理图；
图2为对照品（20ng/mL）典型色谱图：
图中：1-四元泵，2-自动进样器，3-一维色谱柱，4-紫外检测器，5-左切换阀，6-右切换阀，7-二维色谱柱，8-富集柱，9-二元泵，10-质谱检测器。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例：本发明实施例中的肉制品为鸡肉
1）混合标准品工作溶液（1 mg/L）的配制：分别精密移取0.1mL磺胺二甲基异嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺苯甲酰、磺胺二甲氧嘧啶及磺胺甲基异恶唑储备液（1.0mg/mL）至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，精密移取1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得混合标准品工作溶液，于4℃下保存；
2）同位素内标工作溶液（20 ng/mL）的配制：精密移取0.1 mL内标储备液（1.0mg/mL）至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，精密移取0.1 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得20 ng/mL的内标工作溶液，于4℃下保存；
3）样品溶液的制备：精密称取5g市售鸡肉样品，置50 mL高速离心管中，精密加入100µL步骤2）制得的同位素内标工作溶液（20 ng/mL），精密加入0.1%甲酸80%乙腈水溶液复合溶剂20 mL，高速匀浆2 min，于4 000 r/min离心5 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用0.75 mL10%甲醇水溶液复溶，用0.22 μm的滤膜滤过，取续滤液作为样品溶液；
4）线性溶液的制备：称取5g不含磺胺类药物的鸡肉样品，置50 mL高速离心管中，精密加入20mL 0.1%甲酸80%乙腈水溶液复合溶剂，高速匀浆2 min，于4000 r/min离心5min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用0.75mL10%甲醇水溶液复溶，制得空白基质溶液，精密吸取不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液和相同量的步骤2）制得的同位素内标工作溶液，由空白基质溶液稀释得到各磺胺药物浓度分别为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL，内标浓度均为2 ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；
5）空白溶液的制备：精密称取5g不含磺胺类药物的鸡肉样品，置50 mL高速离心管中，精密加入100µL步骤2）得到的同位素内标工作溶液，精密加入20mL 0.1%甲酸80%乙腈水溶液复合溶剂，高速匀浆2 min，于4000 r/min离心5min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用0.75 mL10%甲醇水溶液复溶制得空白溶液，供色谱测定；
6）加标回收试验样品溶液的制备：精密称取5g不含磺胺类药物的鸡肉样品，置50 mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液，获得检出限为1ng/mL、定量限为2ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的加标试验鸡肉样品，再向该加标试验样品中精密加入100µL步骤2）制得的同位素内标工作溶液，精密加入200.1%甲酸80%乙腈水溶液复合溶剂，高速匀浆2 min，于4000 r/min离心5min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用0.75mL10%甲醇水溶液复溶，制得加标回收试验鸡肉样品溶液，供色谱测定；
7）用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液
a如图1所示，其进样分析具体过程如下：在四元泵1的作用下，由自动进样器2分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向一维色谱柱3进样，利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，结果由紫外检测器4检测，左切换阀5和右切换阀6在0-5.2min保持初始状态，即均处于位置2，左切换阀5的2号位和3号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰，右切换阀亦是2号位与3号位相通，切至废液的状态；在5.2-11.2min左切换阀5切换至位置1，即2号位与1号位相通，将目标化合物切换至富集柱8中进行富集，在11.2min左切换阀5切换至位置2，二元泵9将富集柱8上的目标化合物反冲至二维色谱柱7上进行分离，右切换阀6位置不变，利用二元泵9流动相将富集柱8上的磷酸盐缓冲溶液冲至废液池后，防止磷酸盐对质谱系统造成损伤，在16.2min时右切换阀6切换至位置1，即右切换阀6的2号位与1号位相通，进入质谱检测器10进行分析，其色谱条件如下：
a1一维液相条件：
色谱柱：Agilent Bio SEC-5 5μm，150Å，4.6×150mm
流动相：磷酸盐缓冲液(pH7.4)，该磷酸盐缓冲液配制时，取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L 氢氧化钠溶液79mL，用水稀释至200mL得到，
采用等度洗脱，流速：0.35mL/min
富集柱：XBridge C8 Direct Connect HP 10μm
a2二维液相条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1×50 mm，1.7μm
流动相：A相：0.1 %甲酸水，B：0.1 %甲酸甲醇，采用梯度洗脱，其梯度洗脱过程如表1所示：
表1 梯度洗脱过程表
柱温：25 ℃
进样量：5 μL
a3液相色谱中的左切换阀、右切换阀在进样分析过程中切换过程如表2所示：
表2 左切换阀、右切换阀切换过程表
表2中不同位置切换阀流路走向如下：
左切换阀位置1：1~2，3~4，5~6
左切换阀位置2：2~3，4~5，6~1
右切换阀位置1：1~2
右切换阀位置2：2~3
a4质谱检测器条件：
质谱仪：三重四级杆串联质谱仪
离子源：电喷雾离子源
扫描方式：正离子扫描
检测方式：多反应监测
脱溶剂流速 Temp(℃)：500
Source Temp(℃)：150
脱溶剂流速(L/hr)：800
锥孔流速(L/hr)：150
本发明所选的各磺胺类药物的定性定量离子对及碰撞能量表通过质谱参数优化得出，结果如表3所示：
表3各磺胺类药物的定性定量离子对及碰撞能量表
备注：表3中*为定量离子
b 曲线方程斜率、曲线方程截距的计算
以线性溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积定量，得到曲线方程A=aC+b，
式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积比内标化合物峰面积比；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b，本发明用磺胺甲基嘧啶-13C6作为同位素内标；
c 结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一磺胺类药物的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该磺胺类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：
C=(A-b)/a
式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积；
a和b由步骤b计算得到；
d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120%，证明该检测方法可行，平均回收率计算时，一共测了12组平行试验，精密度计算时，一共测了6组平行试验，其验证数据结果如表4所示。
表4 各加标回收试验鸡肉样品中磺胺类药物验证数据结果所示
从表4可以得出，其平均回收率在84-97%之间，精密度在035-1.36%之间，证明该检测方法可行。
通过该方法计算，将步骤b计算得到的a和b数据、样品溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积A代入C=(A-b)/a公式中，求得C的值，经计算本发明检测的鸡肉样品中不含本实验中的各磺胺类药物成分。