本发明属于食品安全检测
技术领域：
：，特别涉及一种婴幼儿配方食品中农药与兽药的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法。
背景技术：
：：婴幼儿配方食品是指以乳类或大豆及其加工制品为主要原料，加入适量的维生素和矿物质等，生产加工而成的液态或粉状食品，适用于正常婴儿食用。随着生活水平的提高，人们对于婴幼儿配方食品的安全问题越来越关注。农药与兽药作为一种婴幼儿配方食品外源性物质，会对人体造成一定的危害。2015年10月1日，新修订的《中华人民共和国食品安全法》正式实施，法规中着重突出婴幼儿配方乳粉等乳及乳制品的生产全程质量控制。婴幼儿配方食品中的农兽药残留来源于食品原料在培育的过程中，使用含有农兽药残留的饲料或被污染的水源，通过食物链在体内蓄积。根据结构特性，农药分为有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、三唑类、二嗪类、烟碱类与酰胺类。婴幼儿配方食品中的农药残留对人体的危害属于微剂量、长时期、慢性细微毒性效应。主流国家和组织涉及婴幼儿配方食品中农药最大限量443种，欧盟限定数量323种，占72.9％，目的除了保护人体健康外，还利用残留限量及其检测技术设置贸易障碍，作为国际贸易的技术壁垒。兽药按照结构分为磺胺类、四环素类、大环内酯类、喹诺酮类、苯丙咪唑类、β-内酰胺类、聚醚类、氯霉素类、阿维菌素类、苯乙胺类、多肽类与类固醇类。兽药残留对人体健康方面的危害表现为细菌耐药性、过敏反应、变态反应、激素作用、以及致癌作用和致畸作用等方面。除此之外，还具有抑菌作用。因此，有必要对农药与兽药的使用量进行控制和监测。然而，目前用于婴幼儿配方食品中外源性风险物质的高通量、快速检测方法较少，前处理操作复杂，材料与设备成本高，仅限于几种或一类化合物的快速检测。因此，婴幼儿配方食品中外源性风险物质的高通量、快速筛查已成发展趋势。本发明针对上述现状，建立了婴幼儿配方食品中农药与兽药色谱质谱联用高通量、快速筛查分析方法。技术实现要素：本发明针对上述现状，提供了一种婴幼儿配方食品中农药与兽药的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，该方法的主要优势为分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高等，可应用于复杂基质的分析。本发明是通过下述的技术方案来实现的：一种婴幼儿配方食品中农药与兽药的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，包括以下步骤：1)利用QuEChERS方法对婴幼儿配方食品的被测物样品进行提取和净化，得到被测物样品的测试溶液；2)运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪对被测物样品进行筛查，采用电喷雾离子源和FullMS/dd-MS2，FullMS/vDIA，FullMS/AIF三种扫描模式，得到被测物样品完整的一级与二级质谱图；3)通过软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出被测物样品中农药与兽药化合物信息；4)将农药与兽药标准谱库中的农药与兽药化合物信息与被测物样品的化合物信息进行比对，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定结构及定量婴幼儿配方食品中农药与兽药的组成。作为本发明的进一步改进，步骤1)具体为：分别称取每种混匀婴幼儿配方食品试样各于具塞离心管中，加入体积百分数1％的乙酸-乙腈/水混合溶液，乙腈和水的体积比为84:16，涡旋混合后加入陶瓷均质石、无水硫酸镁、无水乙酸钠，涡旋后振荡提取处理，离心后，取滤液至进样小瓶中，加入8mmol/L甲酸铵水溶液及甲醇。作为本发明的进一步改进，步骤2)具体为：通过超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱的全扫描模式获得一级质谱图，提取离子流图进行定量，通过可变的数据非依赖采集vDIA模式扫描得到二级质谱图。作为本发明的进一步改进，步骤3)具体为：通过分析二级质谱图得到的碎裂片段数据，初步判断该物质归属类别，继而对该保留时间色谱峰的其他片段信息进行分析，包括质荷比、片段丰度比与同位素丰度比，从而推断出该物质和元素组成。作为本发明的进一步改进，步骤4)中的标准谱库是按照以下步骤建立的：1)分别配制农药与兽药标准品的标准溶液；2)运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪对农药与兽药标准品的标准溶液进行筛查，采用电喷雾离子源和FullMS/dd-MS2，FullMS/vDIA，FullMS/AIF扫描模式，得到标准溶液完整的一级与二级质谱图；3)通过软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出标准溶液的信息，建立农药与兽药的标准谱库。作为本发明的进一步改进，超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪的色谱条件为：色谱柱：AccucoreC-18aQ预柱，10mm×2.1mm，1.9μm，HypersilGoldaQC-18柱，100mm×2.1mm，1.9μm；柱温：35-40℃；流动相：A为体积百分数0.1％甲酸与4mmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B为体积百分数0.1％甲酸与4mmol/L甲酸铵的甲醇溶液；梯度洗脱程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A；13-15min，100％A；流速为300μL/min；进样量5-10μL；碰撞气：氩气；电喷雾离子化离子源：单一正模式或负模式；鞘气流速：18-19L/min；鞘气压力：275Kpa；辅助气流速：3-4L/min；毛细管电压：负离子模式3000V，正离子模式3500V；离子源温度：230-250℃；毛细管温度：320-330℃。作为本发明的进一步改进，超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪的质谱条件为：采用FullMS/vDIA扫描模式，一级质谱扫描分辨率为70000FWHM；自动增益控制目标值设定为一百万；最大注入时间250ms；容许的质量误差范围为5ppm；动态背景扣除10.0s；二级质谱扫描参数：扫描时间：0-15min；分辨率：17500FWHM；自动增益控制的目标值定为五十万；最大注入时间120ms；112.80116-487.97169为第一个vDIA，隔离窗口范围设为25.0Da，LoopCount16；550.50011-850.63654为第二个vDIA，动态背景扣除10.0s，隔离窗口范围设为100.0Da，LoopCount16；碰撞能量分别为17.5eV；35.0eV；52.5eV。相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明先通过QuEChERS方法对婴幼儿配方食品样品进行提取和净化，然后采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱法检测婴幼儿配方食品中农药与兽药，最后通过标准谱库进行比对，最终判定结构及定量婴幼儿配方食品中农药与兽药的组成。本发明的筛选方法，可以一次性定量、定性检测多种物质(425种农药与兽药)，并且具有操作简单，精度高、分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高等优势，可应用于复杂基质的分析。尤其是，Q-Orbitrap(超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪)的分辨率高，在确保痕量化合物灵敏度下，分辨率可达7万；质量精度高，可以使用外标法，无需内标，长时间的质量精度不下降；灵敏度高，检测离子回旋共振的频率，并不需要额外的检测器；动态范围宽，达五个数量级；具有快速正负切换扫描模式，极大节省分析时间，提高分析通量；Q-Orbitrap的稳定性高，只需一周校正一次；定量能力高，可以和三重四极杆相比较；质量范围广，可进行多肽分析；另外，Q-Orbitrap的仪器操作简便，运行成本低，可应用于复杂基质的分析。结果表明：425种农药与兽药在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，高(4×CCβ)、中(2×CCβ)、低(1×CCβ)三个添加水平下，基质的加标回收率达到79％-108％，重复实验6次，其相对标准偏差为0.1％-6.5％。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.01μg/kg-4.2μg/kg与0.01μg/kg-7.28μg/kg。利用优化后的QuEChERS方法对婴幼儿配方食品样品进行提取和净化，简单快捷，效率高，可以有效的排除其中杂质对后续检测的干扰。【附图说明】图1为三氯苯咪唑分子离子峰与同位素离子峰理论值及实际值确证图(浓度为50μg/kg)。【具体实施方式】本发明一种婴幼儿配方食品中农药与兽药的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，其特征在于：该方法所用到的设备包括超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪。包括以下步骤：首先，配制基质溶液和标准溶液；利用已优化的QuEChERS方法对婴幼儿配方食品样品进行提取和净化；其次，运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱(Q-Orbitrap)进行筛查，采用电喷雾离子源(ESI)和全扫描/数据依赖采集(FullMS/dd-MS2)，全扫描/可变的数据非依赖采集(FullMS/vDIA)，全扫描/全离子碎裂采集(FullMS/AIF)三种扫描模式，得到完整的一级与二级质谱图。再次，运用ExactFinder2.5软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出化合物信息。最后，将已建立农药与兽药谱库中的信息与被测物的信息进行比对，包括提取流色谱的保留时间，分子离子峰与其碎裂离子峰丰度比，分子离子峰与碎裂离子峰的精确质量数，分子离子峰与同位素离子峰丰度比，确证婴幼儿配方食品中农药与兽药的组成。下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细阐述，但本发明不限于该实施例。为了使公众对本发明有彻底的了解，在以下本发明优选实施例中详细说明具体的细节。1.色谱质谱分析条件主要仪器：美国ThermoFisherScientific公司的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱，使用电喷雾离子源。(1)色谱条件色谱柱：AccucoreC-18aQ预柱(10mm×2.1mm，1.9μm，美国ThermoFisherScientific公司)，HypersilGoldaQC-18柱(100mm×2.1mm，1.9μm，美国ThermoFisherScientific公司)；柱温：35℃；流动相：A为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵甲醇溶液。梯度洗脱程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A；13-15min，100％A；流速为300μL/min；进样量5μL；碰撞气：高纯氩气(纯度≥99.999％)。电喷雾离子化(ESI)离子源：单一正模式或负模式；鞘气流速：18L/min；鞘气压力：275Kpa；辅助气流速：3L/min；毛细管电压：负离子模式3000V，正离子模式3500V；离子源温度：50℃；毛细管温度：320℃。(2)质谱条件采用FullMS/vDIA扫描模式。一级质谱扫描分辨率为70000FWHM；自动增益控制目标值设定为一百万；最大注入时间250ms；容许的质量误差范围为5ppm；动态背景扣除10.0s。二级质谱扫描参数：扫描时间，0-15min；分辨率：17500FWHM；自动增益控制的目标值定为五十万；最大注入时间120ms；112.80116-487.97169为第一个vDIA，隔离窗口范围设为25.0Da，LoopCount16；550.50011-850.63654为第二个vDIA，动态背景扣除10.0s，隔离窗口范围设为100.0Da，LoopCount16。碰撞能量分别为17.5eV；35.0eV；52.5eV。表1列出了部分农药与兽药标准物质的电离模式与保留时间等信息；表2列出了425种农药与兽药标准数据库部分内容。表1部分农药与兽药标准物质信息表2425种农药与兽药超高效液相色谱/四级杆-轨道离子阱质谱参数2.溶液配制(1)标准溶液的配制分别称取适量的农药与兽药标准品10mg(精确至0.1mg)，置于10mL于容量瓶内，依据标准物质在不同溶剂(甲醇、乙腈和甲苯)中溶解度与测定需要，选用合适的溶剂溶解，定容至10mL，配制成单一化合物标准储备液，于-20℃避光保存。移取单一化合物标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(1:1，v/v)稀释并定容至刻度，配制相应浓度的标准物质混合工作溶液。混标工作液于棕色密闭瓶-20℃避光保存。(2)基质匹配溶液的配制移取12份各5mL婴幼儿配方食品空白样品(实验前测定)提取液于10mL容量瓶中，运用真空氮气吹干仪吹至近干，分别加入1000μg/L的农药与兽药标准品混合溶液10μL、20μL、40μL、80μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1000μL、2000μL、4000μL、5000μL于容量瓶中，各加入甲醇5mL，用8mmol/L甲酸铵水溶液稀释并定容至刻度，配制成1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L相应的基质匹配标准溶液。基质匹配标准溶液应现用现配。3.样品的前处理分别称取每种混匀试样各15g(精确至0.01g)，于50mL具塞聚苯丙烯离心管中，添加425种不同的农药与兽药标准品，并持续15分钟。加入10mL1％(v/v)乙酸-乙腈/水(84:16，v/v)混合溶液，涡旋混合30s后加入陶瓷均质石、6.0g无水硫酸镁、1.45g无水乙酸钠，涡旋30s后振荡提取1min，以4℃、10000r/min离心5min，取200μL滤液至2mL进样小瓶中，加入500μL8mmol/L甲酸铵水溶液及300μL甲醇。运用超高效液相色谱-四级杆-轨道离子阱质谱测定。总共有93种不同的婴幼儿配方食品被分析检测，包括婴幼儿配方谷类食品(cereal-basedfood，CBF)、婴幼儿配方肉类食品(meat-basedfood，MBF)、婴幼儿配方乳粉(powderedmilk-basedinfantformulae，PMBIF)、婴幼儿配方水果食品(non-fattybasedonfruit，FBF)和婴幼儿配方蔬菜食品(non-fattybasedonvegetable，VBF)。这些食品取自不同市场，并按照上述程序进行分析。4.分析结果(1)方法的建立运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱进行筛查，采用电喷雾离子源和FullMS/dd-MS2，FullMS/vDIA，FullMS/AIF扫描模式，通过超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱的全扫描模式获得一级谱图，提取离子流图进行定量，通过可变的数据非依赖采集vDIA模式扫描得到二级谱图。二级扫描在全扫描的基础上得到了更具针对性的碎裂片段数据，即可初步判断该物质归属类别，继而对该保留时间色谱峰的其他片段信息进行分析，包括质荷比、片段丰度比与同位素丰度比，从而推断出该物质结构和元素组成。将该物质推断的片段断裂途径与已建立的农药与兽药标准信息谱库中归属类的其他化合物断裂途径比对，判断该化合物的分子式与结构式，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定与定量。(2)方法学验证a方法的标准曲线、线性范围及相关系数配制425种农药与兽药系列混合标准物质溶液，浓度为0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、8μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、500μg/kg。结果表明，检测方法中425种农药与兽药在其相应的浓度范围内，相关系数(r2)均大于0.99，呈良好的线性关系。b方法的定量下限、加标回收率与精密度CCα的测定采用校准曲线法，CCα等于能观察到响应时纵坐标轴上的浓度值加对应的重现性标准偏差的2.33倍。CCβ为CCα的值加CCα取值时重现性标准偏差的1.64倍。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.01μg/kg-4.2μg/kg与0.01μg/kg-7.28μg/kg。精密度通过统计6次平行实验回收率结果的相对标准偏差得到，将待测物提取净化后，运用四级杆-轨道离子阱质谱检测，计算425种农药与兽药的平均回收率及相对标准偏差。回收率及相对标准偏差结果分别为79％-108％和0.1％-6.5％，所建立的方法准确性和精密度良好。下述表3列出了婴幼儿配方食品中农药与兽药的方法学参数。表3婴幼儿配方食品中部分农药与兽药的线性范围、确定限、检测容量、相关系数、平均回收率及精密度(n＝6)(3)阳性样品筛查定量结果表4阳性样品筛查定量结果(n＝6)注：No.6，9，33，59，62为婴幼儿配方乳粉样品；No.42，51，53为肉类食品样品；No.30为水果食品样品；No.32为谷物食品样品。从图1中可以看出,通过对比三氯苯咪唑(Triclabendazole)的M+113C与M+234S、37Cl丰度比理论值与实际值，可确证结果准确。本发明在实验中采用一针进样方式完成筛查过程中的筛选、确证、定量以满足高通量、快速分析的监控要求。筛选过程中，峰面积阈值设定为可变的数据非依赖采集扫描模式对分子离子峰碎裂阈值的响应强度8.3×104，信噪比设定为国家标准中乳及乳制品中相关外源性物质质谱法测定的定量限规定值10，勾选已建立的婴幼儿配方食品中农药与兽药的标准数据库，保留时间提取窗口设定为保留时间±3倍保留时间漂移标准偏差。提取色谱峰质荷比允许最大质量偏差设定为3ppm。当运用设定的保留时间与质荷比质量偏差提取窗口提取到响应强度大于等于8.3×104色谱峰时，样品初步判断为阳性样品，进行下一步确证工作，若在上述条件下没有提取到色谱峰，初步判断样品为阴性。将初步判断为阴性的样品进行特征断裂片段的提取与分析，对未知目标物质进行筛查分析，进而得出结论。确证工作主要通过同位素离子峰信息与二级碎裂片段丰度比两个方面进行，并解决了同分异构体色谱共流出的确证难点，将具有M+1特征的13C，与具有M+2特征的34S、81Br、37Cl的同位素离子峰丰度比应用于确证步骤。目前对于婴幼儿配方食品中农药与兽药残留高通量快速筛查技术的研究仍为空白。用于婴幼儿配方食品中农药与兽药残留的高通量、快速检测方法较少，前处理操作复杂，材料与设备成本高，仅限于几种或一类化合物的快速检测，多残留快速分析时往往根据化合物的结构特点将化合物分组后检测。近年来，QuEChERS广谱提取方法的应用和通过仪器联用使得婴幼儿配方食品中外源性风险物质筛查分析技术迅速发展。本文针对上述现状，运用高分辨质谱四级杆静电场轨道离子阱质谱，并结合化学计量学对QuEChERS前处理条件优化与定量数据分析，针对与人们生活息息相关的不同婴幼儿配方食品，包括婴幼儿配方谷类食品、婴幼儿配方肉类食品、婴幼儿配方乳粉、婴幼儿配方水果食品和婴幼儿配方蔬菜食品，建立了外源性风险物质色谱质谱联用高通量、快速筛查分析方法。以婴幼儿配方食品复杂基质为模型，建立了外源性风险物质已知目标物质筛查分析方法。以系统的方法学参数考察方案-欧盟标准2002/657/EC与SANCO/12571/2013，对运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱，建立的婴幼儿配方食品中农药与兽药的筛查分析方法进行考核，所有库内潜在目标化合物在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，高、中、低三个添加水平下，回收率达到79％-108％，重复实验6次，其相对标准偏差为0.1％-6.5％。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.01μg/kg-4.2μg/kg与0.01μg/kg-7.28μg/kg，优于中国、日本、美国和欧盟等国家和有关国际组织规定的限量要求，灵敏度与精确度较国标方法提高5倍以上。以上仅为本发明的较佳实施例，并非仅限于本发明的实施范围，凡依本发明专利范围的内容所做的等效变化和修饰，都应为本发明的技术范畴。当前第1页1 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