一种光成像系统及方法与流程

本发明涉及光学技术领域，尤其涉及一种光成像系统及方法。

背景技术：

传统的荧光显微镜具有特异性标记，能够对目标实时成像的优点，在生命科学中起到了广泛的作用。然而，传统的荧光显微成像受到系统传递函数的影响，限制了系统的成像分辨率，从而限制了荧光显微成像在生命科学中的作用。近年来，随着一系列突破衍射极限，实现超分辨成像方法的提出，超分辨荧光技术成为科研工作的热点。例如：受激发射损耗(STED，stimulated emission depletion)技术、结构光照明显微镜(SIM，structured illumination microscopy)技术以及基于单分子定位的超分辨成像技术——光激活定位显微镜(PALM,photo-activation localization microscopy)和随机光学重构显镜(STORM，stochastic optical reconstruction microscopy)等。

结构光照明显微成像技术通过改变照明光的空间结构形成调制图像，调制图像中就包含了超过系统传递函数的高频信息。通过计算处理，提取调制图像的高频信息，突破了衍射极限，重构获得超分辨的图像。结构光照明显微成像技术可直接应用到荧光显微镜上，具有结构简单，成像速度快，对荧光分子没有特别的要求，可应用于实时成像，因而受到了广泛的重视。

但是目前的结构光照明显微成像技术，除了对目标区域细胞照明外，是对整个视场甚至整个样本进行结构光照明，浪费了激光的能量，同时对目标区域外其他细胞造成了光漂白和光毒性。另外，光路结构复杂，激光功率要求大也限制了其使用范围。在研究细胞间相互作用以及外界刺激条件下的细胞反应，以及多细胞选择并行观察细胞间行为和结构关系，无法排除全场条件下的目标以外区域的光致噪声影响。

技术实现要素：

本发明提供一种光成像方法系统及方法，用以通过空间光调制器将激光调制成目标刺激光和区域结构光，照射在样本上产生荧光信号，记录并分析该荧光信号，可获得该光照方向上的高频分量，可提高照明区域该方向的分辨率，降低光致噪声影响，节约激光能量，并且简化了光路结构。

本发明提供一种光成像方法系统，包括：

光源，用于产生激光；

空间光调制器，用于对所述激光进行调制，产生目标刺激光和可寻址到样本目标区域的区域结构光，所述目标刺激光和所述区域结构光照射在样本上，在所述样本的目标区域上产生受所述目标刺激光刺激之后而携带有细胞变化信息的荧光信号；

探测器，用于记录所述荧光信号；

控制单元，用于控制所述空间光调制器保持所述目标刺激光不变，移动所述区域结构光的相位，使得所述样本上的区域结构光条纹移动；

所述探测器，还用于记录每次移动所述区域结构光条纹后产生的荧光信号；

所述控制单元，还用于对记录的所有荧光信号对应的荧光图像进行频谱分析，获得受所述目标刺激光影响时目标区域的高分辨率图像。

本发明还提供一种光成像方法，包括：

产生激光；

空间光调制器对所述激光进行调制，产生目标刺激光和可寻址到样本目标区域的区域结构光，所述目标刺激光和区域结构光照射在样本上，在所述样本的目标区域上产生受所述目标刺激光刺激之后而携带有细胞变化信息的荧光信号；

记录所述荧光信号；

控制空间光调制器保持所述目标刺激光不变，移动所述区域结构光的相位，使得所述样本上的区域结构光条纹移动；

记录每次移动所述区域结构光条纹后产生的荧光信号；

对记录的所有荧光信号对应的荧光图像进行频谱分析，获得受所述目标刺激光影响时目标区域的高分辨率图像。

从上述本发明实施例可知，通过SLM将激光调制成目标刺激光和区域结构光，照射在样本上，在目标区域生受该目标刺激光刺激之后携带有细胞结构变化的荧光信号，并记录该荧光信号，可以获得高频分量，即可提高照明区域该方向的分辨率，控制SLM保持该刺激光不变，移动该结构光的相位，使得样本上的区域结构光条纹移动，可提高移动后方向的分辨率，记录每次移动该区域结构光条纹后产生的荧光信号，对这些荧光信号进行频谱分析，获得受该目标刺激光影响时目标区域的高分辨率图像，当完成整个平面的条纹移动后，可提高该平面内各个方向照明区域的成像分辨率，即可获得受刺激光影响时，特定区域细胞的高分辨率图像。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的光成像系统的光路结构图；

图2是本发明实施例提供的光成像方法的实现流程示意图；

图3(a)～3(d)本发明实施例中目标刺激光与区域结构光照明方式的示意图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种通过单光子激发结构光的光成像系统及方法，可以用于在任意方式的光刺激条件下研究活细胞的纳米分辨结构信息随光刺激的响应。本实施例利用空间光调制器(SLM，Spatial Light Modulator)形成所需的一个或多个目标刺激光与区域结构光照明图案，照射在显微镜的样本的特定区域内，基于单光子效应激发产生荧光信号，并被显微物镜收集成像在探测器(EMCCD，Electron-Multiplying CCD)上。可以根据拟被刺激目标的刺激位置和成像区域，同时产生刺激光(光点)和与被刺激目标匹配区域结构光，刺激光点可以是一个，也可以是多个点，点的位置可以根据需要任意调节。成像目标可以是一个，也可以是多个，可以根据需要任意选择。当受周围某目标细胞被刺激光刺激影响，该荧光图像包含了刺激时刻的对应照明区域细胞超过系统传递函数的高频信息。控制SLM移动不同结构光，获得相应的调制图像，计算可获得被目标刺激光刺激时区域或细胞的高横向分辨率图像，从中可以分析出在细胞相互作用以及刺激条件下的细胞的超分辨率结构信息。下面进行详细描述。

请参阅图1，图1为一种光成像系统的光路结构示意图。该光成像系统包括：

光源1，用于产生激光。

具体地，光源1可采用可见光激光器，例如蓝光激光器，该蓝光激光器的波长可以为405nm(纳米)，也可以为488nm。又例如紫外光激光器，该紫外光激光器的波长可以为350nm。可用于单光子荧光成像的激光器或汞灯以及紫外LD(Laser Diode，半导体激光器)和LED都可以，本实施例放宽了对光源选择的要求，使得光源的可选择面更宽。

空间光调制器(SLM)5，用于对光源1产生的激光进行调制，产生目标刺激光和可寻址到样本的目标区域的区域结构光，该目标刺激光和区域结构光照射在样本15上，在样本15的目标区域上产生受该目标刺激光刺激之后的荧光信号，该目标区域的细胞受到该目标刺激后，细胞结构发生变化，在产生的该荧光信号中携带有细胞变化信息。该空间光调制器可以是反射式纯相位型空间光调制器。利用SLM5对入射光的相位进行调制，反射出所需的目标刺激光和区域结构光图案。

样本15放置在显微镜的显微物镜14下，本实施例中，样本15中包含细胞结构。

该目标刺激光，用于刺激样本15的特定区域或特定细胞，该区域结构光，用于照明该刺激光周围特定区域的细胞，该目标刺激光和区域结构光照射在样本15上，产生受该刺激光影响时该特定区域携带有细胞变化信息的荧光信号。

探测器18，用于记录该荧光信号。

控制单元19，可以是电脑，也可以是电脑中的一个控制模块，图1中以电脑为例。控制单元19与SLM5相连接，可控制SLM5产生该目标刺激光和区域结构光，也可控制SLM5保持该目标刺激光不变，移动该区域结构光的相位，使得样本15上的区域结构光条纹移动。控制单元19可控制SLM5保持刺激光不变，而朝一个方向移动区域结构光条纹，

探测器18，还用于记录每次移动该区域结构光条纹后产生的荧光信号。

区域结构光条纹每移动一次，探测器18记录一次荧光信号。移动结构光条纹成像，就可提高转动后方向的分辨率。依次类推，当完成一个目标区域内的该条纹移动后，就可以提高该平面内各个方向该目标区域内的照明范围的成像分辨率。

探测器18记录的荧光信号存储在控制单元19中。

控制单元19，还用于对记录的所有荧光信号对应的荧光图像进行频谱分析，获得受该目标刺激光影响时目标区域的高分辨率图像。

探测器18记录的所有荧光信号都形成荧光图像，探测器18与控制单元19连接，将记录的荧光图像传到控制单元19中，控制单元19按照预置算法对这些荧光图像进行频谱分析，获得受到目标刺激光影响时，目标区域内的高分辨率图像。

进一步地，在光源1和SLM5之间还依次设有：扩束准直系统以及一个半波片。其中，该扩束准直系统包括两个透镜，即透镜2和透镜3，该扩束准直系统用于将光源1发出的激光扩束形成预置尺寸的平行光束。半波片4，用于改变扩束准直后的该平行光束的偏振态，改为在目标方向上偏振的线偏振光。

进一步地，该光成像系统还包括：空间滤波器。

该空间滤波器包括两个透镜及一个光阑，两个透镜为透镜6和透镜8，一个光阑为光阑7。两个透镜组成4f系统，该两个透镜中的第一透镜6的后焦点与第二透镜8的前焦点重合，光阑7设在该两个透镜重合的焦点上，用于将经过SLM5之后的零级衍射光截止。可以提升所成的像的信噪比，有效利用探测器的动态范围。

进一步地，该光成像系统还包括：傅里叶透镜9、反射镜10、管镜11。

其中，傅里叶透镜9，用于将经过该空间滤波器之后的光聚焦在反射镜10上；

反射镜10，用于将傅里叶透镜9聚焦的光反射到管镜11上；

管镜11，用于将反射镜10反射的光形成平行光斑。

进一步地，该光成像系统还包括：激发滤光片12、双色镜13、显微镜。

从管镜11出来的该平行光斑通过激发滤光片12、双色镜13进入显微镜，在该显微镜的显微物镜14的聚焦作用下，聚焦在显微物镜14的焦平面上形成目标刺激光和区域结构光，显微物镜14的焦平面与样本15的样本面重合。

进一步地，该光成像系统还包括：发射滤光片16、第三透镜17；

发射滤光片16为带通滤光片，用于对激光高反，对荧光信号导通，只允许荧光信号通过。

第三透镜17，用于将通过的在样本15的目标区域上产生的该荧光信号聚焦在探测器18上。

本实施例中，通过SLM将激光调制成目标刺激光和区域结构光，照射在样本上，在目标区域生成受该目标刺激光刺激之后携带有细胞变化信息的荧光信号，并记录该荧光信号，可以获得高频分量，即可提高照明区域该方向的分辨率，控制SLM保持该刺激光不变，移动该区域结构光的相位，使得样本上的区域结构光条纹移动，可提高移动后方向的分辨率，记录每次移动该区域结构光条纹后产生的荧光信号，对这些荧光信号进行频谱分析，获得受该目标刺激光影响时目标区域的高分辨率图像，当完成整个平面的条纹移动后，可提高该平面内各个方向照明区域的成像分辨率，即可获得受刺激光影响时，特定区域细胞的高分辨率图像。同时，简化了光路结构，节约成本。

请参阅图2，图2为一种光成像方法的实现流程示意图。该光成像方法包括：

S201、产生激光；

通过光源产生激光。该光源是可单光子荧光成像的激光器。

S202、空间光调制器对该激光进行调制，产生目标刺激光和可寻址到样本目标区域的区域结构光，该目标刺激光和区域结构光照射在样本上，在该样本的目标区域上产生受该目标刺激光刺激之后而携带有细胞变化信息的荧光信号；

SLM对激光调制，产生目标刺激光和可寻址到样本目标区域的区域结构光，照射在样本上，在样本的目标区域产生荧光信号，该荧光信号是在目标区域上受到目标刺激光的刺激后产生的荧光信号，该目标区域的细胞受到该目标刺激后，细胞结构发生变化，在产生的该荧光信号中携带有细胞变化信息。

具体地，包括两个透镜的扩束准直系统将该激光进行扩束形成预置尺寸的平行光束，半波片将扩束之后的该平行光束的偏振态通过半波片改为在目标方向上偏振的线偏振光，反射式纯相位型空间光调制器对改变偏振态后的激光的相位进行调制，产生初始的目标刺激光和区域结构光。

对该初始的目标刺激光和区域结构光依次进行空间滤波、聚焦、反射后，通过管镜形成平行光斑。其中，空间滤波是通过空间滤波器实现的，该空间滤波器包括两个透镜及一个光阑，两个透镜组成4f系统，该两个透镜中的第一透镜的后焦点与第二透镜的前焦点重合，第一透镜和第二透镜在光路上形成位置前后的关系，光阑设在该两个透镜重合的焦点上，用于将经过SLM之后的零级衍射光截止。之后，通过傅里叶透镜将光聚焦在反射镜上，在反射镜的镜面上形成目标刺激光和区域结构光图案，反射镜将傅里叶透镜聚焦的光反射到管镜上，通过管镜形成了平行光斑。

该平行光斑依次经过激发滤光片、双色镜、显微物镜，在该显微物镜的焦平面上聚焦形成照明激发光斑，即该目标刺激光和区域结构光。该目标刺激光和区域结构光照射在样本上，在该样本的目标区域上产生受该目标刺激光刺激之后携带有细胞变化信息的荧光信号。

S203、记录该荧光信号；

该荧光信号由该显微物镜收集之后依次经过双色镜、发射滤光片、透镜，被探测器接收并记录。

发射滤光片只允许荧光信号通过。

双色镜与入射光之间的夹角可以为45度。

S204、控制空间光调制器保持该目标刺激光不变，移动该区域结构光的相位，使得该样本上的区域结构光条纹移动；

SLM和探测器均分别与计算机相连接，计算机可通过其自身的控制单元控制SLM产生该目标刺激光和区域结构光，也可控制SLM保持该目标刺激光不变，移动该区域结构光的相位，使得样本上的区域结构光条纹移动。控制单元可控制SLM保持刺激光不变，而朝一个方向移动区域结构光条纹。

S205、记录每次移动该区域结构光条纹后产生的荧光信号；

区域结构光条纹每移动一次，探测器便记录一次荧光信号。移动结构光条纹成像，就可提高转动后方向的分辨率。依次类推，当完成一个目标区域内的该条纹移动后，就可以提高该平面内各个方向该目标区域内的照明范围的成像分辨率。

S206、对记录的所有荧光信号对应的荧光图像进行频谱分析，获得受该目标刺激光影响时目标区域的高分辨率图像。

探测器记录的所有荧光信号都形成荧光图像，探测器将记录的荧光图像传到计算机中，控制单元按照预置算法对这些荧光图像进行频谱分析，获得收到目标刺激光影响时，目标区域内的高分辨率图像。

一个实例中，请参见图3(a)～图3(d)，图3(a)～图3(d)为本发明实施例中目标刺激光与区域结构光照明方式的示意图，具体地，图3(a)是单细胞受到单刺激光，多细胞匹配激发结构光，图中有一个细胞受到一个刺激光的光点刺激，图3(b)是单细胞受到多刺激光，多细胞匹配激发结构光，图中有一个细胞受到4个刺激光的光点刺激，图3(c)是多细胞受到单刺激光，多细胞匹配激发结构光，图中有3个细胞各自分别受到1个刺激光的光点刺激；图3(d)是多细胞受到多刺激光，多细胞匹配激发结构光，图中有3个细胞各自分别受到2、3、4个刺激光的光点刺激。图3(a)～图3(d)中，结构光照亮多个细胞，且结构光的照亮范围不变。

本实施例中，通过SLM将激光调制成目标刺激光和区域结构光，照射在样本上，在目标区域生受该目标刺激光刺激之后的荧光信号，并记录该荧光信号，可以获得高频分量，即可提高照明区域该方向的分辨率，控制SLM保持该刺激光不变，移动该结构光的相位，使得样本上的区域结构光条纹移动，可提高移动后方向的分辨率，记录每次移动该区域结构光条纹后产生的荧光信号，对这些荧光信号进行频谱分析，获得受该目标刺激光影响时目标区域的高分辨率图像，当完成整个平面的条纹移动后，可提高该平面内各个方向照明区域的成像分辨率，即可获得受刺激光影响时，特定区域细胞的高分辨率图像。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

以上为对本发明所提供的光成像系统及方法的描述，对于本领域的技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。