一种利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法与流程

本发明属于水产学领域，尤其涉及一种虾蟹类眼柄生长纹观测方法。

背景技术：

虾蟹类隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目，绝大多数种类寿命在1～10岁之间，它是是重要的海洋经济种类，广泛分布于世界各大洋和南、北极等海域。年龄鉴定作为虾蟹类渔业生物学和生态学的重点内容，一直以来受到国内外学者广泛关注。然而，虾蟹类与鱼类、头足类等其它海洋经济动物不一样，缺少直接鉴定其年龄的方法。对于鱼类和头足类来说，它们的生长记录在耳石、鳍条、角质颚等硬组织上，人们可通过对这些硬组织生长纹的计数来确定它们的年龄。然而，虾蟹类的生长与鱼类和头足类等不同，它们是脱壳时生长，因此每次脱壳时原先的硬壳被新的所替代。现有的技术通过实验室饲养、标记回捕等方法来获取虾蟹类的年龄，这一方面实验周期长，另一方面无法直接获取野外样本的年龄。本方法通过直接读取眼柄生长纹数目来鉴定虾蟹类的年龄，为直接鉴定虾蟹年龄提供了一个新方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法，该方法利用形态稳定、容易提取、研磨方便的眼柄来鉴定虾蟹类的年龄，包括虾蟹类眼柄切片的制作步骤和眼柄生长纹的观察与计数步骤。

本发明的技术方案如下：一种利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)剪裁：取出眼柄，将眼柄基部剪平，同时将眼柄末端的眼球剪除；

(2)包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液充满中空的眼柄，并覆盖模具，然后放置室温避光处待其硬化；

(3)切割：将包埋硬化后的树脂沿眼柄的横截面切割成树脂薄片；

(4)固定：将所述树脂薄片眼柄末端朝下，固定在载玻片上；

(5)打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片眼柄基部打磨，先粗磨至眼柄基部表面，再细磨至眼柄基部，以研磨平面完全磨到眼柄基部为准；

(6)抛光：将经打磨的树脂薄片抛光研磨面，除去油质和杂质，完成所述树脂薄片眼柄基部的研磨；

(7)将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由眼柄末端向基部先粗磨、再细磨直至横截面的生长纹清晰可见，最后再抛光得到眼柄切片；

(8)生长纹观察：由眼柄内侧向外侧计数生长纹的数目。

根据本发明所述利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法，在步骤(4)中也可将眼柄基部朝下粘于载玻片上，然后由眼柄末端向基部打磨、抛光和实施后续步骤。

根据本发明所述利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法，优选的是，在步骤(1)剪裁之前对眼柄进行预处理，包括如下步骤：

(1)提取：用手术剪刀剪取虾蟹类的1对眼柄；

(2)清洗：用清水将眼柄表面清洗干净；

(3)去除有机质：将清洗干净的眼柄放入清水中煮沸5分钟，然后用解剖针和尖头镊子将眼柄内部的肌肉和结缔组织剔除；

(4)保存：将经步骤(3)处理的眼柄放入75％的酒精中保存。

根据本发明所述利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法，优选的是，在所述步骤(8)中的生长纹计数步骤为：

(1)图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上清水；在连接有CCD的显微镜400×倍下对眼柄的生长纹进行拍照，用图像处理软件对所拍的图片分别进行拼图处理；

(2)生长纹计数：对400×倍下采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。

本发明还提供一种虾蟹类眼柄切片的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)剪裁：取出眼柄，将眼柄基部剪平，同时将眼柄末端的眼球剪除；

(2)包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂(粘度为60mPas，采购于深圳市三昊仪器设备有限公司)配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液充满中空的眼柄，并覆盖模具，然后放置室温避光处待其硬化；

(3)切割：将包埋硬化后的树脂沿眼柄的横截面切割成树脂薄片；

(4)固定：将所述树脂薄片(眼柄末端朝下)固定在载玻片上；

(5)打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片(眼柄基部)打磨，先粗磨至眼柄基部表面，再细磨至眼柄基部(以研磨平面完全磨到眼柄基部为准)；

(6)抛光：将经打磨的树脂薄片抛光研磨面，除去油质和杂质，完成所述树脂薄片(眼柄基部)的研磨；

(7)将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由眼柄末端向基部先粗磨、再细磨直至横截面的生长纹清晰可见，最后再抛光得到眼柄切片。

根据本发明提供所述虾蟹类眼柄切片的制作方法，优选的是，在步骤(1)剪裁之前对眼柄进行预处理步骤为，包括如下步骤：

(1)提取：用手术剪刀剪取虾蟹类的1对眼柄；

(2)清洗：用清水将眼柄表面清晰干净；

(3)去除有机质：将清晰干净的眼柄放入清水中煮沸5分钟，然后用解剖针和尖头镊子等将眼柄内部的肌肉和结缔组织剔除。

根据本发明提供所述虾蟹类眼柄切片的制作方法，优选的是，在所述步骤(1)中的裁剪要将眼柄基部剪平，同时末端的眼球部分必须剪除；在所述步骤(2)中所述包埋时使树脂充满中空的眼柄；在所述步骤(4)中也可将眼柄基部朝下粘于载玻片上，然后由眼柄末端向基部打磨、抛光和实施后续步骤。

本发明还提供一种虾蟹类眼柄生长纹的观察与计数方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上清水；在连接有CCD的显微镜400×倍下对眼柄的生长纹进行拍照，用图像处理软件对所拍的图片分别进行拼图处理；

(2)生长纹计数：对400×倍下采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。

作为本发明第二方面的一种虾蟹类切片的制作方法，是通过如下技术方案来实现的：

(1)提取：用手术剪刀将眼窝内的眼柄取出；

(2)清洗：取出后的眼柄用清水清洗其表面的粘液及其它有机物；

(3)去除有机质：将清晰干净的眼柄放入清水中煮沸5分钟，然后用解剖针和尖头镊子等将眼柄内部的肌肉和结缔组织剔除；

(4)保存：处理好的眼柄，放入离心管中，加入重量百分比浓度为75％的酒精浸泡保存；

(5)裁剪：取出保存的眼柄，用手术剪刀将眼柄基部剪平，同时将眼柄末端的眼球剪除；

(6)包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液充满中空的眼柄，并覆盖模具，然后放置室温避光处待其硬化；

(7)切割：将包埋硬化后的树脂沿眼柄的横截面切割成2-3mm树脂薄片，并使研磨面平行于眼柄的切割面；

(8)固定：将所述树脂薄片(眼柄末端朝下)用强力速粘胶粘在载玻片上；

(9)打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片(眼柄基部)打磨，研磨过程中，先用240水磨砂纸粗磨至眼柄基部表面，再用600、1200、2000水磨砂纸细磨，并随时在光学显微镜下观察其研磨程度，直至眼柄基部(以研磨平面完全磨到眼柄基部为准)；

(10)抛光：以0.05μm氧化铝剂加水在绒布抛光研磨面，除去水磨砂纸造成的表面划痕以及多余的杂质，如此完成眼柄基部的研磨；

(11)将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由眼柄末端向基部重复上述的研磨和抛光过程直至横截面的生长纹清晰可见。

作为本发明第三方面的一种虾蟹类眼柄生长纹的观察与计数方法，是通过如下技术方案来实现的：

(1)图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上一滴清水(增加观察的清晰度)；在连接有CCD(CCD图像传感器)的Olympus的显微镜400×倍下对眼柄的生长纹进行拍照；用Photoshop 7.0图像处理软件，对所拍的图片分别进行拼图处理；

(2)生长纹计数：对400×倍下采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。

本发明提供的利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法，眼柄容易提取、研磨方便，信息储存稳定，眼柄鉴定虾蟹类年龄，鉴定结果更直接、更准确。本发明方法中包埋前采用手术剪刀剪平眼柄基部，便于寻找最适研磨平面，进一步提高了生长纹读数的准确性；本发明方法中眼柄的研磨采用冷埋树脂包埋眼柄，然后再切割研磨，避免在眼柄研磨过程中研磨平面的偏移，增加了切片制作的成功率。本发明方法在生长纹计数上，采用拍照系统大大方便了生长纹计数的方便性；制作好的切片用CCD拍照，以保证今后随时可以读取生长纹。本发明解决了眼柄不易直接研磨(包埋后增加了研磨接触面、降低了研磨平面偏移概率)，研磨易脱落以及生长纹不易观察和计数的问题，提供一种能够快速准确研磨至最佳平面，保证较高的制片成功率，同时准确的判读生长纹数目。

附图说明

图1虾蟹类眼柄剪裁示意图。

具体实施方式

实施例一：利用眼柄鉴定虾蟹类年龄的方法，操作步骤如下：

1、提取：用手术剪刀将眼窝内的眼柄取出，注意轻取，避免损伤眼柄基部；

2、清洗：取出后的眼柄用清水清洗其表面的粘液及其它有机物；

3、去除有机质：将清晰干净的眼柄放入清水中煮沸5分钟，然后用解剖针和尖头镊子等将眼柄内部的肌肉和结缔组织剔除；

4、保存：处理好的眼柄，放入离心管中，加入重量百分比浓度为75％的酒精浸泡保存；

5、裁剪：取出保存的眼柄(图1A)，用手术剪刀将眼柄基部剪平(图1B)，同时将眼柄末端的眼球剪除(图1C)；

6、包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂(粘度为60mPas，采购于深圳市三昊仪器设备有限公司)配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液充满中空的眼柄，并覆盖模具，然后放置室温避光处待其硬化；

7、切割：将包埋硬化后的树脂沿眼柄的横截面切割成2-3mm树脂薄片，并使研磨面平行于眼柄的切割面；

8、固定：将所述树脂薄片(眼柄末端朝下)用强力速粘胶粘在载玻片上；

9、打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片(眼柄基部)打磨，研磨过程中，先用240水磨砂纸粗磨至眼柄基部表面，再用600、1200、2000水磨砂纸细磨，并随时在光学显微镜下观察其研磨程度，直至眼柄基部(以研磨平面完全磨到眼柄基部为准)；

10、抛光：以0.05μm氧化铝剂加水在绒布抛光研磨面，除去水磨砂纸造成的表面划痕以及多余的杂质，如此完成眼柄基部的研磨；

11、将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由眼柄末端向基部重复上述的研磨和抛光过程直至横截面的生长纹清晰可见；

12、将打磨好的眼柄切片放入纸袋中保存，并做好标记；

13、图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上一滴清水(增加观察的清晰度)；在连接有CCD(CCD图像传感器)的Olympus的显微镜400×倍下对眼柄的生长纹进行拍照；用Photoshop 7.0图像处理软件，对所拍的图片分别进行拼图处理；

14、生长纹计数：对400×倍下采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。

实施例二：一种虾蟹类眼柄切片的制作方法，操作步骤如下：

(1)剪裁：取出眼柄，将眼柄基部剪平，同时将眼柄末端的眼球剪除；

(2)包埋：按1:1～1:1.5的体积比将压克力粉和液体固化剂(粘度为60mPas，采购于深圳市三昊仪器设备有限公司)配置成的冷埋树脂溶液，倒入模具中，使溶液充满中空的眼柄，并覆盖模具，然后放置室温避光处待其硬化；

(3)切割：将包埋硬化后的树脂沿眼柄的横截面切割成树脂薄片；

(4)固定：将所述树脂薄片(眼柄末端朝下)固定在载玻片上；

(5)打磨：将固定在载玻片上的树脂薄片(眼柄基部)打磨，先粗磨至眼柄基部表面，再细磨至眼柄基部(以研磨平面完全磨到眼柄基部为准)；

(6)抛光：将经打磨的树脂薄片抛光研磨面，除去油质和杂质，完成所述树脂薄片(眼柄基部)的研磨；

(7)将以上抛光好的树脂薄片连同载玻片放在加热台上加热直至树脂软化，取下树脂薄片，干燥后，将树脂薄片翻面，固定在载玻片上，然后由眼柄末端向基部先粗磨、再细磨直至横截面的生长纹清晰可见，最后再抛光得到眼柄切片。

根据本发明提供所述虾蟹类眼柄切片的制作方法，优选的是，在步骤(1)剪裁之前对眼柄进行预处理步骤为，包括如下步骤：

(1)提取：用手术剪刀剪取虾蟹类的1对眼柄；

(2)清洗：用清水将眼柄表面清晰干净；

(3)去除有机质：将清晰干净的眼柄放入清水中煮沸5分钟，然后用解剖针和尖头镊子等将眼柄内部的肌肉和结缔组织剔除。

根据本发明提供所述虾蟹类眼柄切片的制作方法，优选的是，在所述步骤(1)中的裁剪要将眼柄基部剪平，同时末端的眼球部分必须剪除；在所述步骤(2)中所述包埋时使树脂充满中空的眼柄；在所述步骤(4)中也可将眼柄基部朝下粘于载玻片上，然后由眼柄末端向基部打磨、抛光和实施后续步骤。

实施例三：一种虾蟹类眼柄生长纹的观察与计数方法，操作步骤如下：

(1)图片制作：将制作好切片置于载玻片上，用胶头滴管滴上一滴清水(增加观察的清晰度)；在连接有CCD(CCD图像传感器)的Olympus的显微镜400×倍下对眼柄的生长纹进行拍照；用Photoshop 7.0图像处理软件，对所拍的图片分别进行拼图处理；

(2)生长纹计数：对400×倍下采集的图像由眼柄内侧向外侧计数生长纹数目。