本发明属于荧光分析技术领域，涉及一种基于碳点和金簇构建的复合荧光纳米探针，还涉及该复合荧光纳米探针在极低含量药物检测中的应用。
背景技术：
食品和环境中微量及痕量药物残留一直以来都是关系社会安全和民生健康的重要问题。而微量及痕量药物残留检测对分析手段提出了较高的要求。以荧光纳米材料的光学信号构建新分析方法是现代药物分析中获得实时动态变化信息的有效途径。
碳点（carbon dots，CDs），又称荧光碳纳米粒子，是近年来新出现的一种荧光纳米颗粒。与其他传统材料相比，其具有稳定性高、激发波长和发射波长可调控、荧光强度大等优点。
贵金属纳米团簇（noble metallic nanoclusters, NMNCs）是由Au、Ag或Pt等贵金属的几个至几十个原子组成的具有荧光、水溶性的纳米级聚集体。其特有的量子尺寸效应使其光学性质具有随粒径大小变化的特性，这种特性使其荧光发射光谱在可见光到近红外光区范围内可调谐。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于利用碳点和金簇的良好荧光性能构建一种新型复合荧光纳米探针，同时利用该复合荧光纳米探针对极低含量药物进行灵敏检测。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1．碳点-金簇复合荧光纳米探针，由木瓜蛋白酶碳点与木瓜蛋白酶金簇共价偶联而得，所述木瓜蛋白酶碳点由木瓜蛋白酶通过水热法制得；所述木瓜蛋白酶金簇由氯金酸与木瓜蛋白酶在碱性水溶液中反应制得。
优选的，所述木瓜蛋白酶碳点采用以下方法制得：将80-100 mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液于180-200℃反应6-8小时，制得木瓜蛋白酶碳点。
更优选的，所述木瓜蛋白酶碳点采用以下方法制得：将100 mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液于200℃反应8小时，反应液冷却，离心去除大颗粒，再用截留分子量为300的透析袋在水中透析，得到木瓜蛋白酶碳点粗品，用硅胶柱层析纯化，干燥，即得木瓜蛋白酶碳点。
优选的，所述木瓜蛋白酶金簇采用以下方法制得：向氯金酸水溶液中加入木瓜蛋白酶水溶液，氯金酸和木瓜蛋白酶的质量比为1: 4.5-10.8，再加入终浓度为0.07-0.1 mol/L的NaOH，20-50℃搅拌反应，制得木瓜蛋白酶金簇。
更优选的，所述木瓜蛋白酶金簇采用以下方法制得：向氯金酸水溶液中加入木瓜蛋白酶水溶液，氯金酸和木瓜蛋白酶的质量比为1: 6.3，再加入终浓度为0.075 mol/L的NaOH，37℃搅拌反应8小时，反应液离心去除大颗粒，再用截留分子量为300的透析袋在水中透析，干燥，即得木瓜蛋白酶金簇。
优选的，所述的碳点-金簇复合荧光纳米探针采用以下方法制得：向木瓜蛋白酶碳点水溶液中加入磷酸缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺（EDC）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），10-40℃反应，再加入木瓜蛋白酶金簇水溶液，10-40℃反应，制得碳点-金簇复合荧光纳米探针。
更优选的，所述碳点-金簇复合荧光纳米探针采用以下方法制得：向木瓜蛋白酶碳点水溶液中加入pH 7.4的磷酸缓冲液、EDC与NHS，20-30℃反应2小时，再加入木瓜蛋白酶金簇水溶液，木瓜蛋白酶碳点与木瓜蛋白酶金簇的质量比为3: 1，20-30℃反应6小时，反应液用截留分子量为1000的透析袋在水中透析，干燥，即得碳点-金簇复合荧光纳米探针。
．碳点-金簇复合荧光纳米探针在制备药物检测试剂中的应用。
进一步，所述药物为过氧化氢、多西环素或碘离子。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种碳点-金簇复合荧光纳米探针，以绿色、环保、无毒的木瓜蛋白酶分别作为碳点和金簇的合成体，制备方法简单、快速，所得碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶性好，可以用于环境中痕量残留药物的检测。
附图说明
图1 碳点-金簇复合荧光纳米探针的制备过程及药物检测应用示意图。
图2 木瓜蛋白酶碳点的合成条件优化：（A）木瓜蛋白酶水溶液的浓度优化；（B）反应时间优化；（C）反应温度优化。
图3 木瓜蛋白酶金簇的合成条件优化：（A）木瓜蛋白酶水溶液的浓度优化；（B）NaOH的浓度优化；（C）反应时间优化；（D）反应温度优化。
图4 （A）木瓜蛋白酶碳点水溶液的荧光激发和发射光谱，其中插图为木瓜蛋白酶碳点水溶液在可见光（a）和紫外光（b）下的照片；（B）木瓜蛋白酶金簇水溶液的荧光激发和发射光谱，其中插图为木瓜蛋白酶金簇水溶液在可见光（a）和紫外光（b）下的照片；（C）木瓜蛋白酶碳点水溶液（a）、木瓜蛋白酶金簇水溶液（b）、木瓜蛋白酶碳点水溶液和木瓜蛋白酶金簇水溶液的简单混合液（c）、碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液（d）的薄层色谱图；（D）由3 mg/mL木瓜蛋白酶碳点水溶液分别与0 mg/mL（a）、0.25 mg/mL（b）、0.5 mg/mL（c）、0.75 mg/mL（d）、1.0 mg/mL（e）木瓜蛋白酶金簇水溶液制得的碳点-金簇复合荧光纳米探针的薄层色谱图；（E）木瓜蛋白酶碳点、木瓜蛋白酶金簇以及碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光光谱（370 nm下激发）。
图5 （A）新鲜制备和4℃保存3个月的木瓜蛋白酶碳点的荧光光谱；（B）木瓜蛋白酶碳点在不同激发波长下的发射光谱；（C）木瓜蛋白酶碳点的红外光谱。
图6 （A）木瓜蛋白酶碳点的高分辨率透射电镜图；（B）木瓜蛋白酶金簇的高分辨率透射电镜图；（C）木瓜蛋白酶碳点的X射线能谱；（D）木瓜蛋白酶金簇的X射线能谱。
图7 木瓜蛋白酶碳点的X射线能谱（O 1s，N 1s、C 1s和S 2p）。
图8 木瓜蛋白酶金簇的X射线能谱（O 1s，N 1s、C 1s和S 2p）。
图9 （A）新鲜制备和4℃保存3个月的木瓜蛋白酶金簇的荧光光谱；（B）木瓜蛋白酶金簇的红外光谱。
图10 （A）新鲜制备和4℃保存3个月的碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光光谱；（B）碳点-金簇复合荧光纳米探针的红外光谱。
图11 （A）碳点-金簇复合荧光纳米探针的高分辨率透射电镜图（50 nm）；（B）碳点-金簇复合荧光纳米探针的高分辨率透射电镜图（10 nm），圆圈处分别为木瓜蛋白酶碳点和木瓜蛋白酶金簇；（C）碳点-金簇复合荧光纳米探针中木瓜蛋白酶金簇和木瓜蛋白酶碳点的晶格；（d）碳点-金簇复合荧光纳米探针的X射线能谱；（E）碳点-金簇复合荧光纳米探针的C 1s峰；（F）碳点-金簇复合荧光纳米探针的Au 4f峰。
图12 碳点-金簇复合荧光纳米探针在不同浓度的过氧化氢、多西环素或碘离子存在下的荧光光谱图（A，C，E）及线性拟合曲线（B，D，F）。
图13 碳点-金簇复合荧光纳米探针测定过氧化氢含量的条件优化：（A）孵育时间优化；（B）孵育温度优化；（C）孵育pH值优化；（D）抗盐能力优化。
图14 碳点-金簇复合荧光纳米探针测定多西环素含量的条件优化：（A）孵育时间优化；（B）孵育温度优化；（C）孵育pH值优化；（D）抗盐能力优化。
图15 碳点-金簇复合荧光纳米探针测定碘离子含量的条件优化：（A）孵育时间优化；（B）孵育温度优化；（C）孵育pH值优化；（D）抗盐能力优化。
上述附图中，CD@Papain表示木瓜蛋白酶碳点，AuNCs@Papain表示木瓜蛋白酶金簇，CD-AuNCs@Papain表示碳点-金簇复合荧光纳米探针。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例中使用的主要试剂如下：木瓜蛋白酶（papain）和碘化钾（KI）购于上海生物工程有限公司。氯金酸（AuCl4）、EDC、NHS、30%过氧化氢（H2O2）和多西环素（doxycycline）购自美国Sigma Aldrich公司。磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、二氯甲烷和甲醇购自北京鼎国生物科技有限公司。实验用水为超纯水（Millipore，18.25 MΩ）。
优选实施例中使用的主要仪器如下：FA2004A电子天平（上海精天电子仪器有限公司），25 ml 聚四氟乙烯水热反应釜（中国济南恒化科技有限公司），F-7000型荧光分光光度计（日本日立公司），Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射电子显微镜（美国FEI公司），ESCALAB 250型X-射线光电子能谱仪（美国Thermo公司），Prestige-21傅里叶红外光谱仪（日本岛津公司），PiloFD8-4.3V型冷冻干燥仪（美国西盟国际公司），DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司），UPT实验室超纯水器（中国西安优普仪器设备有限公司），TG16-W微量高速离心机。
图1为碳点-金簇复合荧光纳米探针的制备过程及药物检测应用示意图。具体实验方法和结果如下：
一、碳点-金簇复合荧光纳米探针的制备
1、木瓜蛋白酶碳点的合成与表征
合成：称取木瓜蛋白酶0.6 g加入超纯水6 mL中，搅拌均匀后转移至25 mL聚四氟乙烯水热反应釜中，再将反应釜置烘箱中，200℃反应8小时。所得反应液冷却至室温，16000 r/min离心10分钟去除大颗粒，再在去离子水中用透析袋（截留分子量为300）透析48小时，得到木瓜蛋白酶碳点粗品。将木瓜蛋白酶碳点粗品用硅胶柱层析进行纯化，以二氯甲烷和甲醇的混合液作为洗脱剂，所得洗脱液经冷冻干燥得到木瓜蛋白酶碳点干粉，用超纯水溶解制成浓度为10 mg/mL的溶液，4℃保存备用。
合成条件优化：（1）木瓜蛋白酶水溶液的浓度优化：按上述相同方法，分别采用浓度为20、40、60、80、100 mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液制备木瓜蛋白酶碳点。结果显示，用80-100 mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液制得的木瓜蛋白酶碳点的荧光效果较好，木瓜蛋白酶水溶液的最佳浓度为100 mg/mL（图2A）。
（2）反应时间的优化：按上述相同方法，分别反应4、5、6、7、8、9小时制备木瓜蛋白酶碳点。结果显示，反应6-8小时制得的木瓜蛋白酶碳点的荧光效果较好，反应时间最佳为8小时（图2B）。
（3）反应温度的优化：按上述相同方法，分别于120、140、160、180、200℃反应制备木瓜蛋白酶碳点。结果显示，180-200℃反应制得的木瓜蛋白酶碳点的荧光效果较好，反应温度最佳为200℃（图2C）。
表征：木瓜蛋白酶碳点的最佳激发波长为370 nm，最佳发射波长为435 nm（图4A），其在可见光下呈微黄色（图4A中的插图a），在365 nm紫外光下发出青色荧光（图4A中的插图b）。在4℃保存3个月，木瓜蛋白酶碳点没有出现荧光强度的明显衰减（图5A）。木瓜蛋白酶碳点的荧光波长随着激发波长的增加有明显的红移现象，当激发波长从370 nm增加到450 nm，木瓜蛋白酶碳点的发射波长从435 nm增加到510 nm（图5B）。使用傅里叶红外光谱分析木瓜蛋白酶碳点的表面结构（图5C），3400 cm-1处的峰归因于O-H伸缩振动，1651 cm-1处的峰归因于C=O伸缩振动，2889 cm-1处的峰归因于N-H伸缩振动，显示木瓜蛋白酶碳点的表面存在羧基、羟基、氨基等特征官能团。使用高分辨率透射电镜观察木瓜蛋白酶碳点的形貌特征（图6A），可见木瓜蛋白酶碳点具有良好的分散性，平均直径为5.3±1 nm。使用X-射线电子能谱进行木瓜蛋白酶碳点的表面成分和元素分析（图6C和图7），可见谱图上主要存在S、C、N和O 四种类型的峰（167.2，285，399.3和532.4 eV分别来自于S 2p，C 1s，N 1s和O 1s），说明木瓜蛋白酶碳点掺杂N和S。
2、木瓜蛋白酶金簇的合成与表征
合成：在37℃剧烈搅拌条件下，向100 mg/mL氯金酸水溶液0.15 mL中加入17.5 mg/mL木瓜蛋白酶水溶液5.4 mL，继续搅拌5分钟后，加入1M NaOH溶液450 µL，37℃搅拌反应8小时。所得反应液于16000 r/min离心10分钟去除大颗粒，再在去离子水中用透析袋（截留分子量为300）透析48小时，冷冻干燥，得到木瓜蛋白酶金簇干粉，用超纯水溶解制成浓度为10 mg/mL的溶液，4℃保存备用。
合成条件优化：（1）木瓜蛋白酶水溶液的浓度优化：按上述相同方法，加入浓度分别为5、10、12.5、15、17.5、22.5、25、27.5、30 mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液制备木瓜蛋白酶金簇。结果显示，加入浓度为12.5-30 mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液，制得的木瓜蛋白酶金簇的荧光效果较好，木瓜蛋白酶水溶液的最佳浓度为17.5 mg/mL（图3A）。
（2）NaOH的浓度优化：按上述相同方法，加入不同体积的 1 M NaOH溶液使体系内NaOH的最终浓度分别为0、0.025、0.05、0.075、0.1 mol/L，制备木瓜蛋白酶金簇。结果显示，体系中加入终浓度为0.07-0.1 mol/L的NaOH，制得的木瓜蛋白酶金簇的荧光效果较好，NaOH的最佳终浓度为0.075 mol/L（图3B）。
（3）反应时间的优化：按上述相同方法，分别反应5、6、7、8、9、10、12、13、14小时制备木瓜蛋白酶金簇。结果显示，反应时间对制得的木瓜蛋白酶金簇的荧光效果影响不大，最佳反应时间为8小时（图3C）。
（4）反应温度的优化：按上述相同方法，分别于20、37、50、60、70、80℃反应制备木瓜蛋白酶金簇。结果显示，20-50℃反应制得的木瓜蛋白酶金簇的荧光效果较好，反应温度最佳为37℃（图3D）。
表征：木瓜蛋白酶金簇的最佳激发波长为370 nm，最佳发射波长为632 nm（图4B），其在可见光下呈微黄色（图4B中的插图a），在365 nm紫外光下发出红色荧光（图4B中的插图b）。在4℃保存3个月，木瓜蛋白酶金簇没有出现荧光强度的明显衰减（图9A）。使用傅里叶红外光谱分析木瓜蛋白酶金簇的表面结构（图9B），显示木瓜蛋白酶金簇的表面存在羧基、羟基、氨基等特征官能团。使用高分辨率透射电镜观察木瓜蛋白酶金簇的形貌特征（图6B），可见木瓜蛋白酶金簇呈球型，分散性良好，平均直径为2±0.3 nm。使用X-射线电子能谱进行木瓜蛋白酶金簇的表面成分和元素分析（图6D和图8），可见谱图上主要存在Au、S、C、N、Na和O 六种类型的峰（167.6，285.3，400.3和532.2 eV分别来自于S 2p，C 1s，N 1s和O 1s），说明木瓜蛋白酶金簇含有S、C、N和O元素。
3、碳点-金簇复合荧光纳米探针的制备与表征
制备：在10 mL EP管中，加入10 mg/mL木瓜蛋白酶碳点水溶液1.5 mL与0.01M、pH 7.4磷酸缓冲液2.8 mL，再加入10 mg/mL EDC水溶液152 µL与10 mg/ml NHS水溶液46 µL，混合均匀，室温下反应2小时，再加入10 mg/mL木瓜蛋白酶金簇水溶液0.5 mL，室温下反应6小时。所得反应液在去离子水中用透析袋（截留分子量为1000）透析48小时，冷冻干燥，得到碳点-金簇复合荧光纳米探针干粉，用超纯水溶解制成浓度为10 mg/mL的溶液，4℃保存备用。
制备条件（木瓜蛋白酶碳点与木瓜蛋白酶金簇的交联质量比优化：按上述相同方法，将终浓度为3 mg/mL的木瓜蛋白酶碳点分别与不同终浓度（0，0.25，0.5，0.75和1.0 mg/mL）的木瓜蛋白酶金簇进行交联，制备碳点-金簇复合荧光纳米探针。吸取制得的不同碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液各10 µL，分别点于同一薄层板上，以甲醇、二氯甲烷和冰醋酸的混合液为展开剂进行展开，晾干后在365 nm紫外灯下进行观察。结果显示，终浓度为3 mg/mL的木瓜蛋白酶碳点与终浓度为1 mg/mL的木瓜蛋白酶金簇交联所制得的碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光效果最好，则木瓜蛋白酶碳点与木瓜蛋白酶金簇的最佳交联质量比为3: 1 （图4D）。
表征：（1）采用薄层色谱法对碳点-金簇复合荧光纳米探针中木瓜蛋白酶碳点与木瓜蛋白酶金簇是否连接进行判定。吸取木瓜蛋白酶碳点水溶液、木瓜蛋白酶金簇水溶液、木瓜蛋白酶碳点水溶液与木瓜蛋白酶金簇水溶液的简单混合液（由木瓜蛋白酶碳点水溶液与木瓜蛋白酶金簇水溶液直接混合而得）、碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液各10 µL，分别点于同一薄层板上，以甲醇、二氯甲烷和冰醋酸的混合液为展开剂进行展开，晾干后在365 nm紫外灯下进行观察。结果见图4C，木瓜蛋白酶碳点移动至薄层板的上端；木瓜蛋白酶金簇几乎未移动，仍然位于薄层板的下端；木瓜蛋白酶碳点水溶液与木瓜蛋白酶金簇水溶液的简单混合液分别在薄层板的上端和下端相应位置处出现了木瓜蛋白酶碳点的斑点与木瓜蛋白酶金簇的斑点；碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液除了分别在薄层板的上端和下端相应位置处出现了木瓜蛋白酶碳点的斑点与木瓜蛋白酶金簇的斑点之外，在薄层板的中段还出现了碳点-金簇复合荧光纳米探针的斑点，说明通过复合交联的方法，可以使木瓜蛋白酶碳点与木瓜蛋白酶金簇连接，制得碳点-金簇复合荧光纳米探针。
（2）碳点-金簇复合荧光纳米探针在370 nm激发波长下，具有两个荧光峰，其中λmax = 435 nm的荧光峰来自于木瓜蛋白酶碳点，λmax = 632 nm的荧光峰来自于木瓜蛋白酶金簇（图4E）。在4℃保存3个月，碳点-金簇复合荧光纳米探针没有出现荧光强度的明显衰减（图10A）。使用傅里叶红外光谱分析碳点-金簇复合荧光纳米探针的表面结构（图10B），显示碳点-金簇复合荧光纳米探针的表面存在羧基、羟基、氨基等特征官能团。使用高分辨率透射电镜观察碳点-金簇复合荧光纳米探针的形貌特征（图11 A和B），可见碳点-金簇复合荧光纳米探针的颗粒尺寸较木瓜蛋白酶碳点或木瓜蛋白酶金簇大，木瓜蛋白酶碳点与木瓜蛋白酶金簇已成功地连接在一起。此外，碳点-金簇复合荧光纳米探针中木瓜蛋白酶碳点的晶格为0.24 nm，木瓜蛋白酶金簇的晶格为0.32 nm（图11C）。使用X-射线电子能谱进行碳点-金簇复合荧光纳米探针的表面成分和元素分析，可见谱图上主要存在Au、S、C、N、Na和O 六种类型的峰（图11 D）；其中C 1s光谱显示有三个主要的峰，分别是284.5eV（C-C）、285.9eV（C-O、C-N、C-S）和288.1eV（C=N，C=O）（图11E）；Au 4f7/2光谱中83.5eV和84.2eV的峰分别对应Au（0）和Au（I）（图11F）。上述特征表明，碳点-金簇复合荧光纳米探针还保留着与木瓜蛋白酶碳点和木瓜蛋白酶金簇相似的组成和结构。
二、碳点-金簇复合荧光纳米探针在极低含量药物检测中的应用
以消毒药物、抗菌药物、抗甲状腺药物为例，采用碳点-金簇复合荧光纳米探针进行环境中痕量残留药物的检测。
1、采用碳点-金簇复合荧光纳米探针测定过氧化氢的含量
测定：取10 mg/mL碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液0.8 mL，加入不同浓度的过氧化氢水溶液0.2 mL使体系中过氧化氢的最终浓度分别为2、5、10、15、25、70、150、300、700、1000 nM，在30℃、pH = 7条件下孵育1小时，在激发波长370 nm条件下扫描390-720 nm波长范围的荧光光谱，绘制线性拟合曲线。测定结果显示（图12 A和B），碳点-金簇复合荧光纳米探针在波长632 nm的荧光强度随着过氧化氢的浓度增加而逐渐降低，其荧光强度的减小（F0-F）值与过氧化氢的浓度在2-1000 nM范围内呈线性关系，相关系数为0.992，说明碳点-金簇复合荧光纳米探针适用于环境中极低含量过氧化氢的检测。
测定条件优化：（1）孵育时间优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入过氧化氢水溶液使体系中过氧化氢的最终浓度为1000 nM，孵育不同时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时）后，在波长632 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图13A），与过氧化氢孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值不随孵育时间的变化而变化，最佳孵育时间为1小时。
（2）孵育温度优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入过氧化氢水溶液使体系中过氧化氢的最终浓度为1000 nM，在不同温度（30、40、50、60、70、80、90℃）条件下孵育后，在波长632 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图13B），与过氧化氢孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值基本不随孵育温度的变化而变化，最佳孵育温度为30℃。
（3）孵育pH值优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入过氧化氢水溶液使体系中过氧化氢的最终浓度为1000 nM，在不同pH值（3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）条件下孵育后，在波长632 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图13C），与过氧化氢孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值在pH大于7后逐渐变小，最佳孵育pH值为7。
（4）抗盐能力优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入过氧化氢水溶液使体系中过氧化氢的最终浓度为1000 nM，再加入不同终浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L）的氯化钠，孵育，在波长632 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图13D），碳点-金簇复合荧光纳米探针在体系中氯化钠浓度增大的情况下，荧光强度不发生明显改变，表明该探针具有较高的抗盐能力。
2、采用碳点-金簇复合荧光纳米探针测定多西环素的含量
取10 mg/mL碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液0.8 mL，加入不同浓度的多西环素水溶液0.2 mL使体系中多西环素的最终浓度分别为1、2、4、8、15、25、40、70、110 μM，在30℃、pH = 7条件下孵育1小时后，在激发波长370 nm条件下扫描390-720 nm波长范围的荧光光谱，绘制线性拟合曲线。测定结果显示（图12 C和D），碳点-金簇复合荧光纳米探针与多西环素孵育后，其荧光峰发生了变化，仅在λmax = 535nm处出现荧光峰；随着多西环素的浓度增加，该荧光峰的荧光强度逐渐降低，荧光强度的减小值与多西环素的浓度在1-110 μM范围内呈线性关系，相关系数为0.990，说明碳点-金簇复合荧光纳米探针适用于环境中极低含量多西环素的检测。
测定条件优化：（1）孵育时间优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入多西环素水溶液使体系中多西环素的最终浓度为100 µM，孵育不同时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时）后，在波长535 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图14A），与多西环素孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值不随孵育时间的变化而变化，最佳孵育时间为1小时。
（2）孵育温度优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入多西环素水溶液使体系中多西环素的最终浓度为100 µM，在不同温度（30、40、50、60、70、80、90℃）条件下孵育后，在波长535nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图14B），与多西环素孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值不随孵育温度的变化而变化，最佳孵育温度为30℃。
（3）孵育pH值优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入多西环素水溶液使体系中多西环素的最终浓度为100 µM，在不同pH值（5、6、7、8、9、10、11、12）条件下孵育后，在波长535nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图14C），与多西环素孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值不随孵育pH值的变化而变化，最佳pH值为7。
（4）抗盐能力优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入多西环素水溶液使体系中多西环素的最终浓度为100 µM，再加入不同终浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L）的氯化钠，孵育，在波长535 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图14D），碳点-金簇复合荧光纳米探针在体系中氯化钠浓度增大的情况下，荧光强度不发生明显改变，表明该探针具有较高的抗盐能力。
3、采用碳点-金簇复合荧光纳米探针测定碘离子的含量
取10 mg/mL碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液0.8 mL，加入不同浓度的碘化钾水溶液0.2 mL使体系中碘离子的最终浓度分别为2、5、10、45、120、180、800、1250 µM，在40℃、pH = 2条件下孵育1小时后，在激发波长370 nm条件下扫描390-720 nm波长范围的荧光光谱，绘制线性拟合曲线。测定结果显示（图12 E和F），碳点-金簇复合荧光纳米探针在波长435 nm的荧光强度随着碘离子的浓度增加而逐渐降低，其荧光强度的减小值与碘离子的浓度在2-1250 μM范围内呈线性关系，相关系数为0.991，说明碳点-金簇复合荧光纳米探针适用于环境中极低含量碘离子的检测。
测定条件优化：（1）孵育时间优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入碘化钾水溶液使体系中碘离子的最终浓度为100 µM，孵育不同时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时）后，在波长435 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图15A），与碘离子孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值不随孵育时间的变化而变化，最佳孵育时间为1小时。
（2）孵育温度优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入碘化钾水溶液使体系中碘离子的最终浓度为100 µM，在不同温度（30、40、50、60、70、80、90℃）条件下孵育后，在波长435 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图15B），与碘离子孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值随着孵育温度的变化而变化，最佳孵育温度为40℃。
（3）孵育pH值优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入碘化钾水溶液使体系中碘离子的最终浓度为100 µM，在不同pH值（5、6、7、8、9、10、11、12）条件下孵育后，在波长435 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图15C），与碘离子孵育后，碳点-金簇复合荧光纳米探针的荧光强度减小值在pH大于9后略有变小，最佳pH值为2。
（4）抗盐能力优化：按上述相同方法，向碳点-金簇复合荧光纳米探针水溶液中加入碘化钾水溶液使体系中碘离子的最终浓度为100 µM，再加入不同终浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L）的氯化钠，孵育，在波长435 nm处测定荧光强度，同时测定相同浓度的碳点-金簇复合荧光纳米探针对照溶液的荧光强度。结果显示（图15D），碳点-金簇复合荧光纳米探针在体系中氯化钠浓度增大的情况下，荧光强度不发生明显改变，表明该探针具有较高的抗盐能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。