一种评价污泥臭氧处理过程中活菌含量和组成的方法与流程

本发明涉及水处理领域，特别涉及污泥臭氧处理过程中活菌含量和组成的检测方法。

背景技术：

剩余污泥是污水生物处理系统的副产物，其处理和处置费用占到污水厂运行费用的50％以上，因此需要开发有效的污泥减量方法。臭氧氧化是一种新兴的污泥减量方法，并且目前已有研究将臭氧污泥处理与生物脱氮除磷工艺结合：活性污泥臭氧处理后，处理后污泥回流至厌氧池或缺氧池，补充碳源以促进脱氮除磷效果。臭氧是一种强氧化剂，进行污泥处理时污泥细菌细胞膜首先被破坏导致细胞损伤，损伤后细菌胞内物质(三磷酸腺苷(ATP)、蛋白和DNA等大分子物质)流失，臭氧可以进一步氧化和溶解释放的大分子有机质，从而导致污泥减量。活性污泥主要由拟杆菌、变形菌、不动杆菌等种类繁多的细菌组成，不同的细菌具有不同的细胞结构，导致它们具有不同的臭氧氧化耐性。同时，一些活性污泥中的功能细菌类群，如反硝化菌、硝化细菌和聚磷菌等具有重要的水质净化功能，当臭氧污泥减量工艺与脱氮除鳞工艺结合时，这部分功能细菌没有必要被杀灭。因此，探明活性污泥中不同细菌在臭氧处理过程中的耐受性对于臭氧污泥减量工艺的优化具有重要指导意义。但是，目前对于污泥臭氧减量处理大家主要关注污泥总量的消减效果，很少关注内在的微生物响应机制。

如前所述，臭氧污泥处理主要通过细胞膜损伤导致污泥细菌灭活。因此，通过活菌检测可以判断不同活性污泥细菌对臭氧氧化的耐受性。传统的活菌检测主要使用营养培养基进行异样菌的筛选，再通过菌种鉴定进行活菌组成的解析。但是，活性污泥中超过90％的细菌是不可培养的，传统的基于培养的方法无法全面解析活菌群落组成与变化。同时，传统的基于培养的方法需要至少两天的检测时间，无法及时解析活菌总量变化，从而无法及时指导臭氧工艺运行优化。

ATP是活细胞内能量传递的重要介质，单细胞死亡后ATP不再产生，残留的ATP也会很快消耗掉，因此ATP含量与活细胞总量具有良好的一致性。同时，ATP依赖性的荧火虫发光素酶(Firefly Luoiferase)催化荧火虫发光素(Firefly Luciferin)氧化发光反应可作为活菌的标志快速检测ATP含量，总体检测时间少于<3min。基于上述优点，通过检测活性污泥中ATP总量可以快速检测污泥中活菌总量。ATP方法可以快速检测臭氧处理中活性污泥中活菌总量变化，从而及时对臭氧运行状况进行检测和评价。但是，ATP检测方法无法给出活菌群落具体组成信息，从而无法解析不同活性污泥细菌对臭氧氧化的耐受性。叠氮溴化丙锭(PMA)是一种新型的DNA染料，其可以进入死菌细胞内并与DNA结合，在强光照射下可以与DNA进行不可逆结合，从而抑制后续的PCR反应。因此，通过将PMA处理、PCR扩增及测序技术结合可以选择性的扩增活菌的16s rRNA基因，从而实现活性污泥中活菌群落分析。

技术实现要素：

本发明提供一种快速和全面解析污泥臭氧处理过程中污泥中活菌数量和组成变化的检测方法，该方法通过ATP检测不同臭氧处理过程中污泥中活菌总量变化，对于有意义的臭氧处理污泥进行PMA辅助的PCR测序分析，完成臭氧处理后污泥中活菌组成分析。本检测方法可以快速分析不同臭氧处理条件下污泥中活菌杀灭效果，从而用于臭氧运行效果评价和优化；同时，可以进行活菌组成分析进行污泥臭氧氧化处理的微生态响应机制研究。

(1)对活性污泥和臭氧处理后污泥进行均一化处理，用10倍体积的Ringer1/4溶液进行稀释，1ml针管吹打10次；然后再用10倍体积的Ringer1/4溶液稀释于玻璃管中，超声波清洗机加入超纯水，超声45s，涡旋10s，共9个循环，据能量密度计算，控制消耗能量在16000J·L^-1。

(2)根据固体物质含量进行适当稀释后进行ATP检测:将步骤(1)处理好的污泥样品和ATP提取剂分别置于38℃水浴中至少1min；在500μl污泥样品中加入50μlATP提取液后，在水浴保持100s，立即测定荧光值，得到总ATP荧光值；用0.1μm无菌滤膜过滤上述测定测总ATP荧光值之后的样品，测量滤液ATP荧光值，得到胞外ATP荧光值；活菌ATP荧光值＝总ATP荧光值-胞外ATP荧光值从而得到污泥臭氧处理过程中活菌含量；采用ATP依赖性的荧火虫发光素酶(Firefly Luoiferase)催化荧火虫发光素(Firefly Luciferin)氧化发光反应可作为活菌的标志快速检测ATP含量；

(3)基于ATP检测结果，针对步骤(2)臭氧处理前后ATP含量有变化的污泥，加入PMA并在强光照条件下处理：对步骤(1)对应均一化处理后的污泥使用磷酸盐缓冲液稀释至1000mg/L，取1ml稀释后污泥加入PMA染料至PMA终浓度为50uM，冰上暗育10min，然后650瓦强光照射下反应10min，照射过程降温保证反应温度<5℃；处理污泥，使用试剂盒进行总DNA提取，并进行16srRNA基因PCR扩增，并对PCR扩增产物进行测序分析，对于测序结果使用质控和群落组成分析，然后得出污泥臭氧处理过程中活菌组成。

采用本发明的方法很容易直接得出或评价污泥臭氧处理过程中活菌含量和组成。且方法简单，重复性好，准确性高，不受污泥浓度的影响。本检测方法可以快速分析不同臭氧处理条件下污泥中活菌杀灭效果，从而用于臭氧运行效果评价和优化；同时，可以进行活菌组成分析进行污泥臭氧氧化处理的微生态响应机制研究。

附图说明

图1为实例不同臭氧消耗量的活菌ATP浓度；

图2不同臭氧消耗量的胞外ATP浓度；

图3不同臭氧杀菌率；

图4为实例PMA检测不同臭氧消耗量的活菌DNA拷贝数结果。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1.臭氧处理活性污泥的活菌检测

固定臭氧投入量分别为：0、51.99、114.38、135.15、155.94、207.90、259.89、311.89mg.g^-1，污泥浓度2000mg/L。

2、ATP快速检测活菌含量

(1)取1ml污泥样品用Ringer1/4溶液1:10稀释，1ml针管吹打10次；用Ringer1/4溶液1:10稀释于玻璃管中，超声波清洗机加入12.7L超纯水，超声45s，涡旋10s，共9个循环(据能量密度计算，控制消耗能量在16000J·L-1)。

(2)将处理好的污泥样品和ATP提取剂分别在38℃水浴中至少1min；500μl体积样品中加入50μlATP提取液后，水浴时间100s，快速测定荧光值，得到总ATP荧光值；用0.1μm无菌滤膜过滤污泥样品，测量滤液ATP荧光值，得到胞外ATP荧光值；活菌ATP荧光值＝总ATP-胞外ATP。

3、基于ATP检测结果，选择ATP含量有明显变化的污泥，加入PMA并在强光照条件下处理，处理污泥使用试剂盒进行总DNA提取，并进行16s rRNA基因PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序分析。

随臭氧投加量的增加，活菌DNA的拷贝数开始减少，当消耗量达到135.2mg的时候，活菌DNA的拷贝数量变化明显，杀菌效果明显；之后随臭氧消耗量的增加，活菌DNA的拷贝数量的变化趋于持平，当臭氧消耗量达311.9mg时，DNA拷贝数又有一个明显下降，与ATP检测结果相符。

PMA浓度对活菌DNA的扩增的影响

取1ml浓度为1000mg/l活菌污泥样品，分别用PMA处理，使PMA终浓度分别为0μM、50μM、70μM、100μM，提取DNA，进行q-PCR鉴定，结果如图所示，在0、50、70μM浓度的PMA作用下，DNA的拷贝数变化差别并不明显，当PMA终浓度达到100Μm时，DNA拷贝数少量下降，说明PMA终浓度在70Μm以内时，PMA对活菌DNA的扩增并无明显影响,当PMA终浓度达到100Μm时,对活菌DNA的扩增有抑制作用。

表1不同时间取样的臭氧消耗量

ATP检测结果：

ATP检测结果如图所示，随臭氧投加量的增加，活菌数量开始减少，当消耗量达到135.15mg的时候，活菌数量变化明显，杀菌效果明显，杀菌效率达70.89％；之后随臭氧消耗量的增加，活菌数量的变化趋于持平，当臭氧消耗量达311.89mg时，杀菌率达87.96％。根据ATP检测结果选取臭氧消耗量为0mg.g^-1、114.3mg.g^-18、135.15mg.g^-1、311.88mg.g^-1的样品进行基因定量分析和活菌种群分析。

PMA检测结果

PMA检测结果如图所示，随臭氧投加量的增加，活菌DNA的拷贝数开始减少，当消耗量达到135.2mg的时候，活菌DNA的拷贝数量变化明显，杀菌效果明显；之后随臭氧消耗量的增加，活菌DNA的拷贝数量的变化趋于持平，当臭氧消耗量达311.9mg时，DNA拷贝数又有一个明显下降，与ATP检测结果相符。

上述实例表明，利用ATP结合PMA-qPCR方法，操作过程简单，可以快速分析不同臭氧处理条件下污泥中活菌杀灭效果，从而用于臭氧运行效果评价和优化；同时，可以进行活菌组成分析进行污泥臭氧氧化处理的微生态响应机制研究。