一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法与流程

技术特征：

1.一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于包括如下步骤：

S1模型构建与评价：将实验动物分为对照组，慢性温和不可预知应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组，进行长期应激造模处理，造模过程中结合进行行为学实验对模型的构建进行评价；

S2样本采集和处理：所有动物接受步骤S1所述行为学实验后，分别对所述三组动物采用甲醇沉淀蛋白的方法对各自血浆样本进行前处理及对脑组织中的小分子代谢物进行提取，并最终收集血浆、海马和前额皮层样本；

S3样品分析：采用代谢组学平台对血浆、海马和前额皮层样本进行非靶标性代谢轮廓分析获得代谢组学数据；

S4数据处理：应用SIEVE软件对代谢组学数据进行预处理后，将其导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析，再应用R语言包和SPSS17.0软件对数据进行单变量和多变量数据分析；

S5模式判别分析以及数学模型的建立：采用训练集建模，测试集验证的方式，判断代谢组的改变与抑郁程度的联系，建立以代谢组来评价抑郁程度的方法。

2.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S1中所述行为学实验的具体方法为：

S11、模型构建及分组：实验动物随机分为三组：对照组，慢性温和不可预知应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)模型组，盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组三组；

S12、应激造模处理：除了对照组外，所有动物接受包括20h禁水，20h禁食，20h禁水禁食，潮湿垫料，同笼饲养，4h白噪音刺激，3h频闪光刺激，45°倾斜饲养笼，昼夜颠倒在内的长期慢性温和应激过程，每天随机给予一种应激并且3天之内不得重复，保证应激的不可预知性；

S13、模型构建成功的判定：在经过三周上述造模后，行为学糖水偏好实验结果明显降低视为模型已经初步构建成功，抑郁样行为已经出现。

3.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S13中所述行为学糖水偏好实验具体为：由于啮齿类动物天生偏好甜食，适当给予糖水对其意味着奖赏行为，而经过应激后大鼠出现抑郁症状，对奖赏行为的反馈减退，因此能评估抑郁程度；处理方法如下，经过20小时禁水禁食之后，所有动物被转移至安静无压力的环境，每笼一只大鼠，并且每个笼子内均有两种不同的饮用水，一种为1％蔗糖水溶液，另一种为普通饮用水；每只大鼠都确保能够自由饮水，在无应激的环境中接受时长为2小时的测试，测试结束后取走两瓶饮用水并进行称重以计算两种饮用水的摄入量；

根据以下公式计算每只大鼠的糖水偏好值

蔗糖偏好＝1％蔗糖水摄入量/(1％蔗糖水摄入量+普通水摄入量)×100％。

4.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S2中所述样本采集和处理包括样本采集前处理、样本采集及样本处理；

所述样本采集前处理具体为：对盐酸帕罗西汀抗抑郁阳性给药组每天接受10mg/kg剂量的盐酸帕罗西汀灌胃处理，其余动物接受等体积生理盐水灌胃，再次造模以及药物抗抑郁干预3周；

所述样本采集具体为：所有动物接受行为学实验后，以腹腔注射水合氯醛麻醉，首先通过门静脉以抗凝管采集外周血，然后充分震荡，使血液与抗凝剂充分混匀，对抗凝管中的血液样本，首先在3000rpm低速离心15分钟，分离血浆与血细胞，吸取上层血浆后分装至多个1.5mLEP管内，转移至-80℃冰箱保存；血样采集完成后，动物快速断头处死，以4℃超纯水冲洗脑组织中血块，除去多余肌肉、脂类物质后，快速分离前额皮层以及海马组织，称重后将前额皮层以及海马组织放入标记过的2.0mL冷冻管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存；

所述样本处理具体为：

血浆样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有上层血浆样本的的LEP小管，于室温解冻，涡旋混匀，取出500μL上层血浆样品以1:3的体积比加入甲醇并且在4℃，12000rpm高速冷冻离心20分钟，除去大分子蛋白类物质，取出500μL上清液进一步加入1.5mL超纯水稀释，转移到进样小瓶中等待测定；

前额皮层以及海马组织样本具体处理方法为从-80℃冰箱中取出分装后装有前额皮层以及海马组织样本的冷冻管，于室温解冻后，取出组织，用消毒过的手术剪剪取20mg样本转移至2mL离心管内，向其中加入1mL提取液；混合物充分混匀后，加入洗净消毒后的小钢珠一颗，将离心管放入Tissuelyser组织匀浆机，以50Hz的振动频率充分匀浆15分钟；待脑组织完全匀浆后，匀浆在4℃，12000rpm高速冷冻离心10分钟从而去除大分子蛋白类物质，离心后吸取200μL上清液转移至带内衬管的进样小瓶中等待测定。

5.根据权利要求4所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，所述抗凝管为用肝素钠抗凝的真空管；所述提取液包括按体积比为2:5:2的水、乙腈和三氯甲烷。

6.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S3中所述代谢组学平台为Ultimate 3000-Orbitrap MS戴安超高效液相色谱串联静电场轨道阱高分辨质谱仪；

其色谱条件为色谱分离柱为粒径是1.9μm Hypersile C₁₈色谱柱(100mm×2.1mm)，柱温维持在40℃；流动相A：含有0.1％甲酸的超纯水；流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈，流动相A和B的流速为0.4mL/min；自动进样器样品盘温度为4℃，进样体积为5μL；流动相A和B的梯度洗脱程序见下表：

流动相梯度洗脱程序

其质谱条件为：采用加热型电喷雾离子源(HESI)，正负离子切换同时扫描毛细管电离电压为+2.5kV/-3.5kV，毛细离子传输管温度为300℃；鞘气流速为50au；辅助气流速为10au；吹扫气流速为2au；分辨率为70,000；扫描离子范围为70-1050amu；AGC target为5E6。

7.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S3中所述非靶标性代谢轮廓分析具体为：以三个样本为一个集合，每个集合中包含一个对照组样本、一个模型组样本、一个给药组样本，每个样本均随机抽取，从而减少由仪器分析波动所引起的组间差异；在分析过程中，每十个样品后插入一个质控样的分析，以监测仪器运行状况，确保仪器的稳定性和重现性，保证结果的可靠性；同时，质谱仪每天以校正液进行正负离子质量轴校正，保证结果的准确性。

8.根据权利要求6所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S4具体为：首先对采集到的代谢组学质谱数据在SIEVE软件中进行背景扣除、峰匹配对齐、基峰校正以及归一化处理后，得到可以被统计学软件分析的包含变量编号、信号强度以及组别的并由精确质量数、保留时间以及峰面积组成的三维数据表。

9.根据权利要求8所述的一种基于代谢组学的动物模型抑郁程度评价的实验方法，其特征在于，步骤S5具体包括：

S51、以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性评估，具体是将所得三维数据表导入SIMCA-P13.0软件进行模式判别分析构建模型，获取模型参数以及样本在多位数学模型中的分布情况，所述判别分析包括主成分分析法(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法；另外再结合R语言2.11.1和SPSS17.0软件对所得三维数据表进行单变量统计分析筛选出不同组别之间的差异代谢物，选择三个样本中所共有的代谢物并将代谢组进行简化，利用相关性分析评价血浆代谢组改变与脑组织代谢组改变的相关性，评估以血浆代谢组反映脑组织改变的可行性；

S52、代谢组评价抑郁程度的方法，具体是对步骤S51中简化的代谢组在多样本间的相对含量进行二元Logistic回归分析，然后再以对照组和模型组数据集作为训练集构建新的PLS-DA模型，新模型中，横坐标为实际的行为学实验结果，纵坐标为根据训练集数据所拟合出的结果，以给药组的数据集作为测试集来验证通过代谢组来评价抑郁程度的可靠性。