一种高效液相色谱分离六神丸紫外吸收成分的方法与流程

本发明涉及色谱分析技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱分离六神丸紫外吸收成分的方法。

背景技术：

六神丸是一种拥有一百多年历史，享誉国内外的著名中成药。六神丸由六味药材配置而成，包括牛黄、珍珠、蟾酥、明雄黄、麝香、冰片。其具有清热解毒、消肿止痛的作用(李水福,黄龙森,郭文信.六神丸质量标准与质量问题.[J]时珍国药研究,1996,7(1)：57-58)，应用于咽喉肿痛、痈疡疔疮等。现代中药开发中，将六神丸应用于更多疾病如抗炎、镇痛、抗肝癌、抗肿瘤等(陈琦,李小军,贾美美,李玉桑,奉黎静,唐和斌.六神丸体外抗肝癌活性研究.[J]中国医院药学杂志.2014,34(19)：1627-1630)。对于六神丸成分的分析，曹阳等有较为全面报道(曹阳,梁琼麟,章弘扬,王义明,毕开顺,罗国安.中药复方六神丸中多类成分的多维液质系统筛查和鉴定.[J]分析化学.2008,36(1):39-46)。对于六神丸质量标准研究，吴银生等做了探索(吴银生.六神丸质量标准研究.[J]南京中医药大学学报.2002,18(4):232-233)。对于六神丸中大极性部分包括5-羟色胺和蟾毒色胺内盐报道较少，且未建立质量标准研究。

大部分的中药都是水煎剂，水溶剂提取物中大极性物质较多。由于大极性物质有出峰快、保留时间短、分离度低等高效液相色谱法分离难点，多数做中药药物研究的科研人员放弃了对这一部分物质的追究，这是不完善的。例如，六神丸中大极性部分中的两种物质，5-羟色胺和蟾毒色胺内盐是种吲哚衍生物。5-羟色胺在大脑皮层及神经突触内含量很高，它是一种抑制性神经递质，具有抗抑郁作用。而对六神丸中大极性物质研究鲜见报道，且未将其纳入质量控制范围，这就对六神丸的质量控制产生了安全隐患。

目前，对于大极性物质的分离，常用方法是加离子对试剂或使用交换离子对色谱柱，这种两种方法对色谱柱的损伤都较大，成本高。本发明拟采用常规C18色谱柱，通过延长大极性成分的保留时间，将5-羟色胺和蟾毒色胺内盐是种吲哚衍生物有效分离。本分离方法经不同复方验证，均有效果。这种方法为中药大极性成分的分离提供借鉴；而且成本低、适应性广，对实验设备要求低，适用于大部分实验室。

技术实现要素：

针对现有技术中对中药复方六神丸成分分离不完全的问题，本发明提供了一种能全面将六神丸中具有紫外吸收成分进行分离的方法，可将中药复方六神丸中具有紫外吸收的成分实现有效分离，特别是将其中大极性物质5-羟色胺和蟾毒色胺内盐是种吲哚衍生物实现有效分离。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明用采用常规C18色谱柱的高效液相色谱分离中药复方六神丸紫外吸收成分，利用液质联用鉴定其结构。建立能准确测定其成分含量的HPLC方法，从中药复方六神丸中分离纯化了紫外吸收成分，其中大极性部分5-羟色胺和蟾毒色胺内盐属于首次从六神丸中有效分离。在此基础上，以5-羟色胺、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等标准品为对照，用外标法测定六神丸中5-羟色胺、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量。

一种高效液相色谱法分离六神丸成分的改良方法，其步骤如下：

(1)样品溶液制备：取六神丸，经水提处理后将六神丸水提物制成供试品溶液；

具体为：取六神丸颗粒研磨成粉，加入超纯水中，超声处理，静置，取上清液，用旋转蒸发仪回收水得浸膏，再冷冻干燥得棕色粉末；取所得的棕色粉末溶于超纯水，并定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液；

(2)各标准品溶液制备：分别精密称取5-羟色胺、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等标准品，分别溶于超纯水定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用；

(3)定性检测：采用高效液相色谱法测定样品溶液，得到全面分离六神丸具有紫外吸收成分的指纹图谱，液质联用法分析出六神丸各成分；

(4)定量检测：采用高效液相色谱法分别测定样品溶液和标准品溶液，根据色谱峰面积，采用外标法确定六神丸中5-羟色胺、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量；

所述高效液相色谱法的色谱条件为：DIONEX ultimate 3000高效液相色谱仪，色谱柱为DIONEX C18色谱柱，250mm×4.6mm,5μm，流动相为乙腈-0.1v/v％三氟乙酸溶液，流动相体积流量为1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长为296nm，柱温为30℃，梯度洗脱程序：

0-3min，洗脱体系5v/v％乙腈，设计等度洗脱程序以延长保留时间，从而区分溶剂峰与信号峰；

3-13min，洗脱体系5-12v/v％乙腈，设计平缓梯度洗脱程序以使大极性成分较好分离；

13-15min，洗脱体系12-20v/v％乙腈，设计特快速梯度洗脱程序以缩短时间；

15-25min，洗脱体系20-30v/v％乙腈，设计缓速梯度洗脱程序以精细逐步调节，将相近的峰分离出来，同时为后面的快速梯度洗脱做基础；

25-30min，洗脱体系30-51v/v％乙腈，设计快速梯度洗脱程序以快速达到最佳平衡点；

30-50min，洗脱体系51v/v％乙腈，设计等度洗脱程序以将华蟾毒配基和酯蟾毒配基分离。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1)一步法实现六神丸所有紫外吸收成分的有效分离，首次将六神丸大极性物质5-羟色胺和蟾毒色胺内盐实现有效分离，为六神丸的有效成份确定、质量控制、深度开发以及临床推广提供新的科学依据和方法。

2)本方法操作简便，对实验设备要求少，可重复性高；在一般实验室就可开展，对色谱柱的损耗小，节约成本。

3)本方法对其它中药复方成分的分离分析具有参考价值。

附图说明

图1为六神丸样品1中各成分得到有效分离的高效液相色谱图；

图2为六神丸样品2中各成分得到有效分离的高效液相色谱图；

图3为样品2用不同色谱柱得到六神丸有效分离的高效液相色谱图；

图4为混合标准品溶液的高效液相色谱图，1、5-羟色胺；10、蟾毒它灵；11、华蟾毒它灵；12、蟾毒灵；13、华蟾酥毒基；14、脂蟾毒配基。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。应理解，以下内容不应以任何方式对本发明的保护范围加以限制。

实施例1：六神丸具有紫外吸收成分的分离鉴定

1、样品制备：取六神丸颗粒(上海雷允上药业有限公司，批号：090904)，研磨成粉，称取约90mg六神丸粉末溶于5mL超纯水；超声处理30min，静置，取上清。以上述方法，将沉淀用5ml超纯水再提取，超声处理30min。合并两次得到的上清液，用旋转蒸发仪回收水得浸膏，再冷冻干燥得棕色粉末。取所得棕色粉末6.50mg溶于超纯水，定容于5mL容量瓶，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到样品1，备用。

2、高效液相色谱与质谱条件

2.1高效液相色谱条件：DIONEX ultimate 3000高效液相色谱仪，色谱柱为DIONEX C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈-0.1v/v％三氟乙酸，流动相体积流量为1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长为296nm，柱温为30℃，洗脱程序：

0-3min，5v/v％乙腈(5v/v％指乙腈占混合流动相乙腈和0.1v/v％三氟乙酸总量的体积分数，下同)，设计等度洗脱程序以延长保留时间，从而区分溶剂峰与信号峰；

3-13min，5-12v/v％乙腈，设计平缓梯度洗脱程序以使大极性成分较好分离；

13-15min，12-20v/v％乙腈，设计特快速梯度洗脱程序以缩短时间；

15-25min，20-30v/v％乙腈，设计缓速梯度洗脱程序以精细逐步调节，将相近的峰分离出来，同时为后面的快速梯度洗脱做基础；

25-30min，30-51v/v％乙腈，设计快速梯度洗脱程序以快速达到最佳平衡点；

30-50min，51％v/v乙腈，设计等度洗脱程序以将华蟾毒配基和酯蟾毒配基分离。

2.2质谱条件：全扫描质谱，质量扫描范围M/Z 100～800amu，干燥气流速15L/min，干燥气温度320℃，毛细管电压2.6kV，源电压4KV，总电流100mA，毛细管温度320℃，检测方式MSⁿ(n＝1～3)。

3、六神丸具有紫外吸收成分的指纹图谱

结果：分离度均大于1.5，拖尾因子在0.90-1.17之间，理论塔板数以各色谱峰计均在10000以上，见表1。将六神丸中具有紫外吸收的所有成分实现有效分离。高效液相色谱全面分离六神丸具有紫外吸收的成分的指纹图谱见图1。

表1样品1六神丸各成分的分离系数

根据2.2的质谱条件，对1-14号峰进行定性分析，通过标准品对比分析，我们确定1号峰为5-羟色胺，10号峰为蟾毒它灵；11号峰为华蟾毒它灵；12号峰为蟾毒灵；13号峰为华蟾酥毒基；14峰为脂蟾毒配基。其中2号峰的分子量为218，根据分子量和保留时间与两篇相关文献对比，推测2号峰为蟾毒色胺内盐(曹阳,梁琼麟,章弘扬,王义明,毕开顺,罗国安.中药复方六神丸中多类成分的多维液质系统筛查和鉴定.[J]分析化学.2008,36(1):39-46；张屏.不同基原蟾酥类的指纹图谱研究.沈阳药科大学博士学位论文.2006,45p.)。

实施例2：运用实施例1的分析方法检测不同批次的六神丸指纹图谱

1、样品制备：取六神丸颗粒(上海雷允上药业有限公司，批号：140701)，研磨成粉，称取约90mg六神丸粉末溶于5mL超纯水；超声处理30min，静置，取上清。以上述方法，将沉淀用5ml超纯水再提取，超声处理30min。合并两次得到的上清液，用旋转蒸发仪回收水得浸膏，再冷冻干燥得棕色粉末。取所得棕色粉末6.50mg溶于超纯水，定容于5mL容量瓶，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到样品2，备用。

2、高效液相色谱条件

高效液相色谱条件：DIONEX ultimate 3000高效液相色谱仪，色谱柱为DIONEX C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈-0.1v/v％三氟乙酸溶液，流动相体积流量为1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长为296nm，柱温为30℃，洗脱程序：

0-3min，5v/v％乙腈，设计等度洗脱程序以延长保留时间，从而区分溶剂峰与信号峰；

3-13min，5-12v/v％乙腈，设计平缓梯度洗脱程序以使大极性成分较好分离；

13-15min，12-20v/v％乙腈，设计特快速梯度洗脱程序以缩短时间；

15-25min，20-30v/v％乙腈，设计缓速梯度洗脱程序以精细逐步调节，将相近的峰分离出来，同时为后面的快速梯度洗脱做基础；

25-30min，30-51v/v％乙腈，设计快速梯度洗脱程序以快速达到最佳平衡点；

30-50min，51v/v％乙腈，设计等度洗脱程序以将华蟾毒配基和酯蟾毒配基分离。

3、六神丸具有紫外吸收成分的指纹图谱

结果：分离度均大于1.5，拖尾因子在0.90-1.13之间，理论塔板数以各色谱峰计均在10000以上。见表2，将六神丸中具有紫外吸收的所有成分实现有效分离。高效液相色谱全面分离六神丸具有紫外吸收的成分的指纹图谱见图2。

表2样品2六神丸各成分分离系数

实施例3：运用实施例1的分析方法检测不同色谱柱对六神丸指纹图谱的影响

1、样品制备：采用实施例2中样品2；

2、高效液相色谱条件

高效液相色谱条件：DIONEX ultimate 3000高效液相色谱仪，色谱柱为KROMASIL C18色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈-0.1v/v％三氟乙酸溶液，流动相体积流量为1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长为296nm，柱温为30℃，洗脱程序：

0-3min，5v/v％乙腈，设计等度洗脱程序以延长保留时间，从而区分溶剂峰与信号峰；

3-13min，5-12v/v％乙腈，设计平缓梯度洗脱程序以使大极性成分较好分离；

13-15min，12-20v/v％乙腈，设计特快速梯度洗脱程序以缩短时间；

15-25min，20-30v/v％乙腈，设计缓速梯度洗脱程序以精细逐步调节，将相近的峰分离出来，同时为后面的快速梯度洗脱做基础；

25-30min，30-51v/v％乙腈，设计快速梯度洗脱程序以快速达到最佳平衡点；

30-50min，51v/v％乙腈，设计等度洗脱程序以将华蟾毒配基和酯蟾毒配基分离。

3、六神丸具有紫外吸收成分的指纹图谱

结果：更换色谱柱后，六神丸中各成分分离效果几乎相同，分离度均大于1.5，拖尾因子在0.82-1.59之间，理论塔板数以各色谱峰计均在10000以上，如表3所示。尽管采用不同色谱柱测试，但其重现性较好，表明该分析测试方法得到的实验结果对满足条件的色谱柱型号的依赖性较低。见图3。

表3不同色谱柱分离样品2六神丸的分离系数

实施例4：运用实施例1的方法测定六神丸中各成分的含量

1、溶液制备

1.1样品制备

按照实施例1-2的方法制备样品1、2。

1.2标准品制备：分别精密称取5-羟色胺盐酸盐(编号：111656-200401，中国食品药品鉴定研究院)、华蟾毒它灵(编号：p24N7F25514，上海源叶生物科技有限责任公司)、蟾毒它灵(编号：p12O7F22619，上海源叶生物科技有限责任公司)、蟾毒灵(编号：W05D6Z7090，上海源叶生物科技有限责任公司)、华蟾酥毒基(编号：W10O7Z22424，上海源叶生物科技有限责任公司)、脂蟾毒配基(编号：PJ0727RB13，上海源叶生物科技有限责任公司)等标准品10.00mg，分别溶于超纯水，配成各标准品的1mg/mL的母液，六种标准品溶液均梯度稀释至0.33、0.11、0.037、0.012、0.004、0.001mg/mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

2、液相条件：同实施例1。

3、样品含量测定

在上述色谱条件下测定样品1、2。

结果：如图4(标准品HPLC图)所示(样品2的结果与样品1很相似，故不罗列谱图)。记录色谱峰面积，以对照品浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，进行线性回归分析，5-羟色胺y＝147.7x+0.1858，R²＝1；蟾毒它灵y＝176.69x+0.4679，R²＝0.999；华蟾毒它灵y＝160.27x+1.2218，R²＝0.999；蟾毒灵y＝150.63x-0.2965，R²＝0.9998；华蟾酥毒基y＝160.27x+1.2218，R²＝0.999、脂蟾毒配基y＝171.73x+0.0584，R²＝1，标准品在0.001～0.33mg/mL质量浓度范围内线性关系良好。根据标准品的线性曲线，计算出六神丸中5-羟色胺、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等成份分含量。相应成分的具体质量分数见表4。

表4不同批次六神丸中相应成分的质量分数