用于确定生物分子的尺寸的方法与流程

本发明涉及一种用于使用已知尺寸的标记分子由电场确定介质中分离的生物分子的尺寸的方法。

背景技术：

在许多技术领域中，重要的是正确地识别包含在样本中的生物分子。这可通过针对各种分离介质中的不同类别的生物分子的许多不同的分离和检测方法来执行。

一种已知的方式是通过电泳(用于分析样本中的蛋白质含量的常用技术)。

电泳是基于电场中的带电分子的移动性的分离技术。其主要用于大分子如蛋白质或核酸的分析和提纯。电泳通常通过将包含感兴趣的分子的样本加载到电压接着施加于其的多孔基质中的井中来执行。样本中的不同尺寸、形状和电荷的分子以不同速度移动穿过基质。在分离结束时，分子检测为基质中的不同位置处的带。基质可由许多不同材料(包括纸、醋酸纤维素，或由聚丙烯酰胺、琼脂糖或淀粉制成的凝胶)构成。在聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶中，基质还可在分离中用作尺寸选择筛。

因此，不同蛋白质在电场施加时取决于尺寸和电荷在凝胶中以不同速度迁移。两个或更多个样本可在相同的凝胶中分离。通过在单独泳道中分离或通过不同标记来将样本与彼此区分开。能够将尺寸指定给分离的蛋白质成分经常是基本的。这可通过将已知尺寸的专用尺寸标记蛋白质加载在凝胶中的相同或单独的泳道中来完成。在电泳分离发生之后，这些尺寸标记蛋白质的位置产生了尺寸范围，通过其，可使用通过指定尺寸校准曲线的校准程序来给未知尺寸的蛋白质指定尺寸。标记蛋白质沿分离方向的凝胶中的位置绘制为随已知尺寸变化，并且拟合这些数据点引起的校准曲线接着用于校准未知尺寸的蛋白质的尺寸。关于电泳领域的大体背景的另外的信息可在同一申请人的wo2013180642、us2003221963或wo2015079048中找到。

电泳的一个常见问题在于，凝胶中的污染可对于基准分子中的一些被误解，导致基准分子的错误识别，并且妨碍了这些生物分子与未知生物分子之间的准确尺寸比较。大体上，需要操作者评估结果并且除去错误数据来改进识别和尺寸评估。

相似的技术由us5273632、wo2005/015199和us4720786公开。

因此，需要的是用于正确地识别未知生物分子的改进方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于消除或至少最小化以上所述的问题。这通过根据所附独立权利要求的方法来实现，通过以下提供了用于识别未知生物分子的改进方法，

检测多个带，并且基于分离标准形成检测的标记序列和检测的未知序列，

确定每个检测的带的带性质，

将检测的标记序列的检测的带的带性质与形成已知标记序列的多个标记分子的已知带性质相比较，并且将得分指定给每个比较，所述得分基于带之间的相对距离、相对强度、预期距离和预期强度中的至少一种，

选择具有最高得分的比较，并且根据所述比较使检测的标记序列的检测的带的全部或子集与已知标记序列的所述多个标记分子相关联，以确定检测的标记序列的全部或子集的尺寸，以及

将检测的标记序列的带与检测的未知序列的带相比较，以基于标记分子的已知尺寸来确定检测的未知序列的每个识别的带的生物分子的尺寸。

或者通过以下提供了用于识别未知生物分子的改进方法，

检测来自泳道的多个数据点，并且创建检测的泳道图谱，

基于理论数据或包括多个标记分子的前一检测数据创建前一泳道图谱，

基于图谱对准计算来使检测的泳道图谱与前一泳道图谱对准以找出最佳对准，

基于检测的泳道图谱与前一泳道图谱的最佳对准来确定检测的泳道图谱中的多个标记分子的尺寸，

检测对应于来自另一个泳道的未知生物分子的多个数据点，

通过使对应于所述未知生物分子的数据点关联于多个标记分子的确定尺寸来确定未知生物分子的尺寸。

由此，标记分子的识别可改进，并且错误检测的风险降低，而不需要操作者，因此还改进了生物分子的尺寸的确定。

根据本发明的方面，通过将检测的序列的带性质与已知标记序列的已知带性质相比较，并且允许检测的序列中的附加带或遗漏带，但不允许改变检测的序列中的带的顺序来进行比较。由此，错误检测的风险进一步降低。

根据本发明的又一个方面，检测的带的带性质包括位置和强度中的至少一种。由此，检测的带与其它检测的带之间，或标记分子的检测的带和已知带的性质之间的相对距离和相对强度可确定并且用于进而确定得分。

根据本发明的又一个方面，通过将检测的标记序列的带与已知的标记序列的带的相对强度、相对强度、预期距离和/或预期强度相比较来确定得分。由此，检测的标记带与已知的标记带之间的这些性质中的相似性导致了较高得分，提高了使两者相关联的可能性。

根据本发明的又一个方面，分离标准在于检测的带在不同泳道中检测。由此，检测的未知带和检测的标记带可容易分离，并且便于随后的分析和比较。

根据本发明的又一个方面，分离标准在于检测的带具有不同颜色。由此，即使它们存在于同一泳道中，带也可容易地分成检测的标记带和检测的未知带，假定了检测的标记带具有一种颜色，而检测的未知带具有另一颜色。作为备选，标记分子以多种颜色标记，以使对应于一个分子量的每个带具有一种颜色的高强度和另一种颜色的低强度，并且对应于另一分子量的相邻带具有相反的强度和颜色分布。因此，强度比可用于进一步协助正确地识别每个带。

根据本发明的又一个方面，检测的标记序列的检测的带用于创建校准曲线，并且检测的未知序列的生物分子的尺寸通过将检测的未知序列的检测的带的带性质与所述校准曲线相比较来确定。

此外，根据本发明，提供了一种用于确定生物分子的尺寸确定的质量的方法，其包括执行用于确定同一样本上的本文中所述的生物分子的尺寸的两种方法，以及比较根据该方法的标记分子的确定的尺寸来确定分析的质量。

此外，有利的是提供构造成执行根据本发明的方法的软件，以及提供构造成储存所述软件的计算机可读介质。

鉴于以下详细描述，本发明的许多附加优点和益处将变得容易显而易见。

附图说明

现在将参照附图来更详细描述本发明，在该附图中

图1公开了包括比较带性质的方法的步骤的示意代表；

图2公开了一组检测的带和代表已知标记分子的一组值；

图3公开了包括对准泳道图谱的方法的步骤的示意代表；

图4公开了检测的泳道图谱和对应于已知标记分子的前一泳道图谱；

图5a公开了包括使用具有高损失的动态编程对准泳道图谱的方法的实施；以及

图5b公开了包括使用具有低损失的动态编程对准泳道图谱的方法的实施。

具体实施方式

用于确定未知生物分子的尺寸的方法适合于以用于分离凝胶或膜中的不同尺寸的分子的技术(如例如电泳)使用。在下文中，将参照电泳来描述根据本发明的方法，但将理解，它们还可应用于其它分离分子的方法。

因此，包含未知尺寸的生物分子的至少一个样本和包含多个标记分子的另一个样本放在凝胶中的泳道中。在大多数情况中，样本放在不同泳道中，但它们还可放在同一泳道中。在经受电场之后，生物分子和标记分子在凝胶中迁移，并且可以以离散的带或多个数据点的形式检测它们的放置。大体上，用于电泳的标记分子以不同量供应，导致了不同强度的带，并且允许了在识别标记分子时使用距离或位置和强度两者。

图1示意性地公开了根据本发明的优选实施例的方法的步骤，其中比较带性质来确定未知生物分子的尺寸。因此，在第一步骤101中，基于分离标准，多个离散带被检测并且形成为两个序列。分离标准可为同一泳道中检测的带聚集在同一序列中，而另一泳道中检测的带形成另一序列，或者可为一种颜色的带置于一个序列中，而另一颜色的带置于另一序列中。使用的颜色可为任何类型，如，荧光色、能够由红外线检测的颜色或能够由可见光检测的颜色，并且可由任何适合的检测手段检测。

因此，即使它们存在于同一泳道中，带也可容易地分成检测的标记带和检测的未知带，假定了检测的标记带具有一种颜色，而检测的未知带具有另一颜色。作为备选，标记分子以多种颜色标记，以使对应于一个分子量的每个带具有一种颜色的第一强度和另一种颜色的第二强度，第一强度和第二强度中的一种高于另一种，并且另一种较低，并且对应于另一分子量的相邻带具有强度和颜色的相反分布。因此，强度比可用于进一步协助正确地识别各个带。

还可使用其它分离标准。

序列中的一个为检测的标记序列，其包含对应于标记分子的样本的带，而另一个是检测的未知序列，其包含对应于未知尺寸的生物分子的样本的带。取决于施加电场之前的样本的放置，带可在凝胶中位于仅一个泳道中，或多个泳道中。

在第二步骤102中，确定每个检测的带的带性质。带性质包括关于带的强度和/或带的位置，即，从每个带到其它带或参照物的距离的信息。作为优选，多个带的强度和距离可组合成产生相比于彼此的带的相对强度和相对距离。

在第三步骤103中，各个带的带性质与形成已知标记序列的标记分子的已知的带性质相比较。作为优选，标记分子根据已知标记序列中的尺寸来分类，以最大或最小的开始，并且分别朝最小或最大的发展。因此，已知的标记序列显示了泳道中的标记分子应当在检测的带之中出现的顺序。已知的带性质优选至少是与第二步骤102中确定的那些相同的性质，以允许检测的标记序列的检测带中的一些利用已知标记序列中的标记分子的识别。

在第三步骤103中的比较期间，检测的带以如下方式与已知的标记序列相比较，以便找出检测的带序列与已知标记序列之间令人满意的匹配。因此，该比较允许了检测的带序列中的附加带或遗漏带的存在，但不允许检测的带序列中的独立检测带切换位置。各个比较被给予得分，以反映各个检测的带与已知标记序列中的标记分子的对应有多好，以及包括检测的带的检测的标记序列整体上可与已知标记序列的匹配有多好。

图2公开了由象征不同强度的变化宽度的矩形代表的多个检测的带与由以kda的表示它们的尺寸的数字代表的多个已知标记之间的比较。得分优选基于单独和与彼此组合的带的强度和放置。因此，对于单独的每个带，绝对强度和带在凝胶中行进的绝对距离可用于相对于已知标记的比较。在组合不同带的带性质时，各个带在凝胶中行进的距离之间的相对距离，以及相对强度(即，相比于另一个带的强度的一个带的强度)还可确定并且用于比较。

取决于检测的标记序列中的检测带的绝对相对性质与已知标记序列的已知性质匹配多好，给予得分。由于两个带将与彼此交换位置的可能性非常低，故保持了检测的标记序列和已知的标记序列两者中的带的顺序。然而，由于凝胶的污染、凝胶性质和其它因素，故可能的是检测到带实际上并不对应于标记分子(由图2中的围绕带的环示出)，或者标记分子不能检测为离散的带(由图2中的围绕表示标记分子的数字的环示出)。因此，在执行比较时，在给予得分时将这一切考虑在内。

在第四步骤104中，选择具有最高得分的比较。该比较表示检测的标记序列的带中的哪些对应于已知标记序列中的带，并且它们中的哪些对应于其标记分子。大体上，仅检测的带的子集将看作是对应于标记分子，并且其余的是污染物等。带的该子集接着根据比较与标记分子相关联。

在第五步骤105中，分析检测的未知序列中的带。基于它们的带性质和尤其是它们与同标记分子相关联的带之间的相对距离，可确定对应于带的生物分子的尺寸。

在一些实施例中，检测的标记序列的识别的标记分子用于创建校准曲线，并且检测的未知序列的各个带中的生物分子的尺寸通过与该曲线比较来识别。

由于根据本发明的方法，故样本可提供在同一泳道或不同泳道中，并且由于使用了分离标准，故仍可正确地识别为标记分子或未知生物分子。还有可能忽略导致附加带并且可否则针对标记分子被误解的污染。

由图3-5公开了根据本发明的另一个优选实施例的备选方法，其中多个数据点在第一步骤201中从泳道检测，并且用于创建检测的泳道图谱，将信号强度绘制为随分离距离变化。

在第二步骤202中，基于给出人工尺寸标记泳道图谱的理论数据或给出实验尺寸标记泳道图谱的之前检测的数据来创建前一泳道图谱。前一泳道图谱包括对应于已知尺寸和强度(类似于上文参照图1-2论述的已知带性质)的多个标记分子的数据。

在第三步骤203中，检测的泳道图谱基于图谱对准计算来与前一泳道图谱对准以找出最佳的对准。图4公开了附图的上部中的检测的泳道图谱，以及附图中的下部中的前一泳道图谱和数字的实例。凝胶中的每个类型的分子引起了检测的泳道图谱中的一个峰，但与由图1-2公开的前述方法的差别在于它们现在均具有给出关于标记分子的性质的附加信息的峰形状。通过使泳道图谱与彼此对准，该附加信息用于进一步改进标记分子的识别。仍有可能的是，检测的泳道图谱中的标记分子失去，如，由检测的泳道图谱上的环示出的，或者附加的峰出现，这并未匹配标记分子中的任一个，并且因此在对准图谱时考虑这一切。

图谱对准计算可基于任何适合的方法来将一个图谱与另一个相比较，并且以最佳可能的方式对准它们，但优选基于参数化转移、扩张或压缩来处理数据和对准图谱。为了将一个对准识别为最佳对准，使用了相关，如，皮尔逊相关。作为备选，图谱对准计算可基于动态编程，引入了曲线中生成间隙的损失。

图5a-5b示出了使用动态编程对准泳道图谱的实例。在图5a中，使用了高损失，导致了曲线的非常差的对准。在图5b中，在另一方面，使用了低损失，允许了曲线的非常好拟合。

在第四步骤204中，基于检测泳道图谱与前一泳道图谱的最佳对准，确定检测的泳道图谱中的多个标记分子的尺寸。因此，最佳对准允许了识别标记分子，并且提供其它泳道中的未知生物分子的随后尺寸确定的尺寸参照物。

在第五步骤205中，检测对应于另一个泳道中的未知生物分子的多个数据点，而在第六步骤206中，通过使对应于所述未知生物分子的数据点关联于多个标记分子的确定尺寸来确定未知生物分子的尺寸。

以上所述的方法还可以以如下方式在同一凝胶上独立地使用，使得产生多个检测的带和检测的泳道图谱，并且执行评分和对准来识别标记分子。根据图1-2和图3-5的方法，结果可接着比较来创建多个分析的评估。如果两个方法生成独立于彼此的标记分子的相同识别，由此可见质量为好的，而差异可解释为低质量分析。对于其中确定质量为低的情况，可对操作者生成需要人工评估的信号，或者分析应当再次执行并且可产生不同的结果。

为了进一步便于使用以上公开的方法中的任一种识别标记分子，还有可能使用两种颜色，并且使相邻标记分子的强度交替。因此，可独立于彼此分析单独两组的带或峰，或者两组可组合成形成各个标记分子的改进的识别的比率。其还将便于分析来以一种、两种或更多种颜色来标记各个标记分子，并且不同颜色信号之间的比率用于使得更容易识别这些标记。

方法的步骤借助于软件适合地执行，该软件储存在计算机可读介质，如，硬盘驱动器、cdrom、usb等中。

将注意，根据方法的步骤可在一些情况中以不同顺序执行，并且一些步骤可同时地执行，而并未脱离所附权利要求的范围。