本发明总体上涉及用于对样本进行荧光分析的设备和方法，并且更具体地涉及用于基于荧光的流式细胞术的设备和方法。
荧光成像具有各种生物医学应用，例如用于获得关于生物标本分子组成的信息。在生物医学流式细胞术中，由外源和/或内源细胞荧光团发射的荧光辐射被收集并分析以得出关于细胞的化学特性和/或物理特性的信息。
然而，在常规的基于荧光的流式细胞术中，采集以高速流动的细胞的无模糊图像或者诸如亚毫秒生化动力学等其他快速现象可能是具挑战性的。具体地，许多荧光团在千赫范围内以成像帧速率与样本的短曝光耦合的弱光学发射使得难以采集无模糊图像。而且，许多常规系统仅在一种成像模式下进行操作并且因此无法为样本分析提供足够的灵活性。
从而，需要用于荧光分析的增强方法和系统，并且具体需要用于执行基于荧光的流式细胞术的方法和系统。
技术实现要素：
在一个方面，公开了一种用于执行细胞术的系统，所述系统包括：激光器，用于生成具有适合于激发至少一个荧光团的中心频率的激光束；声光偏转器，用于接收所述激光束并且生成多个成角度分隔开的激光束，每个成角度分隔开的激光束具有相对于所述中心频率的射频(rf)偏移。所述成角度分隔开的激光束包括本地振荡器光束(lo光束)和多个rf梳状光束，其中，所述光束中的每一个展现出相对于所述中心激光频率的射频偏移。光学元件沿着与所述rf梳状光束的传播路径不同的传播路径来引导所述lo光束。顶帽光束成形器接收所述lo光束并且向其赋予顶帽强度分布曲线，例如沿着与其传播方向垂直的平面内的一个方向。所述系统进一步包括：分束器，接收所述顶帽状lo光束和所述rf梳状光束并且通过所述光束的空间重叠来提供组合光束；以及至少一个光学元件(例如，透镜)，用于将所述组合光束引导至可包括多个细胞的样本上，所述细胞中的至少一些与所述荧光团相关联，从而使得lo光束同时照射所述样本的多个空间位置(例如，当所述样本流经流式细胞时)，并且所述rf梳状光束中的每一个照射所述空间位置中的不同空间位置以便在所述空间位置处引发来自所述荧光团——如果存在的话——的荧光辐射。从所述样本位置中的每一个发射的所述荧光辐射展现出同所述lo光束与所述rf梳状光束中照射那个样本位置的一个梳状光束之间的频率差相对应的拍频。
在一些实施例中，所述射频(rf)偏移之间的频率差小于所述荧光团的光谱吸收峰值的fwhm(半峰全宽)。通过示例的方式，所述射频偏移在约10mhz到约250mhz的范围内，例如在约50mhz到约150mhz的范围内。在一些实施例中，所述射频偏移以约0.1mhz到约4mhz范围内的频率彼此分隔开
在一些实施例中，上述系统进一步包括透镜，所述透镜布置在所述分束器的下游以用于将所述顶帽状lo光束和所述rf梳状光束聚焦到中间平面上，从而使得所述顶帽lo光束与所述rf梳状光束中的每一个具有重叠。所述顶帽状lo光束在每个重叠位置处的强度分布曲线可与其在另一重叠位置处的分布曲线基本上完全相同。在一些情况下，所述lo光束在此中间平面内的线性范围(例如，在此平面内沿着水平维度的范围)基本上等于所述成角度分隔开的rf梳状光束的线性范围(例如，所述rf梳状光束之间的最大水平距离)。所述顶帽状lo光束在顶帽方向上(沿着所述光束的伸长方向)优选地具有基本上均匀的极化。
通过示例的方式，在一些实施例中，所述rf梳状光束具有高斯强度分布曲线，并且所述顶帽状lo光束的强度基本上等于所述高斯强度分布曲线的最大强度。进一步地，所述rf梳状光束的极化和所述顶帽状lo光束的极化可以对准。
所述系统可包括射频发生器，所述射频发生器用于同时生成对应于所述射频偏移的射频并且将所述射频施加到所述声光偏转器以生成所述lo光束和所述rf梳状光束。在一些实施例中，所述射频发生器包括直接数字合成器(dds)rf梳状发生器。在一些实施例中，电子功率放大器可放大由所述射频发生器生成的射频驱动信号以施加至所述声光偏转器。控制器可控制所述射频发生器，例如用于在不同的操作模式下操作所述系统(如下文进一步讨论的)和/或用于调节施加到所述声光偏转器的驱动信号的振幅和/或频率。
所述系统可进一步包括用于检测从所述样本发射的所述荧光辐射(如果有的话)并且生成时域荧光信号的一个或多个光电检测器(例如，一个或多个光电倍增管)。在一些情况下，适当的滤波器(例如，光学带通滤波器)布置在所述光电检测器的前方以允许传输感兴趣的荧光频率，同时阻挡不期望的辐射频率。
在一些实施例中，激发辐射(即所述lo光束和所述rf梳状光束的组合)可同时激发所述样本内的多个荧光团。在一些这类实施例中，所述系统可包括多个光电检测器，所述光电检测器中的每一个用于检测从那些荧光团之一发射的荧光辐射。在一些实施例中，适当的滤波器(例如，带通滤波器)布置在所述光电检测器中的每个光电检测器的前方，所述滤波器允许以感兴趣的荧光频率向对应的检测器传输辐射，同时阻挡不期望的辐射。
在一些实施例中，物镜可由分色镜经由反射接收激发辐射(即所述lo光束和所述rf梳状光束的组合)并且可将激发辐射聚焦到所研究样本上。由所述样本发射的荧光辐射可通过所述物镜和所述分色镜以便经由一个或多个透镜被聚焦到所述光电检测器上。在经由多个光电检测器(例如，光电倍增管)检测与来自所述样本内的多个荧光团的荧光发射相对应的多个荧光频率的一些实施例中，每个光电检测器可与经由反射从其接收荧光辐射的适当分色镜相关联，所述荧光辐射具有与来自所述荧光团之一的荧光发射相对应的频率。所述分色镜可允许与其他荧光团相对应的荧光频率通过以便由其他下游检测器进行检测。
在一些实施例中，由所述样本发射的所述荧光辐射可例如经由一个或多个透镜耦合至光纤。所述光纤可从接收所述荧光辐射的远端延伸至所述辐射离开所述光纤的近端。在一些实施例中，光学地耦合至所述光纤的所述近端的输出透镜促进将离开所述光纤的所述荧光辐射引导至一个或多个光电检测器上。
所述系统进一步包括分析模块，所述分析模块与一个或多个光电检测器进行通信，以便从所述(多个)光电检测器接收一个或多个时域荧光信号并且重构所述样本的一张或多张荧光图像。例如，所述分析模块可提供对所述荧光信号的频率解复用以便确定所述拍频，并且可通过将所述拍频与发射以那些拍频调制的荧光辐射的所述样本的空间位置进行关联来生成所述样本的荧光图像。通过示例的方式，在一些实施例中，那些空间位置可沿着所述样本的水平维度。在一些实施例中，在所述样本流经流式细胞时，来自所述样本的不同部分(例如，所述样本的不同水平范围)的荧光辐射被收集并分析以生成所述样本的二维荧光图像。
在一些实施例中，所述分析模块通过以下步骤来重构所述样本的荧光图像：(1)获得对所述荧光信号的至少一部分的傅里叶变换(例如，fft)以便获得所述信号的频率分量，所述频率分量对应于所述拍频；(2)针对每个频率分量(拍频)，计算那个频率分量的振幅的度量，例如通过获得那个频率分量的实部和虚部的平方和的平方根，以便提供与对应于那个拍频的所述图像的位置相对应的像素值。
在一些实施例中，所述分析模块被配置用于通过使所述检测到的荧光信号数字化(例如，在放大之后)并且生成经数字化的荧光信号的若干副本来实现对所述荧光信号的频率解复用，其中，所述数字化副本的数量(n)对应于与rf梳状光束相关联的频率的数量。所述荧光信号的每个数字化副本与正弦波和余弦波相乘以便生成多个中间信号，所述正弦波和余弦波的频率与等于所述rf梳状光束之一的频率与所述lo光束的频率之差的拍频相对应。每个中间信号被传递通过低通滤波器，所述低通滤波器的带宽等于所述rf梳状频率之间的频率间隔的一半。针对与所述rf梳状频率之一相对应的每个拍频，获得与那个频率相对应的所述两个经滤波中间信号的平方和的平方根以作为与由所述lo光束和发射以那个拍频调制的荧光辐射的所述rf梳状光束照射的所述样本位置相对应的图像像素的振幅的度量。
在一些实施例中，所述分析模块被配置用于通过生成所述数字化荧光信号的若干副本来实现对所述检测到的荧光信号的频率解复用，其中，所述数字化副本的数量(n)对应于与所述rf梳状光束相关联的频率的数量。所述数字化荧光信号的每个副本通过将那个信号传递通过带通滤波器被滤波，所述带通滤波器以与所述rf梳状光束之一相关联的拍频为中心。包络检测器被用于估计与那个频率相对应的每个像素的振幅。
在一些实施例中，上述系统进一步包括用于生成所述样本的明场图像的第一检测臂、以及用于生成所述样本的暗场图像的另一检测臂。所述明场检测臂可例如相对于所述样本流经的流式细胞被定位，以便在正向方向上即沿着基本上与激发辐射在进入所述流式细胞时的传播方向平行的方向接收激发辐射(即经组合的lo和rf梳状光束)。进一步地，所述暗场检测臂可例如相对于所述流式细胞被定位，以便沿着基本上与激发辐射在进入所述流式细胞时的传播方向正交的方向接收由所述样本散射的所述激发辐射。
在一些实施例中，所述明场检测臂和暗场检测臂中的每一者均包括一个或多个透镜，所述一个或多个透镜用于在与所述激发辐射的传播方向不同的方向上将透射通过所述流式细胞的辐射或由所述样本散射的辐射分别聚焦到光电检测器(例如，光电倍增管)上。在一些情况下，适当的滤波器(例如，带通滤波器)可以放置在所述光电检测器的前方以允许通过期望的辐射频率(例如，激发频率)，同时阻挡不期望的辐射频率。
在一些情况下，所述分析模块被配置用于经由所述明场和/或所述暗场与所述荧光图像的重叠来生成合成图像。
在相关方面，公开了一种流式细胞术的方法，所述方法包括：通过将顶帽状激光束(lo光束)与彼此射频偏移的多个激光束(rf梳状光束)进行叠加来生成激发光束，其中，所述激发光束能够引发来自至少一个荧光团的荧光，并且将所述激发光束引导至样本上以激发所述荧光团——如果样本中存在的话——从而使其发射荧光辐射。所述lo光束和所述rf梳状光束的叠加使得对与所述rf梳状光束和所述lo光束之间的频率差相对应的多个拍频进行空间编码。所述荧光辐射被检测并且进行频率解复用以便生成所述样本的荧光图像。
在一些实施例中，生成所述样本的明场图像和暗场图像，这可补充由所述荧光图像提供的信息。在一些实施例中，上述系统进一步包括用于对所述样本上的多个空间位置处的荧光团执行荧光寿命测量以形成荧光寿命图像的子系统。所述子系统包括用于检测组合激发光束并且响应于所述检测而生成激发信号的光电检测器。所述分析模块与所述光电检测器进行通信，以便接收所述检测到激发信号并且对与所述激发信号相关联的拍频进行解复用从而确定所述样本上的每个空间位置处的所述拍频中的每个拍频的相位。所述分析模块进一步被配置用于确定与所述检测到的荧光信号相关联的所述拍频中的每个拍频的相位，并且将与所述组合激发光束相关联的每个频率的相位与同所述荧光信号相关联的对应拍频的相位进行比较从而在所述样本上的多个空间位置处执行荧光寿命测量。
在相关方面，公开了一种用于执行流式细胞术的系统，所述系统包括：激光器，用于生成具有适合于激发至少一个荧光团的频率的激光束；声光偏转器(aod)，优选地为单个声光偏转器，被配置用于接收所述激光束；射频发生器，用于向所述aod施加一个或多个驱动信号；以及控制器，用于控制所述射频发生器从而提供三种操作模式。所述操作模式包括：第一操作模式，在所述第一操作模式下，所述控制器使所述频率发生器向所述aod同时施加多个射频驱动信号，以便生成用于同时照射样本的多个空间位置的多个射频偏移光束；第二操作模式，在所述第二操作模式下，所述控制器使所述频率发生器连续向所述aod施加多个射频驱动信号，以便在不同的时间利用多个射频偏移光束来照射所述样本；以及第三操作模式，在所述第三操作模式下，所述控制器使所述频率发生器向所述aod施加单个射频驱动信号，以便在单个频率下利用光束来照射所述样本。在某些实施例中，由所述射频偏移光束照射的所述空间位置沿着单个维度被定位，从而使得所述射频偏移光束沿着单个平面辐照两个或更多个位置。例如，所述射频偏移光束可以沿着与流动流的纵轴正交的平面照射空间位置。每个射频偏移光束可以在样本处(例如，在流动流的表面处)彼此分离0.001μm或更多，诸如分离0.005μm或更多、诸如分离0.01μm或更多、诸如分离0.05μm或更多、诸如分离0.01μm或更多、诸如分离0.05μm或更多、诸如分离0.1μm或更多、诸如分离0.5μm或更多、诸如分离1μm或更多、诸如分离2μm或更多、诸如分离3μm或更多、诸如分离5μm或更多、诸如分离10μm或更多、诸如分离15μm或更多、诸如分离25μm或更多、诸如分离50μm或更多。
在相关方面，所述系统可包括光学元件，所述光学元件用于接收所述射频偏移光束中的一个射频偏移光束(在本文中为“本地振荡器(lo)光束”)并且沿着与其他频率偏移光束(在本文中为“rf梳状光束”)的传播路径不同的传播路径来引导所述lo光束。所述系统可进一步包括：顶帽光束成形器，用于向所述lo光束赋予顶帽强度分布曲线；以及一个或多个光学元件，所述光学元件用于在所述第一操作模式下将所述顶帽状lo光束与所述rf梳状光束进行组合以形成用于照射所述样本的合成激发光束。
通过参考以下详细说明、结合以下简要描述的相关联附图，可获得对本发明的各方面的进一步理解。
附图说明
图1示意性地描绘了一种根据本发明的实施例的系统，
图2a是在垂直于高斯光束的传播方向的平面内的所述光束的示意性、示例性分布曲线，
图2b是通过将图2a中所示的高斯光束通过顶帽光束成形器并聚焦所述光束成形器的输出光束而获得的示意性、顶帽光束分布曲线，
图3示意性地描绘了示例性顶帽光束成形器的部件，
图4示意性地描绘了多个rf梳状光束的横截面光束分布曲线，
图5示意性地描绘了图4中描绘的rf梳状光束的叠加以及具有顶帽光束成形器的lo光束，
图6示意性地描绘了图5中示出的照射所分析样本的组合光束，
图7示意性地描绘了假设荧光团的示例性能级，
图8示意性地描绘了与图7的假设荧光团相对应的吸收曲线，
图9a示意性地描绘了根据本教导的实施例的检测系统，所述检测系统包括用于传输荧光辐射的光纤，
图9b示意性地描绘了根据本教导的实施例的另一检测系统，其中，荧光辐射传播通过自由空间到达多个光电检测器，
图9c示意性地描绘了用于在本教导的一些实施例中使用的明场图像生成臂和暗场图像生成臂。
图9d示意性地描绘了用于在本教导的一些实施例中使用的检测系统，所述检测系统包括用于生成明场图像的检测臂、以及集成了检测从样本散射的激发辐射以及由所述样本发射的荧光辐射的能力的检测臂，
图10示意性地描绘了由根据本发明的系统的实施例中的光电检测器生成的荧光信号可由放大器进行放大并且经放大的信号可由分析模块进行分析以便构建所分析样本的荧光图像，
图11a和图11b描绘了根据本发明的实施例的方法中的各步骤，以用于分析通过利用由多个rf梳状光束和顶帽分布曲线的lo光束组成的组合光束照射样本而获得的荧光信号，
图12示意性地描绘了根据本发明的实施例的分析模块的示例性硬件实现方式的所选部件，
图13a和图13b描绘了根据本发明的实施例的另一种方法中的各步骤，以用于分析通过利用由多个rf梳状光束和顶帽分布曲线的lo光束组成的组合光束照射样本而获得的荧光信号，
图14a和图14b描绘了根据本发明的实施例的又另一种方法中的各步骤，以用于分析通过利用由多个rf梳状光束和顶帽分布曲线的lo光束组成的组合光束照射样本而获得的荧光信号，
图15a示意性地描绘了由顶帽分布曲线的光束以单个激发频率对样本进行的照射，
图15b是根据本教导的实施例的系统的示意性视图，所述系统允许荧光寿命测量和荧光寿命成像，
图16a是被通过使用根据本教导的实施例的细胞术系统获得的8种离散级荧光染料染色的聚苯乙烯微球的暗场强度与明场强度的散点图，
图16b示出了由多个所述聚苯乙烯微球发射的红色荧光(pe)与绿色荧光(fitc)的散点图，其中，数据是通过将图16a中示出的所述图的矩形部分作为门限获得的，
图16c和图16d是与图16b中示出的数据相对应的直方图，
图17a示出了包含被抗cd45-fitc、和使用根据本教导的细胞术系统获得的碘化丙啶染色的固定外周血白细胞的样本的明场图像、暗场图像和荧光图像，其中，所述样本还包含被钙黄绿素-am染色的一部分活hela细胞，
图17b是散点图，在所述散点图中，群体a表示白细胞，并且群体b表示图17a为其提供图像的样本中的hela细胞，
图18a示出了包含被抗cd45-fitc、和使用根据本教导的实施例的细胞术系统获得的碘化丙啶染色的固定外周血白细胞的样本的明场图像、暗场图像和荧光图像，其中，所述样本添加有被抗epcam-fitc和碘化丙啶染色的一小部分固定mcf-7细胞，并且
图18b是散点图，在所述散点图中，群体a表示白细胞，并且群体b表示图18a为其提供图像的样本中的mcf-7细胞。
具体实施方式
本教导总体上涉及用于对样本执行荧光分析的方法和系统。如下所讨论的，在一些实施例中，根据本教导的系统可在三种操作模式下进行操作以用于执行细胞术。除非另有说明，否则以下用于描述本教导所使用的各个术语在本领域中均具有其普通含义。例如，术语“荧光团”在本文中与其在本领域中的惯用含义一致地被用于指代可响应于由激发辐射进行的照射而发射辐射的荧光化合物。
术语“细胞术”和“流式细胞术”也与其在本领域中的惯用含义一致地被使用。具体地，术语“细胞术”可指代用于识别和/或分选或以其他方式分析细胞的技术。术语“流式细胞术”可指代细胞术技术，在所述细胞术技术中，可识别、和/或分选、或以其他方式分析流体流中存在的细胞，例如通过利用荧光标记对其进行标记并且经由辐射激发来检测所述荧光标记。术语“约”和“大体上”在本文中用于指示相对于包括数值的特性的10％、或5％的最大变化。
图1示意性地描绘了根据本教导的实施例的用于执行细胞术的系统10，所述系统可在三种操作模式下进行操作。如以下更详细讨论的，在一种操作模式下，所研究样本可同时利用多个激发频率进行照射，所述激发频率中的每一个可例如通过偏移激光束的中心频率来获得。更具体地，多个样本位置可由通过将参考激光束(在本文中亦被称为本地振荡器光束)与多个射频偏移激光束进行混合而生成的激光束进行同时照射，从而使得每个样本位置由所述参考光束和所述射频偏移激光束之一来照射以便引发在那个位置处的感兴趣的荧光团(如果存在的话)。在一些实施例中，所述参考光束可经由激光束的射频偏移而自行生成。因此，所述样本的每个空间位置可利用与参考光束的频率和射频偏移光束中的一个射频偏移光束的频率之间的差相对应的不同拍频来“标记”。换言之，由荧光团发射的荧光辐射将在空间上对拍频进行编码。荧光发射可被检测并且其频率分量可被分析以便构建样本的荧光图像。
在另一种操作模式下，可在一定时间间隔上由激光束在多个激发频率下连续照射样本。在一些这类实施例中，所述激发频率可通过将时变驱动信号施加到接收激光束的声光偏转器(aod)来获得。在许多实施例中，所述激光束的频率在几百太赫(thz)范围内，例如在约300thz到约1000thz的范围内。施加到aod的驱动信号通常在射频范围内，例如在约10mhz到约250mhz的范围内。激光束通过aod生成了多个衍射光束，每个衍射光束对应于不同的衍射级。虽然第零个衍射光束未展现出相对于输入激光束的频率的频偏，但是高阶衍射光束展现出相对于与驱动信号的频率或其倍数相对应的输入激光束的频率的频率偏移。在一些实施例中，具有频率与由驱动信号偏移的输入激光束的频率相对应的一阶衍射光束被用作激发光束以用于激发感兴趣的荧光团(如果所分析样本中存在的话)。在驱动信号随时间推移而变化时，一阶衍射光束的频率和角度偏移也发生变化，从而允许在不同的位置处以不同的激发频率照射所述样本。来自每个被照射位置的荧光发射(如果有的话)可以被收集并分析以便构建所述样本的荧光图像。
在又另一种操作模式下，所述系统10可以被操作以便以单个激发频率同时照射样本的多个位置，所述单个激发频率可例如通过将激光束的中心频率偏移射频来生成。例如，所述样本的水平范围可由激光束以单个激发频率来照射。所述检测到的荧光辐射可以用于分析所述样本的荧光成分，例如，细胞/颗粒。
因此，系统10的(以下讨论的其他优点)一个优点是其在不同模式下获得荧光发射数据时提供显著的灵活性，而无需利用不同的仪器或者在不同操作模式之间切换时对所述系统做出任何机械修改。
在某些实施例中，系统包括一个或多个光源。在一些实例中，所述光源是窄带光源，包括但不限于窄波长led、激光器或耦合至一个或多个光学带通滤波器的宽带光源、衍射光栅、单色器、或其组合产生窄带照射光的任何组合。在某些实例中，所述光源是单个波长激光器，诸如单个波长二极管激光器(例如，488nm的激光器)。在一些实施例中，本主题系统包括单个光源(例如，激光器)。在其他实施例中，本主题系统包括两个或更多个不同的光源，诸如3个或更多个不同的光源、诸如4个或更多个不同的光源并且包括5个或更多个不同的光源。例如，系统可以包括输出第一波长的第一光源(例如，激光器)以及输出第二波长的第二光源。在其他实施例中，系统包括输出第一波长的第一光源、输出第二波长的第二光源、以及输出第三波长的第三光源。
每个光源可以具有范围从300nm到1000nm的波长，诸如从350nm到950nm、诸如从400nm到900nm并且包括从450nm到850nm。在某些实施例中，所述光源具有与一个或多个荧光团的最大吸收相对应的波长(如下所述)。例如，所述光源可以输出具有在以下各项中的一项或多项范围内的波长的光：280nm至310nm、305nm至325nm、320nm至350nm、340nm至375nm、370nm至425nm、400nm至450nm、440nm至500nm、475nm至550nm、525nm至625nm、625nm至675nm以及650nm至750nm。在某些实施例中，每个光源输出具有选自以下各项的波长的光：348nm、355nm、405nm、407nm、445nm、488nm、640nm和652nm。
系统10包括生成激光束14的激光辐射源12。通过示例的方式，所述激光束可具有在约1000thz到约300thz范围内的频率，对应于在约300nm到约1000nm范围内的真空波长。所述激光束的光束直径(例如，当采用高斯激光束时的束腰)可以例如在约0.1mm到约10mm的范围内。在没有任何一般性损失的情况下，在此实施例中，激光器12以光束直径为约1mm的488nm的波长来发射辐射。
所述激光束的频率可基于所述系统针对的(多个)特定应用来进行选择。具体地，如以下更详细讨论的，激光频率可适合于例如经由辐射的吸收来激发感兴趣的荧光团的电子跃迁，从而使所述荧光团以更低的频率发射荧光辐射。可采用各种激光源。这类激光源的一些示例包括但不限于：由美国加利福尼亚圣克拉拉的相干(coherent)公司营销的sapphire488-sf、genesismx-488-1000-stm(相干公司)、obis405-lx(相干公司)、由美国加利福尼亚萨克拉门托的vortran激光技术公司营销的stadus405-250、以及美国加利福尼亚欧文的理波(newport)公司的lqc-660-110。在没有任何一般性损失的情况下，在本实施例中，假设所述激光束在垂直于其传播方向的平面内具有高斯强度分布曲线。
反射镜16接收激光辐射光束14并且经由反射将所述激光束引导至声光偏转器(aod)18。在此实施例中，aod18安装在允许aod围绕与光束14的传播方向垂直的轴线进行旋转的可调节柱支架底座(a)上。在控制器21的控制下进行操作的直接数字合成器(dds)20可向aod18施加一个或多个驱动信号。通过示例的方式，在一些实施例中，这些驱动信号可跨越约50mhz到约250mhz的频率范围。例如，施加到aod的驱动信号可以从55mhz到225mhz，诸如从60mhz到200mhz、诸如从65mhz到175mhz、诸如从70mhz到150mhz并且包括从75mhz到125mhz。在一些实施例中，所述驱动信号可以彼此分隔开一个处于约0.1mhz到约4mhz范围内的频率。例如，所述驱动信号可以彼此分隔开以下频率：从约0.2mhz到约3.9mhz，诸如从约0.3mhz到约3.8mhz、诸如从约0.4mhz到约3.7mhz、诸如从约0.5mhz到约3.6mhz并且包括从约1mhz到约3.5mhz。在此实施例中，电子功率放大器21’放大由dds20生成的射频信号以施加至aod18。
在利用多个激发频率同时照射样本的操作模式下，rf梳状发生器20向aod18同时施加多个rf驱动信号。通过示例的方式，同时施加的rf驱动信号的数量可在约20个到约200个的范围内。激光束与驱动信号的交互使得产生了多个成角度分隔开的激光束，每个成角度分隔开的激光束具有相对于由激光器12生成的激光束的频率与驱动信号中的一个相对应的频率偏移。在不限于任何特定理论的情况下，在aod中，压电换能器可在晶体(例如，石英晶体)中生成射频声子，并且由这种射频声子对激光束的光学光子进行的散射可使得产生频率偏移的激光束。这些频率偏移光束22中的一个在本文中被称为“本地振荡器”(lo)光束，并且频率偏移光束24中的剩余部分在本文中被称为“rf梳状光束”。所述频率偏移光束的角间距可以例如在约1毫弧度到约100毫弧度的范围内。例如，所述频率偏移光束的角间距的范围可以从2毫弧度到约95毫弧度，诸如从3毫弧度到约90毫弧度、诸如从4毫弧度到约85毫弧度、诸如从5毫弧度到约80毫弧度并且包括从10毫弧度到约75毫弧度。
所述lo光束和所述rf梳状光束通过透镜26，所述透镜在此实施例中是焦距为约50mm的正透镜。在通过透镜26之后，lo激光束被反射镜28截获，所述反射镜在不同的方向上(在此实施例中，在基本上与所述lo光束的原始传播方向正交的方向上)重新引导所述lo光束。反射镜28相对于所述rf梳状光束被定位，从而使得这些光束绕过反射镜28并且传播至透镜30(所述透镜在此实施例中具有200mm的焦距)。以此方式，所述lo光束和所述rf梳状光束沿着不同的传播方向被引导。以上述所公开的方式使用撷取镜28允许利用单个aod生成所述lo光束和所述rf梳状光束两者并且以以下所讨论的方式对其进行组合以生成用于照射样本的激发光束。单个aod、而非多个aod(例如，两个aod，一个用于生成lo光束并且另一个用于生成rf梳状光束)的使用简化了系统的设计并且进一步允许在多种不同的操作模式下高效使用所述系统，如以下更详细讨论的。
在一些实施例中，lo光束的光束分布曲线在与rf梳状光束重新组合之前被修改。例如，可以就空间维度、光束形状、强度、光束空间分布或其任何组合来调节(增大或减小)lo光束的光束分布曲线。在某些实施例中，lo光束的光束分布曲线的空间维度被修改。例如，光束分布曲线可以被调节为使所述光束分布曲线在一个或多个维度上伸长，诸如沿着与流动流的纵轴正交的轴线。在根据这些实施例的一个示例中，光束分布曲线的空间维度(例如，在一个或多个维度中)可以增大1％或更多，诸如增大2％或更多、诸如增大3％或更多、诸如增大5％或更多、诸如增大10％或更多、诸如增大25％或更多、诸如增大50％或更多、诸如增大75％或更多、诸如增大90％或更多、诸如增大1.5倍或更多、诸如增大2倍或更多、诸如增大3倍或更多并且包括增大5倍或更多。在根据这些实施例的另一示例中，光束分布曲线的空间维度(例如，在一个或多个维度上)可以减小1％或更多，诸如减小2％或更多、诸如减小3％或更多、诸如减小5％或更多、诸如减小10％或更多、诸如减小25％或更多、诸如减小50％或更多、诸如减小75％或更多、诸如减小90％或更多、诸如减小1.5倍或更多、诸如减小2倍或更多、诸如减小3倍或更多并且包括减小5倍或更多。
在其他实施例中，lo光束的光束形状被修改。例如，所述光束形状可以被修改为使所述光束分布曲线在一个或多个维度上伸长。在某些实例中，lo光束的光束形状在与lo光束的传播方向垂直的平面内被伸长。在某些实施例中，lo光束分布曲线的形状从圆形光束分布曲线改变为椭圆形光束分布曲线，所述椭圆形光束分布曲线在与流动流的纵轴正交的轴线上被伸长。在其他实施例中，lo光束分布曲线的形状从圆形光束分布曲线改变为矩形光束分布曲线，所述矩形光束分布曲线在与流动流的纵轴正交的轴线上具有长维度。
在仍其他实施例中，lo光束的强度被修改。例如，lo光束的强度可以增大，诸如增大1％或更多、诸如增大2％或更多、诸如增大3％或更多、诸如增大5％或更多、诸如增大10％或更多、诸如增大25％或更多、诸如增大50％或更多、诸如增大75％或更多、诸如增大90％或更多、诸如增大1.5倍或更多、诸如增大2倍或更多、诸如增大3倍或更多并且包括增大5倍或更多。在其他实施例中，lo光束的强度被减小，诸如减小1％或更多、诸如减小2％或更多、诸如减小3％或更多、诸如减小5％或更多、诸如减小10％或更多、诸如减小25％或更多、诸如减小50％或更多、诸如减小75％或更多、诸如减小90％或更多、诸如减小1.5倍或更多、诸如减小2倍或更多、诸如减小3倍或更多并且包括减小5倍或更多。在某些实施例中，lo光束的强度被修改为与rf梳状光束的强度相匹配。例如，lo光束的强度可以与rf梳状光束的强度相差10％或更少，诸如相差9％或更少、诸如相差8％或更少、诸如相差7％或更少、诸如相差6％或更少、诸如相差5％或更少、诸如相差4％或更少、诸如相差3％或更少、诸如相差2％或更少、诸如相差1％或更少、诸如相差0.01％或更少并且包括lo光束的强度与rf梳状光束相差0.001％或更少的情况。在某些实例中，lo光束的强度和rf梳状光束的强度是完全相同的。
在又其他实施例中，光束分布曲线的空间分布也可以被修改。例如，lo光束可以被修改为使得lo光束的强度在一个或多个维度上不再是高斯的。例如，lo光束可以被修改为具有沿着与流动流的纵轴平行的第一轴线的高斯分布、以及沿着与流动流的纵轴正交的第二轴线的非高斯分布。
任何光束成形协议可以用于修改lo光束的光束分布曲线，包括但不限于折射光束成形协议和衍射光束成形协议。在一些实施例中，lo光束由顶帽光束成形器修改。
在此实施例中，lo光束传播至另一正透镜32(所述透镜在此实施例中具有约200mm的焦距)。透镜26和透镜32的组合放大并准直lo光束以便适当地填充顶帽光束成形器34的后孔。更具体地，lo光束22通过透镜32并且由反射镜33和35反射到顶帽光束成形器34。
顶帽光束成形器34对高斯lo光束的相位波前进行成形以使能形成顶帽强度分布曲线。更具体地，离开顶帽光束成形器的lo激光束22’由分束器44反射并且由透镜46(所述透镜在此实施例中具有100mm的焦距)聚焦到中间图像平面48上。中间图像平面48上的激光束具有沿着与所述光束的传播方向垂直的平面内的水平方向的顶帽强度分布曲线。类似于aod18，在此实施例中，分束器44安装在可调节柱支架底座(b)上。在此实施例中，顶帽光束成形器生成顶帽光束分布曲线，在所述顶帽光束分布曲线中，辐射的极化沿着所述光束的顶帽方向(在此实施例中沿着水平方向)基本上是均匀的。
通过图示的方式，图2a示意性地描绘了lo激光束在进入顶帽光束成形器时的高斯强度分布曲线。如图2b中示意性示出的，在中间图像平面48上，lo激光束展现出光束分布曲线，所述光束分布曲线在水平方向上(在与此图示中的页面垂直的方向上)被伸展并且沿着延伸通过所述分布曲线的每条水平线基本上是恒定的，例如水平线a，但根据高斯分布曲线垂直变化。
可以采用各种顶帽光束成形器。通过示例的方式，具有非球形表面的折射光学元件或衍射光学元件可用于产生具有适当空间相位波前的光束，所述空间相位波前在通过透镜聚焦之后将在所述透镜的焦平面处产生顶帽分布曲线图案。这类顶帽光束成形器存在多个形成因子，并且这种方式的各种实现方式可用于在本教导的各个实施例中在样本处产生适当的lo光束形状。例如，通过引用以其全文结合在此的题为“refractiveopticalsystemthatconvertsalaserbeamtoacollimatedflat-topbeam(将激光束转换成准直平顶光束的折射光学系统)”的美国专利号6,295,168和题为“rectangularflat-topbeamshaper(矩形平顶光束成形器)”的美国专利号7,400,457两者均公开了可用作根据本教导的一些实施例的系统中的平顶光束成形器的光束成形系统。通过图示的方式，图3是示意性地描绘了用于提供方形光束或矩形波束的光束成形系统300的美国专利号7,400,457的图1的重现(具有不同的参考号)，所述光束成形系统包括两个正交布置的非圆柱形透镜302和304。第一非圆柱形透镜302用于沿着x轴成形入射光束，并且第二非圆柱形透镜304用于沿着y轴成形所述入射光束。这两个交叉的非圆柱形透镜被适配成提供具有沿着x轴的平坦顶部分布曲线的所产生的矩形激光束。非圆柱形透镜302的输入表面302a是具有可变曲率半径的凸形非圆柱形表面，所述可变曲率半径在所述表面的中心处较小并且朝向透镜的两个末端而平缓地增大。第二非圆柱形透镜304类似于所述第一非圆柱形透镜但相对于透镜302被正交布置，以便沿着y轴成形所述光束。透镜302的输入表面302a和输出表面302b的分布曲线以及透镜304的输入表面304a和输出表面304b的分布曲线可独立地根据入射光束a的x和y分布曲线以及所产生的矩形光束b的期望强度分布曲线(参见例如本专利的第5栏和第6栏)进行选择。
可采用的可商购顶帽光束成形器的示例包括例如由加拿大拉钦的osela公司营销的dth-1d-0.46deg-4mm。
如以下更详细讨论的，使用光束成形器以便沿着水平方向伸展lo光束提供了多个优点。例如，这可确保lo光束和rf梳状光束的组合照射具有基本上类似的照射强度的多个样本位置，以便跨所述样本位置的整体对lo光束的强度和rf梳状光束的强度进行匹配，从而以高调制深度产生荧光信号的强度振幅调制。在不存在这种强度匹配的情况下，成像系统可能具有较小的视野并且可能不会利用驱动aod的所有频率(像素)。由于荧光信号的调制深度在系统重构样本的荧光图像的能力中起着重要的作用，因此所有像素处的激发拍频的均匀高调制深度对系统操作而言是特别有利的。进一步地，施加到aod的用于生成rf梳状光束的电信号的振幅可通过控制直接数字合成器的输出(例如，通过采用控制器21)来调节，以便均衡rf梳状光束从而使得其强度跨rf梳状光束和lo光束重叠的所有空间位置而等于lo光束的强度。此特征提供了优点，因为其确保荧光辐射的强度振幅调制的高调制深度。
再次参照图1，rf梳状光束24经由透镜26和30的组合而被成像到中间图像平面38上。更具体地，rf梳状光束24通过透镜26，并且绕过反射镜28到达经由反射镜40和42将rf梳状光束引导至中间图像平面38的透镜30。
图4示意性地描绘了中间图像平面38内的rf梳状光束的示例性数量的分布(在没有一般性损失的情况下，为了图示目的将rf梳状光束的数量选择为6个(标记为rf1、……、rf6)，尽管还可采用其他数量)。如图4所示，在中间图像平面38内，rf梳状光束24沿着水平方向在空间上彼此分隔开。在其他实施例中，rf梳状光束24中的两个或更多个可以部分地重叠。因此，透镜26和30的组合将成角度分隔开的rf梳状光束变换成跨越水平范围的一组空间上分隔开的光束。
再次参照图1，如以上所讨论的，分束器44接收离开顶帽光束成形器34的激光束22’并且将这个光束反射到透镜46，所述透镜进而将所述光束聚焦到lo光束展现顶帽光束分布曲线的中间图像平面48上。所述分束器还从中间图像平面38接收rf梳状光束24并且允许所述rf梳状光束通过所述中间图像平面。透镜46将rf梳状光束24聚焦到中间图像平面48上以便与具有顶帽光束分布曲线的lo光束进行组合以生成组合光束49。
通过图示的方式，图5示意性地描绘了组合光束49在垂直于其传播轴线的平面内的一条示例性分布曲线。所述组合光束的强度分布曲线被生成作为顶帽lo光束的强度分布曲线(由方形示意性地示出)和rf梳状光束24的强度分布曲线(每条强度分布曲线由圆圈中的一个示意性地示出)的叠加。如以下更详细讨论的，lo光束和rf梳状光束的此叠加沿着水平范围提供了多个拍频，每个拍频对应于沿着这个水平范围的一个空间位置。在照射样本的水平范围时，从样本的一个位置发射的荧光辐射经由振幅调制对与照射这个位置的辐射相关联的拍频进行编码。
再次参照图1，在此实施例中安装在可调节柱支架底座c上的正透镜50(在此实施例中为200-mm的透镜)和物镜52形成用于将中间平面48处的图像中继到流经流式细胞54的样本上的望远镜。在此实施例中，反射镜56将组合光束49反射到透镜50上，并且分色镜58在所述组合光束通过透镜50时将其反射朝向物镜52。
如图6中示意性示出的，组合光束49同时照射流经流式细胞54的样本62的多个空间位置60。因此，每个位置60通过rf梳状光束中的一个与顶帽状lo激光束的一部分的重叠被照射。在这些空间位置处，辐射将激发样本中感兴趣的荧光团(如果存在的话)。更具体地，在此实施例中，lo光束和rf梳状光束在多个样本位置60处同时激发荧光团，例如经由使所述荧光团电子跃迁到激发电子态。
在一些实施例中，所述样本可包括其中携带有多个细胞的流动流体。在一些情况下，所述细胞可利用一个或多个荧光标记(荧光团)来进行标记。荧光标记的一些示例包括但不限于：荧光蛋白(例如，gfp、yfp、rfp)、利用荧光团(例如，异硫氰酸荧光素)(fitc)、藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc))标记的抗体、核酸染色剂(例如，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)、syto16、碘化丙啶(pi))、细胞膜染色剂(例如，fmi-43)、以及细胞功能染料(例如，fluo-4、indo-1)。在其他情况下，细胞中存在的内源荧光团可用于引发来自所述细胞的荧光辐射。如以下更详细讨论的，这种外源荧光团或内源荧光团响应于照射辐射而经历电子激发并且发射被收集并分析的荧光辐射(通常在比激发频率更低的频率下)。
通过图示的方式并且不限于任何特定的理论，图7示出了与基电子态a以及荧光团的两种电子激发电子态b和c相对应的假设能级。所述荧光团可经由吸收辐射能量而从其基电子态(a)激发到激发电子态(b)。所述荧光团然后可例如经由荧光团的振动模式介导的无辐射跃迁而松弛至较低的激发态b。所述荧光团可进一步经由光跃迁而从较低的电子态c松弛至基态，从而以小于激发频率的频率发射荧光辐射。应当理解的是，此假设示例仅被提供用于图示目的，并且不用于表示可发射荧光辐射的唯一机制。
在许多情况下，所述荧光团可吸收频率范围上的电磁辐射，以便从基态激发至激发电子态。通过图示的方式，图8示出了结合图7所讨论的假设荧光团的吸收曲线。在根据本教导的实施例的一种实现方式中，lo频率可被选择为与同感兴趣的荧光团的吸收峰值相对应的频率相重合。所述射频偏移的光束可具有与吸收峰值间隔其对应拍频的频率。通常，这些频率间隔相较于荧光团的吸收带宽而言较小，以避免激发频率的任何降级。通过示例的方式并且仅通过图示的方式，虚线a和b示意性地描绘了lo光束的频率以及rf梳状光束中的一个梳状光束的频率(为了易于描述，所述附图并未按比例绘制)。由lo激光束和所描绘的rf梳状光束中的一个梳状光束两者对样本的空间位置进行同时照射使得荧光辐射以同lo光束频率与rf梳状光束频率之间的差相对应的拍频来展现振幅调制。
再次通过图示的方式并且不限于任何特定的理论，经由lo光束和rf梳状光束中的一个梳状光束进行的同时照射而施加到荧光团的电场可在数学上被定义如下：
其中，
ecom表示组合光束的电场，
erf表示与rf梳状光束中的一个梳状光束相关联的电场的振幅，
elo表示与lo光束相关联的电场的振幅，
响应于lo光束的电场与rf梳状光束的电场的叠加而发射的荧光辐射的强度将以与(ωrf-ωlo)相对应的拍频展现调制。因此，从通过lo光束与rf梳状光束中的一个梳状光束的叠加照射的样本的每个空间位置发出的荧光辐射以与同lo光束相关联的射频偏移和同照射那个空间位置的rf梳状光束相关联的射频偏移之间的差相对应的拍频展现调制。
由于荧光发射的过程需要有限的时间量(普通的有机荧光团通常需要1纳秒至10纳秒)，因此如果激发拍频过高则所发射的荧光将不展现高调制深度。因此，在许多实施例中，所述激发拍频被选择为显著小于1/τf，其中，τf为荧光团的特有荧光寿命。在一些实例中，所述激发拍频可以小于1/τf到1％或更多，诸如小于1％或更多、诸如小于2％或更多、诸如小于3％或更多、诸如小于5％或更多、诸如小于10％或更多、诸如小于25％或更多、诸如小于50％或更多、诸如小于75％或更多、诸如90％或更多、诸如小于1.5倍或更多、诸如小于2倍或更多、诸如小于3倍或更多并且包括小于5倍或更多。例如，所述激发拍频可以小于1/τf到0.01mhz或更多，诸如小于0.05mhz或更多、诸如小于0.1mhz或更多、诸如小于0.5mhz或更多、诸如小于1mhz或更多、诸如小于5mhz或更多、诸如小于10mhz或更多、诸如小于25mhz或更多、诸如小于50mhz或更多、诸如小于100mhz或更多、诸如小于250mhz或更多、诸如小于500mhz或更多并且包括小于750mhz或更多。
在实施例中，所述光电检测器被配置用于检测来自辐照样本的光(例如，诸如荧光的发光)。在实施例中，所述光电检测器可以包括一个或多个检测器，诸如2个或更多个检测器、诸如3个或更多个检测器、诸如4个或更多个检测器、诸如5个或更多个检测器、诸如6个或更多个检测器、诸如7个或更多个检测器并且包括8个或更多个检测器。可以采用任何光检测协议，包括但不限于有源像素传感器(aps)、象限光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(ccd)、增强型电荷耦合器件(iccd)、发光二极管、光子计数器、辐射热测量计、热电检测器、光阻器、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合、以及其他光电检测器。在一些实施例中，感兴趣的光电检测器被配置用于检测范围从350nm到1200nm的光，诸如从450nm到1150nm、诸如从500nm到1100nm、诸如从550nm到1050nm、诸如从500nm到1000nm并且包括从400nm到800nm。在某些实施例中，所述光电检测器被配置用于检测发光的最大发射处的光，诸如在395nm、421nm、445nm、448nm、452nm、478nm、480nm、485nm、491nm、496nm、500nm、510nm、515nm、519nm、520nm、563nm、570nm、578nm、602nm、612nm、650nm、661nm、667nm、668nm、678nm、695nm、702nm、711nm、719nm、737nm、785nm、786nm、805nm处。
在一些实施例中，由样本发射的荧光辐射可以各种不同的方式收集，例如沿着与激发光束的传播方向垂直的光学路径。在其他实施例中，所述荧光辐射在epi方向上被检测。
再次参照图1，在此实施例中，由被照射样本中存在的一个或多个荧光团发射的荧光辐射通过透镜52并且被透射通过分色镜58以到达光电检测器64。更具体地，在此实施例中，透镜65将透射通过分色镜58的荧光辐射聚焦到狭缝孔66上。被透射通过狭缝的荧光辐射通过荧光发射滤波器68以到达光电检测器64。布置在光电检测器前方的狭缝孔66(或是在下文讨论的其他实施例中的光学滤波器)基本上允许从样本的特定平面发射的荧光辐射通过，同时抑制平面外的荧光发射。进一步地，荧光发射滤波器68(例如，带通滤波器)允许荧光辐射通过到达光电检测器64，同时基本上阻挡其他频率上的辐射通过。
光电检测器64具有足够的rf带宽来检测和传输来自拍频的整个范围的信号。合适光电检测器的一些示例包括但不限于光电倍增管、雪崩光电二极管、pin光电二极管、以及混合光电检测器等。通过示例的方式，在一些实施例中，可以采用由滨松(hamamatsu)公司营销的光电倍增管(例如，r3896、r10699、h11462)。所述光电检测器响应于对接收到的荧光辐射进行检测而生成信号，例如在此实施例中为模拟信号。
通过另一示例的方式并且参照图9a，由样本响应于由lo光束和空间上分隔开的rf梳状光束的同时照射而发射的荧光辐射通过物镜52和分色镜58，以便经由透镜100耦合到多模光纤102上，所述多模光纤从近端102a延伸至远端102b。更具体地，光纤102的近端102a被定位成接近透镜100的焦平面以便接收荧光辐射。耦合至所述光纤的远端102b的出耦合透镜104准直从离开所述光纤的辐射。
在许多情况下，照射所述样本的激发辐射激发可具有足够宽的辐射吸收光谱的多个荧光团(例如，有机荧光团)，从而使得激发频率落在样本中的多个荧光团的吸收光谱内。每个荧光团然后将以不同的频率发射荧光辐射。在没有一般性损失的情况下并且出于图示的目的，在此实施例中，所述检测系统包括四个光电倍增管106、108、110和112，每个光电倍增管接收准直辐射的一部分，所述准直辐射与所述被照射样本中由激发辐射激发的四个荧光团中的一个发射的荧光辐射相对应。更具体地，分色镜114将由所述荧光团中的一个荧光团以第一频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管106，同时允许荧光辐射以其他频率通过。另一分色镜116将由不同的荧光团以不同的第二频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管108，同时允许包含由又另一荧光团以第三频率发射的荧光辐射的剩余辐射到达第三分色镜118，所述第三分色镜将此荧光辐射反射到光电倍增管110。分色镜118允许包括由第四荧光团以第四辐射频率发射的荧光辐射的剩余辐射通过以到达光电倍增管112。
多个带通滤波器120、122、124和126(每个带通滤波器以四个荧光频率中的一个荧光频率为中心)分别放置在光电倍增管106、108、110和112前方。由所述光电倍增管中的每一个检测到的信号以下文所讨论的方式被分析以便以对应的荧光频率生成荧光图像。在一些实施例中，并非使用多个光电检测器，而是可使用单个光电检测器(例如，单个光电倍增管)来检测荧光辐射，例如与来自单个荧光团的发射相对应的荧光频率。
在一些实施例中，在所述样本流经流式细胞时，所述样本的不同水平行被照射，并且与每个水平行相关联的荧光辐射由一个或多个光电检测器(诸如光电倍增管106、108、110和112)来检测。
图9b示意性地描绘了与以上结合图9a所讨论的相类似的检测系统，除此检测系统，并非使用光纤之外，包含来自通过分色镜58的多个荧光团的荧光发射的荧光辐射在自由空间中传播以到达光电倍增管106、108和112。更具体地，透镜100将荧光辐射聚焦到布置在透镜100与透镜104之间的孔径126上，其中，所述孔径可抑制离焦辐射。透镜104准直通过所述孔径的辐射，其中，准直辐射以上述结合图9a所讨论的方式分布在光电倍增管当中。
在一些实施例中，系统10可被配置用于使用激发辐射来提供所述样本的(在不存在所述样本时为所述流式细胞的)暗场图像和明场图像。通过示例的方式，图9c示意性地描绘了系统10的实施例，所述系统包括用于分别检测所述样本的暗场图像和明场图像的两个检测臂200和202。
更具体地，检测臂200被定位成垂直于激发辐射的传播，以便接收由流经流式细胞的样本散射的激发辐射的一部分。检测臂200包括两个透镜204和206，所述两个透镜共同将由所述样本散射的激发辐射的至少一部分引导至由透镜204围城的固体角中以到达光电倍增管208上。更具体地，透镜204准直所接收到的散射辐射，并且透镜206将经准直的散射辐射聚焦到光电倍增管208上。在此实施例中，适当的带通滤波器210被布置在光电倍增管208前方以允许具有期望频率的辐射通过到达光电倍增管208，同时阻挡不期望频率的辐射。光电倍增管208的输出可以本领域中已知的方式进行处理，例如通过诸如下文所讨论的分析模块，以便生成暗场图像。
检测臂202进而包括两个透镜212和214，其中，透镜212准直在正向方向上离开流式细胞的激发辐射(基本上沿着进入流式细胞54的激发辐射的传播方向)，并且透镜214将经准直的辐射聚焦到光电检测器216上。布置在所述光电检测器前方的适当滤波器218(例如，带通滤波器)允许将激发频率传输到光电检测器216，同时基本上阻挡其他辐射频率。光电检测器216的输出可以本领域中已知的方式进行处理以便生成流式细胞的明场图像。
因此，检测臂200检测由流经所述细胞的流体散射的激发辐射，并且检测臂202检测被透射通过流式细胞的激发辐射。当没有流体流经流式细胞时，由光电倍增管208检测到的信号较低并且由光电检测器216检测到的信号较高，因为存在对通过流式细胞的激发辐射的很少散射并且因此较大百分比(以及在一些情况下全部)的激发辐射被透射通过所述流式细胞。相较而言，流体样本流经流式细胞可使得由光电倍增管208生成的信号由于样本对激发辐射的一部分进行散射而增加，并且由光电检测器216生成的信号随着透射通过流式细胞的激发辐射水平的降低而减少。
通过进一步示例的方式并且参照图9d，在根据本教导的系统的一个实施例中，在与激发辐射的传播方向基本正交的方向上相对于流式细胞54而被定位的检测臂220a包括用于对由样本中的多个荧光团发射的荧光辐射以及由样本散射的激发辐射两者进行检测的光电检测器。更具体地，检测臂220包括透镜222和224，所述透镜将荧光辐射以及散射的激发辐射引导至抑制未聚焦辐射的孔径226上。透镜228准直通过所述孔径的辐射。分色镜230以激发频率将辐射的所述部分反射到光电倍增管232上以用于检测暗场图像，同时允许荧光辐射通过。被布置在光电倍增管232前方的适当滤波器232a(例如，带通滤波器)允许辐射以激发频率通过光电倍增管232，同时阻挡不期望的辐射频率。另一分色镜234将由荧光团以第一频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管236上，同时允许由其他荧光团以其他频率发射的荧光辐射通过。另一分色镜238将由另一荧光团以第二频率发射的荧光辐射反射到光电倍增管240上，同时允许由又另一荧光团以第三频率发射的荧光辐射通过，其中，其是由光电倍增管242检测到的。类似于前述实施例，多个滤波器236a、240a和242a分别布置在光电倍增管236、240和242前方以便允许以期望的频率传输辐射，同时基本上阻挡不期望的辐射频率。
继续参照图9d，根据本教导的系统的此实现方式进一步包括用于生成明场图像的另一检测臂220b，例如以结合图9c所讨论的方式。更具体地，检测臂202包括两个透镜212和214，所述两个透镜将光聚焦到光电检测器216上以用于生成激发辐射的明场图像。滤波器218(例如，带通滤波器)放置在光电倍增管216前方以允许激发辐射通过到达所述检测器，同时抑制不期望的辐射频率。
再次参照图1以及图10，在此实施例中，跨阻放大器70可耦合至光电检测器64(或者结合图9a至图9d所讨论的光电检测器中的每一个)的输出以便放大由光电检测器生成的信号。数据分析单元72(在本文中亦被称为分析模块或分析器)接收经放大信号并且分析所述信号以便生成所述样本的荧光图像。数据分析单元72可以在硬件、固件和/或软件中实现。通过示例的方式，一种用于分析所检测到的荧光数据的方法可以存储在所述分析模块的只读存储器(rom)单元中以便在处理器的控制下进行访问从而分析所接收到的荧光信号。
如以下更加详细讨论的，所述分析方法确定时变光电检测器的输出的频率分量，并且基于这些频率分量来构建样本的荧光图像。可以采用用于确定光电检测器的输出的频率成分的各种方法。这类合适方法的一些示例包括但不限于傅里叶变换、锁相检测、滤波、i/q解调、零差检测以及外差检测。
通过示例的方式，图11a和图11b示出了可由分析模块72执行以生成样本的荧光图像的示例性分析步骤。在步骤(1)中，将模拟放大信号数字化以便生成数字化荧光数据。在步骤(2)中，选择所述数字化数据的适当部分(长度)以进行分析。例如，可选择与样本(在本文中亦被称为帧)的照射行相对应的荧光数据以进行分析。可替代地，可选择数据帧的一部分以进行分析。
在步骤(3)中，执行对所选数据的傅里叶变换。通过示例的方式，在一些实施例中，执行对数据的快速傅里叶变换(fft)以便确定所述数据的频率分量。在一些这种实施例中，fft的仓可对应于被选择用于数据采集的频率。例如，针对256mhz的采样速率，256个样本可产生彼此分隔开1mhz的频率仓，例如从dc到128mhz。fft分析提供与所发射的荧光发射展现振幅调制的拍频相对应的频率。
继续参照图11a和图11b，在此实施例中，在步骤(4)中，通过获得fft数据中存在的每个频率分量的实分量和虚分量的平方和的平方根来计算这个频率分量的振幅的度量。由于每个频率分量与用于引发来自样本的特定位置的荧光辐射的拍频之一相对应，因此所述频率分量的振幅的度量可提供与沿着样本水平行的这个频率分量相关联的位置的像素值。以此方式，可确定所述样本的水平行的图像的像素值。针对样本的每个水平行而获得的荧光数据，可重复上述步骤，因为所述样本在竖直方向上流经流式细胞。所述像素值可用于构建荧光图像(步骤5)。
如以上指出的，分析模块72可使用本领域中已知的技术且根据本教导来在硬件、固件和/或软件中实现。通过示例的方式，图12示意性地描绘了分析器72的示例性实现方式，所述分析器包括用于接收来自放大器70的经放大荧光信号并且将这个信号数字化以生成数字化荧光数据的模数转换器74。所述分析模块进一步包括用于控制所述分析模块的操作的中央处理单元(cpu)76，包括执行计算和逻辑运算。所述分析模块还包括rom(只读存储器)78、ram(随机存取存储器)80以及永久存储器82。通信总线84促进所述分析模块的各部分之间的通信，包括cpu76与其他部件之间的通信。所述存储器模块可用于存储用于分析荧光数据的指令以及分析结果。通过示例的方式，在一些实施例中，用于数据分析的指令(例如，用于执行结合图11a和图11b所讨论的上述步骤的指令)可存储在rom78中。所述cpu可采用存储在rom78中的指令来操作存储在ram80中的数字化荧光数据以便生成所述样本的荧光图像(例如，一维图像或二维图像)。所述cpu可使得将所述荧光图像存储在永久存储器82中，例如存储在数据库中。如图12中示意性示出的，所述分析模块可以可选地包括用于根据所接收数据(例如，荧光数据)对像素强度和其他量执行计算的图像处理单元(gpu)76’。
在一些实施例中，可使用锁相检测技术来实现对由光电检测器生成的输出信号进行的频率解调。通过示例的方式，参照图13a和图13b，在一个这种实施例中，对经放大荧光信号进行数字化(步骤1)并且生成数字化荧光信号的若干副本(步骤2)，其中，所述数字化副本的数量(n)对应于与rf梳状光束相关联的频率的数量。所述信号的每个数字化副本与正弦波和余弦波相乘以便生成多个中间信号，所述正弦波和余弦波的频率与等于所述rf梳状光束之一的频率与所述lo光束的频率之差的拍频相对应(步骤2)。将每个中间信号传递通过低通滤波器(步骤3)，所述低通滤波器的带宽等于所述rf梳状频率之间的频率间隔的一半。
针对与所述rf梳状频率之一相对应的每个拍频(换言之，针对与被照射样本的空间位置相对应的每个频率)，获得与那个频率相对应的所述两个经滤波中间信号的平方和的平方根以作为与由具有那个频率的所述lo光束和所述rf梳状光束照射的所述样本位置相对应的图像像素的振幅的度量(步骤4)。在一些实施例，可以上述所讨论的方式对与同一拍频相对应(即与同一样本位置相对应)的多个荧光数据信号进行处理，并且可对所述像素值求平均以便获得平均像素值。
针对样本的每个水平行而获得的荧光数据，可重复上述步骤，因为所述样本在竖直方向上流经流式细胞。所述像素值可用于构建荧光图像(步骤5)。
上述锁相检测方法可在软件、固件和/或硬件中实现。通过示例的方式，在一个实施例中，上述锁相检测方法可以使用现场可编程门阵列(fpga)来实现，特别是如果使用多于6个的频率的话。在一些实施例中，可以采用多频锁相放大器，诸如由瑞士苏黎世的苏黎世仪器营销的hf2l-mf多频放大器。
通过进一步示例的方式，在一些实施例中，可通过采用基于带通滤波器的图像解调技术来实现对所检测到的荧光信号进行的频率解调。通过参照图14a和图14b，在这种频率解调方法的一个实施例中，对由光电检测器64和放大器70提供的荧光信号进行数字化(步骤1)并且生成数字化信号的若干副本(步骤2)，其中，所述数字化副本的数量(n)对应于与rf梳状光束相关联的频率的数量。通过将那个信号传递通过带通滤波器对所述数字化荧光信号的每个副本进行滤波，所述带通滤波器以与所述rf梳状光束之一相关联的拍频为中心(即与样本的特定位置相关联的拍频)(步骤3)。更具体地，每个带通滤波器以n个拍频中的一个为中心，并且具有等于相邻拍频之间的频率间隔的一半的带宽。
采用每个拍频的包络检测器以便针对每条水平线来估计与那个频率相对应的每个像素的振幅(步骤4)。在一些情况下，对与像素相对应的多个像素值求平均以获得平均像素值，所述多个像素值是通过处理与同那个像素相关联的样本位置相对应的多个荧光信号而获得的。针对样本的每个水平行而获得的荧光数据，可重复上述步骤，因为所述样本在竖直方向上流经流式细胞。可使用所述像素值来构建样本的一维荧光图像或二维荧光图像(步骤5)。
所述分析模块还可被配置用于接收并处理明场图像数据和暗场图像数据。例如，参照图9c和图10，分析模块72可进一步被配置用于接收来自光电检测器208和218的暗场图像数据和明场图像数据以便生成暗场图像和明场图像。例如，参照图12，用于生成暗场图像和明场图像的指令(例如，以本领域中已知的方式)可存储在永久存储器82中。处理器76可采用这些指令来处理接收到的暗场图像数据和明场图像数据以便生成图像。所述分析模块还可被配置用于通过使例如荧光图像与明场图像和暗场图像中的一者或两者重叠来生成合成图像。
由根据本教导的系统(诸如上述系统10)生成的荧光图像以及明场图像和暗场图像可用于各种不同的方式。例如，可以整合所述荧光图像以产生与由常规流式细胞仪产生的数据相当的值。也可以分析所述荧光图像以确定产生这张图像的荧光探针的位置(例如，可判定所述探针是核、细胞质、定位于细胞器、还是在细胞膜的外部)。进一步地，在一些应用中，通过检测不同的荧光带而获得的多张荧光图像(全部来自同一细胞)可用于确定细胞内的多个荧光探针的共定位程度。另外，使用多色荧光、明场图像和暗场图像对细胞形态学、细胞信令、内化、细胞-细胞相互作用、细胞死亡、细胞周期和斑点计数(例如，fish)等进行分析是可能的。
如以上所指出的，系统10可在至少三种不同的模式下进行操作。在上述所讨论的一种模式下，lo光束和多个rf梳状光束同时照射样本的一部分(例如，沿着水平范围布置的位置)，并且从被照射位置发射的荧光辐射被检测并分析以便构建样本的荧光图像。在另一种操作模式下，并非向aod同时施加多个rf驱动信号，而是向aod施加包含驱动信号的频率斜坡，从而使得激光束的频率随时间推移从开始频率(f1)改变为结束频率(f2)。针对频率斜坡中的每个驱动频率，激光束的频率偏移这个驱动频率，并且样本由频率偏移的激光束进行照射以引发来自样本的荧光辐射。换言之，在此模式下，所述系统被操作以便通过以与中心激光频率偏移的多个频率在时间间隔上连续照射所述样本从而获得来自所述样本的荧光辐射。由aod产生的频率偏移伴随着角度偏转，从而使得通过使用同一光学路径，跨样本以高速对所述光束进行扫描。
更具体地，在此操作模式下，rf频率合成器10用于使施加到aod18的驱动信号从开始频率(f1)斜升到结束频率(f2)。通过示例的方式，驱动信号斜升的频率范围可以从约50mhz到约250mhz。在一些实施例中，驱动信号从约100mhz斜升到约150mhz。在此实施例中，驱动频率随时间推移连续发生变化，例如以实现高速。在其他实施例中，驱动频率可以以离散步骤从开始频率(f1)改变为结束频率(f2)。
驱动频率被选择为使得频率偏移的光束将绕过反射镜28并且沿着由透镜26、透镜30、反射镜40/42、分束器44、透镜46、反射镜56、透镜50、反射镜58和物镜52限定的光学路径进行传播，从而照射流经样本保持器的样本的一部分。斜坡速率优选地足够快以便改善并优选地防止当样本流过光束时基于发射的荧光辐射生成的荧光图像的竖直方向上的任何模糊。这可例如通过将斜坡速率与样本的流速进行匹配来实现。样本处的激光斑尺寸可用于估计适当的速率。通过示例的方式，针对1微米的激光斑尺寸，跨1行的扫描时间对于0.1米每秒的样本流速应当为10微秒或更少以避免图像模糊。
响应于由激发辐射进行的照射而从样本发射的荧光辐射以上述所讨论的方式被收集和检测。具体地，参照图10，荧光辐射由光电检测器64来检测。所检测到的荧光由放大器70来放大，并且经放大的信号由分析模块72来分析以便重构样本的荧光图像。通过将水平像素位置指定在从开始频率(f1)到结束频率(f2)的扫描周期内的特定时间来执行对图像的重构。与如在上述操作模式下分析频率分量的振幅来获得像素值相反，在此操作模式下使用的解调方法仅使用检测到的荧光信号的时阈值来将值指定到图像的像素。在样本在竖直方向上流动时可重复所述过程，以便获得样本的二维荧光图像。
由样本发射的荧光辐射(如果有的话)由光电检测器64来收集。参照图10，所检测到的荧光辐射由放大器70来放大。分析模块72接收经放大信号。在此操作模式下，所述分析模块分析荧光信号以便确定所述样本的荧光成分，例如，细胞/粒子。由于在此操作模式下仅存在激发所述样本的一个光束，因此响应于激发所述样本而不生成拍频。因此，在荧光信号的频域中不存在图像信息。相反，所检测到的荧光信号具有在时域中编码的图像信息。在此操作模式下，可使用检测到的荧光信号的时间值作为水平像素坐标、并且将荧光信号的数字化电压值作为像素值(亮度)来数字地重构图像。对施加到aod的驱动频率进行的每次扫描都产生所述图像的一条水平线(行)。当样本流经照射区域(点)时，图像重构是经由连续扫描来实现的。
在又另一种操作模式下，所述系统10可以被操作以便以单个激发频率同时照射样本的多个位置，所述单个激发频率可例如通过将激光束的中心频率偏移射频来生成。更具体地，再次参照图1，在这种操作模式下，单个驱动射频可被施加到aod18以便生成激光束，所述激光束具有相对于进入aod18的激光束而被偏移的频率。进一步地，频率偏移激光束展现相对于进入aod的激光束的角度偏移，从而使得射频激光束被反射镜28截获并且经由透镜32和反射镜33和35朝向顶帽光束成形器34反射。离开顶帽光束成形器的光束被分束器44反射，并且由透镜46聚焦到中间图像平面48上。在此平面内，如图15a中示意性示出的，激光束1000示出了沿着水平方向的伸展分布曲线。
水平伸展的激光束由反射镜56反射到正透镜50。在通过透镜50之后，所述激光束由反射镜58反射到物镜52。如上所讨论的，正透镜50和物镜52形成用于将来自中间图像平面48的顶帽分布曲线的激光束中继到流经流式细胞54的样本上的望远镜。
水平伸展的激光束照射样本的水平范围以便沿着这个水平范围激发感兴趣的荧光团(如果样本中存在的话)。因此，在此操作模式下，不像样本的多个水平位置以不同的激发频率被照射的第一操作模式，样本的多个水平位置以相同的激发频率被照射。此操作模式不会使用户获得流过的细胞或粒子的图像。然而，在此操作模式下，通常可向样本施加比其他两种操作模式更高的光功率，这对于在不需要图像的情况下获得更高的信噪比数据可能是有用的。此操作模式可以通过仅更改驱动声光偏转器的电子信号来获得，而无需对所述系统做出任何机械变化。
因此，系统10可在三种不同的操作模式下操作以便引发来自样本的荧光辐射。
在一些实施例中，可在样本上的每个空间位置处执行荧光寿命测量，例如通过将射频偏移光束和本地振荡器光束中的每一者的拍频相位与所检测到的荧光信号中的对应射频分量的相位进行比较。通过示例的方式，图15b示出了系统10’(其是以上讨论的系统10的修改版本)，所述系统允许这种荧光寿命测量(为了简洁，在此附图中未描绘图1中示出的某些部件)。具体地，入射到分束器44上的rf梳状光束的一部分被所述分束器反射到会聚透镜400上(通过图示的方式，在此实施例中，透镜400具有200mm的焦距，尽管也可以使用其他焦距)。透镜400将rf梳状光束的那部分聚焦到检测激发光束的光电二极管402上。光电二极管402的输出可由分析模块72来接收(参见图10)。所述分析模块可例如使用以上所讨论的解调技术中的一种来提供对激发光束进行的频率解复用，并且确定激发光束中的每个射频分量的相位。这可针对在所检测到的荧光信号的每个射频分量而提供这个射频分量的相位可与之进行比较的参考相位。例如，可采用激发信号的fft的实分量和虚分量或者锁相型解调的i分量和q分量。可替代地，检测样本/流式细胞的明场图像的检测器的输出可用于获得荧光拍频的相位可与之进行比较的参考相位。
更具体地，分析模块72可提供对所检测到的荧光信号进行的频率解复用，例如，以上述所讨论的方式。如本领域技术人员将认识到的，针对荧光信号中的每个拍频，射频分量的相位可与激发光束的对应参考相位进行比较以获得空间分辨荧光寿命测量和荧光寿命图像。
在某些实施例中，本主题系统包括流式细胞仪系统，所述流式细胞仪系统采用上述光学配置来检测由流动流中的样本发射的光。在某些实施例中，本主题系统是流式细胞仪系统，所述流式细胞仪系统包括在以下美国专利中描述的流式细胞仪的一个或多个分量：专利号3,960,449；4,347,935；4,667,830；4,704,891；4,770,992；5,030,002；5,040,890；5,047,321；5,245,318；5,317,162；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,620,842；5,627,040；5,643,796；5,700,692；6,372,506；6,809,804；6,813,017；6,821,740；7,129,505；7,201,875；7,544,326；8,140,300；8,233,146；8,753,573；8,975,595；9,092,034；9,095,494以及9,097,640；所述美国专利的公开内容通过引用结合在此。
如上所述，在一些实施例中，本主题系统被配置用于在流过流动流的样本中的成像粒子(例如，细胞)，诸如在流式细胞仪的流动流中。所述流动流中的粒子的流速可以是0.00001m/s或更快，诸如0.00005m/s或更快、诸如0.0001m/s或更快、诸如0.0005m/s或更快、诸如0.001m/s或更快、诸如0.005m/s或更快、诸如0.01m/s或更快、诸如0.05m/s或更快、诸如0.1m/s或更快、诸如0.5m/s或更快、诸如1m/s或更快、诸2m/s或更快、诸如3m/s或更快、诸如4m/s或更快、诸如5m/s或更快、诸如6m/s或更快、诸如7m/s或更快、诸如8m/s或更快、诸如9m/s或更快、诸如10m/s或更快、诸如15m/s或更快并且包括25m/s或更快。例如，取决于流动流的大小(例如，流动喷嘴孔口)，所述流动流在本主题系统中可以具有0.001μl/分或更快的流速，诸如0.005μl/分或更快、诸如0.01μl/分或更快、诸如0.05μl/分或更快、诸如0.1μl/分或更快、诸如0.5μl/分或更快、诸如1μl/分或更快、诸如5μl/分或更快、诸如10μl/分或更快、诸如25μl/分或更快、诸如50μl/分或更快、诸如100μl/分或更快、诸如250μl/分或更快并且包括500μl/分或更快。
以下示例仅被提供用于进一步阐明本教导的各个方面，并且并非旨在必然地说明实现本发明教导的最佳方式或可获得的最佳结果。
示例1
类似于以上结合图1所描述的系统(具有类似于以上结合图9a所描述的检测系统)用于测量来自利用8种离散级荧光染料染色的聚苯乙烯微球的荧光辐射，所述离散级荧光染料由伊利诺斯州森林湖的spherotech公司以商品名rcp-30-5a营销。所述系统还用于以上述所讨论的方式生成明场图像和暗场图像。
图16a是暗场强度与明场强度的散点图。所述图的矩形部分被用作门限以便生成由在图16b、图16c和图16d中描绘的数据，所述数据包含测量的所有事件(检测到了总共50,000件事件)的约32％。图16b示出了由每个粒子发射的红色荧光(pi)与绿色荧光(fitc)的散点图。此图清晰地示出了具有不同亮度级别的8个群体。图16c和图16d是同一数据的直方图。
示例2
使用类似于上述结合图1所描述的系统(所述系统具有类似于上述结合图9a所讨论的检测系统)来获得用cd45-fitc和碘化丙啶染色的固定外周血白细胞的fire、明场图像和暗场图像。所述样本还包含被钙黄绿素-am染色的一部分活hela细胞。所述细胞在数据采集期间以0.5米/秒的速率流经流式细胞。
图17a中示出的图像从上到下为：明场、cd45-fitc和碘化丙啶荧光道的重叠；明场；暗场；cd45-fitc；以及pi通道荧光。尚未施加补偿，并且所有的图像均是自动定标以供观看。被编号为2、3、5、8、9、12、17、20和21的细胞为hela细胞(b群体)，并且其他细胞为白细胞(a群体)。
图17b是散点图，在所述散点图中，群体a表示白细胞，并且群体b表示hela细胞。
示例3
使用类似于上述结合图1所描述的系统(所述系统具有类似于上述结合图9a所讨论的检测系统)来获得用cd45-fitc和碘化丙啶染色的固定外周血白细胞的fire、明场图像和暗场图像。所述样本添加有被抗epcam-fitc和碘化丙啶(pi)染色的一小部分固定mcf-7细胞。所述细胞在数据采集期间以0.5米/秒的速率流经流式细胞。
图18a中示出的图像从上到下为：明场、fitc和pi通道荧光的重叠；明场；暗场；fitc；以及pi荧光。在白细胞群体中，绿色荧光是从pi染色溢出的人造荧光。所有图像均自动定标亮度以供观看，并且因此白细胞看起来是展现fitc荧光，然而这是来自pi的较小荧光溢出信号。被编号为1、2、4、5、10、13、15和16的细胞为mcf-7细胞。
图18b是散点图，在所述散点图中，群体a表示白细胞，并且群体b表示mcf-7细胞。
本领域的普通技术人员将认识到，可以在不脱离本教导的范围的情况下做出各种修改。具体地，以上所讨论的实施例的各种特征、结构或特性可以以合适的方式进行组合。例如，结合一个实施例所讨论的检测系统可以在另一实施例中使用。