本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2015年9月14日提交的名称为“identificationofnoveldiagnosticsandtherapeuticsbymodulatingrhoh”、序列号为62/218,512的美国临时专利申请的权益，其内容通过引用整体并入本文。
本公开内容涉及用于鉴定造血障碍中的治疗靶标和诊断标志物的rhoh调节。
背景技术：
在许多造血障碍(如白血病和淋巴瘤)中发生细胞内信号传导分子ras同源物家族成员h(rashomologfamilymemberh，rhoh)的异常表达。在这些病症中，rhoh的异常表达已被示出为不良预后的标志物。然而，由于其在细胞内表达，难以直接使用rhoh作为诊断标志物或治疗靶标。
技术实现要素：
本公开内容部分基于以下发现：校正造血障碍(例如白血病)中rhoh的异常细胞内表达改善了疾病进展并鉴定了细胞(例如白血病细胞)中依赖于该异常表达的分子。该发现允许鉴定依赖于rhoh异常表达的新可用药靶标(druggabletarget)。这些靶标也被认为代表了潜在的新的诊断和/或预后标志物。
根据本公开内容的一个方面，提供了鉴定造血细胞中的造血障碍相关分子的方法。所述方法包括鉴定具有异常rhoh水平的造血细胞，将所述细胞中的rhoh水平恢复至对照水平，以及在所述细胞中的rhoh水平恢复至对照水平之前和之后测量所述细胞中分子的水平，其中在所述细胞中的rhoh水平恢复至对照水平之后所述细胞中所述分子的水平的降低指示所述分子是造血障碍相关分子。
在一些实施方案中，所述分子在造血细胞的表面上。在一些实施方案中，所述分子在造血细胞内。在一些实施方案中，所述分子由造血细胞分泌。在一些实施方案中，所述分子是肽、蛋白质或rna。在一些实施方案中，rna是信使rna(mrna)、微小rna(mirna)或长非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)。
在一些实施方案中，所述造血障碍是白血病、淋巴瘤、免疫缺陷病、自身免疫病、炎性疾病、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血、血小板减少症或缺血再灌注损伤。
在一些实施方案中，所述白血病是毛细胞白血病(hairy-cellleukemia，hcl)、急性淋巴细胞白血病(acutelymphocyticleukemia，all)、急性髓细胞性白血病(acutemyelogenousleukemia，aml)、慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，cll)、慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenousleukemia，cml)、成人t细胞白血病/淋巴瘤(adultt-cellleukemia/lymphoma，atll)、t细胞或b细胞幼淋巴细胞白血病(prolymphocyticleukemia，pll)、t细胞或b细胞大颗粒淋巴细胞白血病(largegranularlymphocyticleukemia，lgll)或侵袭性自然杀伤细胞白血病。
在一些实施方案中，所述白血病是aml。在一些实施方案中，所述aml中的造血障碍相关分子是tescalcin(tesc)、cd93、kcnn4、slc4a2或cdc42ep1。
在一些实施方案中，所述白血病是hcl。在一些实施方案中，hcl中的造血障碍相关分子是cd21、cd121b、cd150、csf1r、gpr30、itgb7、fcrl2、fcrl3或cd22。
在一些实施方案中，所述白血病是atll。在一些实施方案中，atll中的造血障碍相关分子是cd54、cd82、cd83、cd123、cd252或cd194。
根据本公开内容的另一个方面，提供了治疗对象中的造血障碍的方法。所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的靶向上文鉴定的造血障碍相关分子的药剂。
在一些实施方案中，所述分子在造血细胞的表面上。在一些实施方案中，所述分子在造血细胞内。在一些实施方案中，所述分子由造血细胞分泌。在一些实施方案中，所述分子是肽、蛋白质或rna。在一些实施方案中，rna是信使rna(mrna)、微小rna(mirna)或长非编码rna(lncrna)。
在一些实施方案中，所述造血障碍是白血病、淋巴瘤、免疫缺陷病、自身免疫病、炎性疾病、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血、血小板减少症、缺血再灌注损伤。
在一些实施方案中，所述白血病是毛细胞白血病(hcl)、急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)、t细胞或b细胞幼淋巴细胞白血病(pll)、t细胞或b细胞大颗粒淋巴细胞白血病(lgll)、侵袭性自然杀伤细胞白血病。
在一些实施方案中，所述白血病是aml。在一些实施方案中，aml中的造血障碍相关分子是tescalcin(tesc)、cd93、kcnn4、slc4a2或cdc42ep1。
在一些实施方案中，所述白血病是hcl。在一些实施方案中，hcl中的造血障碍相关分子是cd21、cd121b、cd150、csf1r、gpr30、itgb7、fcrl2、fcrl3或cd22。
在一些实施方案中，所述白血病是atll。在一些实施方案中，atll中的造血障碍相关分子是cd54、cd82、cd83、cd123、cd252或cd194。
根据本公开内容的又一方面，提供了诊断对象中的造血障碍的方法。所述方法包括从患有造血障碍、怀疑患有造血障碍或具有升高的患造血障碍的风险的对象获得细胞，确定上文鉴定的一种或更多种造血障碍相关分子的存在，从而指示所述对象患有造血障碍或具有患造血障碍的风险。
在一些实施方案中，所述分子在造血细胞的表面上。在一些实施方案中，所述分子在造血细胞内。在一些实施方案中，所述分子由造血细胞分泌。在一些实施方案中，所述分子是肽、蛋白质或rna。在一些实施方案中，rna是信使rna(mrna)、微小rna(mirna)或长非编码rna(lncrna)。
在一些实施方案中，所述造血障碍是白血病、淋巴瘤、免疫缺陷病、自身免疫病、炎性疾病、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血、血小板减少症、缺血再灌注损伤。
在一些实施方案中，所述白血病是毛细胞白血病(hcl)、急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)、t细胞或b细胞幼淋巴细胞白血病(pll)、t细胞或b细胞大颗粒淋巴细胞白血病(lgll)、侵袭性自然杀伤细胞白血病。
在一些实施方案中，所述白血病是aml。在一些实施方案中，aml中的造血障碍相关分子是tescalcin(tesc)、cd93、kcnn4、slc4a2或cdc42ep1。
在一些实施方案中，所述白血病是hcl。在一些实施方案中，hcl中的造血障碍相关分子是cd21、cd121b、cd150、csf1r、gpr30、itgb7、fcrl2、fcrl3或cd22。
在一些实施方案中，所述白血病是atll。在一些实施方案中，atll中的造血障碍相关分子是cd54、cd82、cd83、cd123、cd252或cd194。
本公开内容的每个限制可以涵盖本公开内容的多种实施方案。因此，预期本公开内容的涉及任何一个要素或要素组合的每个限制可以被包括在本公开内容的每个方面中。本公开内容能够具有另一些实施方案并且能够以多种方式被实践或实施。此外，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应该被认为是限制性的。本文中“包括”、“包含”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变型的使用意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及额外项目。
参考本发明的详细描述，本公开内容的这些和其他方面以及多种优点和用途将变得明显。如理解的，本公开内容的每个方面可以涵盖多个实施方案。
本申请中确定的所有文件通过引用整体并入本文。
附图说明
图1a-1c显示hcl中rhoh的诱导下调了cd38表达。图1a是定量rt-pcr分析，其显示当在jok-1hcl细胞(jok-rhoh)中诱导rhoh表达时，与未诱导rhoh表达的jok-1hcl细胞(jok-空)相比，cd38mrna水平显著降低(配对studentt检验：p＝0.0026)。直方图表示一式二份进行的四个实验的平均值±s.d.。图1b是使用抗cd38小鼠单克隆抗体的western印迹分析，其显示当在jok-1hcl细胞(jok-rhoh)中诱导rhoh表达时，与未诱导rhoh的jok-1(jok-空)相比，总蛋白质裂解物中的cd38蛋白水平较低。抗α-肌动蛋白的抗体用于裂解物的对照分析。图1c是流式细胞术分析，显示与rhoh未被诱导(jok-空白)相比，当rhoh被诱导(jok-rhoh)时jok-1细胞表面上的cd38表达较低。使用特异性结合cd38的fitc缀合抗体(cd38ab)或同种型匹配的对照抗体(同种型ab)进行分析。描绘了获得的流动模式的代表性实例，以及从4个实验计算的fitc阳性细胞的平均百分比±s.d。在减去归因于对照抗体的荧光强度后，特异性归因于cd38抗体的平均荧光强度对于jok-空为71.8±14.3，对于jok-rhoh显著较低，为19.7±9.0s.d.(配对studentt检验：p＝0.0006)。
图2a-2b显示cd38被hcl细胞系和患者差异表达。图2a是总蛋白质裂解物的western印迹分析，显示cd38由hcl细胞系jok-1、hc-1、hair-m和eskol表达，但不被hcl细胞系eh/k表达。抗gapdh的抗体用于裂解物的对照分析。图2b(图a-d)是从hcl和cll患者取得的骨髓活检物中cd38表达的免疫组织化学分析。以这种方式检查了8名hcl患者，发现两名患者是cd38阳性。描绘了这些cd38阳性患者之一的分析(图a)。描绘了被确定为cd38阴性的6名hcl患者之一的分析(图b)。作为hcl患者分析的对照，同样地检查取自两名cll患者的骨髓活检物的cd38表达。这些cll患者之一的诊断病理学记录显示骨髓是cd38阳性(图c)。第二名cll患者的病理学记录显示骨髓为cd38阴性(图d)。所有图像都以×100的放大率拍摄。
图3a-3b显示cd38是不良预后的标志物。图3a是kaplan-meier图，示出了43例hcl中一线治疗结束和补救治疗开始之间的时间。这个时间间隔称为距离下一次治疗的时间(timetonexttreatment，ttnt)。cd38阳性的16例和cd38阴性的27例分别用虚线和实线独立绘制。cd38阳性患者的平均ttnt显著短于cd38阴性患者的平均ttnt(gehan-breslow-wilcoxon检验：p＝0.0023)。图3b是kaplan-meier图，仅示出了分析的总共43例中复发的23名患者的ttnt。cd38阳性和cd38阴性病例分别用虚线和实线独立绘制。8名cd38阳性患者的平均ttnt显著短于15名cd38阴性患者的平均ttnt(gehan-breslow-wilcoxon检验：p<0.0001)。在cd38阳性组中，4名使用干扰素进行一线治疗，4名使用嘌呤类似物进行一线治疗。在cd38阴性组中，六名最初用干扰素治疗，九名用嘌呤类似物治疗。
图4a-4c显示cd38促进hcl生长。图4a示出了以5x105个细胞/ml的密度起始的jok-cd38-ko和jok-cd38-wt的第0天培养物。之后，在第2、4、6和8天对细胞计数。在每个时间点，将jok-cd38-wt细胞(cd38-wt)的数目指定为100，并且将jok-cd38-ko细胞(cd38-ko)的数目计算为该值的百分比。直方图代表三个实验的平均值±s.d.。在第4、6和8天，jok-cd38-ko细胞的数目显著少于jok-cd38-wt细胞的数目(配对studentt检验：分别为p＝0.0257、0.0342和0.0036)。图4b示出了通过测量培养物中引入edu并因此指定为处于细胞周期的s期的细胞的百分比来评估的细胞分裂速率。直方图代表三个实验的平均值±s.d.。jok-cd38-wt(cd38-wt)和jok-cd38-ko(cd38-ko)的培养物之间没有显著差异(配对studentt检验：p＝0.1571)。图4c示出了通过测定72小时培养物中表达膜联蛋白v并且还被碘化丙啶染色的细胞的百分比评估的细胞死亡率。这些细胞被认为经历细胞凋亡。直方图代表四个实验的平均值±s.d.。jok-cd38-ko(cd38-ko)培养物中经历细胞凋亡的细胞百分比显著高于jok-cd38-wt(cd38-wt)培养物(配对studentt检验：p＝0.0091)。
图5显示cd38促进hcl黏附。制备人微血管细胞(hmec-1)的汇合单层，并留着不激活或用lps激活。然后将这些单层与先前用荧光标志物bcecf-am标记的jok-cd38-wt(cd38-wt)或jok-cd38-ko(cd38-ko)一起孵育。1小时后，洗掉未黏附细胞并测量单层的荧光强度。从该值中减去未与细胞一起孵育的单层的荧光，以得到特异性来自hcl细胞黏附的单层获得的荧光的测量值。然后将这些特异性荧光测量值绘制在标准曲线上，所述标准曲线由已知数目的用bcecf-am标记的相应hcl细胞系的系列稀释液构建。这样计算了黏附细胞的数目。直方图代表最少一式三份进行的四个实验的平均值±s.d.。jok-cd38-ko与未激活和激活的内皮细胞的黏附显著低于jok-cd38-wt的黏附(配对studentt检验：分别为p＝0.0332和0.0126)。
图6a-6b显示cd38促进体内hcl生长。图6a显示向8只nod.cg-prkdcscidil2rγtm1wjl/szj品种小鼠皮下注射5x106jok-cd38-wt(cd38-wt)，并向7只相同品种小鼠同样地注射jok-cd38-ko(cd38-ko)。4周后，解剖产生的皮下肿瘤并通过尺寸测量计算其体积。将每只小鼠的肿瘤体积表示为实心正方形。水平虚线显示由jok-cd38-wt和jok-cd38-ko产生的平均肿瘤体积。垂直条表示这些体积的s.d.。由jok-cd38-ko产生的肿瘤的平均体积显著小于由jok-cd38-wt产生的那些(未配对studentt检验：p＝0.0525)。图6b示出了计算了体积的相同肿瘤的重量。由jok-cd38-ko产生的肿瘤的平均重量显著小于由jok-cd38-wt产生的那些(未配对studentt检验：p＝0.0273)。
图7显示靶向cd38治疗体内处理预先存在的hcl。用包含巨细胞病毒组成型基因启动子控制下的萤火虫萤光素酶基因的质粒pgl4.5[luc2/cmv/neo]稳定转染jok-1细胞。然后将该萤光素酶细胞系注射到hsd:athymicnude-foxn1nu品种的小鼠的腹膜中。3天后，在静脉内注射d-萤光素后对小鼠进行全身成像。在第4天和第6天向测到肿瘤的那些小鼠腹膜内注射抗cd38抗体sar650984或igg对照抗体。在第7天，对小鼠再次成像。所描绘的是注射sar650984(cd38)的三只小鼠和注射对照抗体(ctrl)的三只的叠加的发光和x射线图像。
图8显示hcl细胞系jok-1中的野生型cd38基因的dna序列，所述序列与混合产生jok-cd38-ko的六个jok-1克隆中的cd38基因序列比对。野生型cd38基因相对于+1处的转录起始位点编号。翻译起始位点是核苷酸+56。包含jok-cd38-ko的克隆中缺失的核苷酸用连接号表示，插入的核苷酸用方框内的文字表示。jok-cd38-ko.6中缺失173个核苷酸。cd38基因中的每个缺失或插入都使编码区的阅读框转移，从而将过早的翻译终止密码子引入到mrna中。野生型cd38基因内zfn被设计来结合以产生移码突变的核苷酸用粗体字母表示。
图9示出了由细胞系库jok-cd38-wt(wt)以及构成库jok-cd38-ko的六个单独克隆中的每一个(ko.1-6)制备的总蛋白质裂解物中cd38表达的western印迹分析。该分析证明了jok-cd38-wt强烈表达cd38，但在混合以产生jok-cd38-ko的每个克隆未表达。抗gapdh的抗体用于裂解物的对照分析。
图10示出了细胞系库jok-cd38-wt(wt)以及构成库jok-cd38-ko的六个单独克隆中的每一个(ko.1-6)的表面上cd38表达的流式细胞术分析。使用特异性结合cd38的fitc缀合的抗体(红线)或同种型匹配的对照抗体(蓝线)进行分析。所描绘的是流模式的代表性实例，其显示了jok-cd38-wt上cd38的强烈表达，但在混合以产生jok-cd38-ko的每个克隆上未表达。
发明详述
本公开内容的多个方面涉及鉴定造血细胞中的造血障碍相关分子。在一些方面，本公开内容基于以下发现：调节造血细胞中细胞内信号传导分子rhoh的表达鉴定了新的诊断和治疗靶标。如本文所用，造血细胞是指来自中胚层的血细胞，包括成熟细胞及其各自的未成熟前体。造血细胞包括以下：嗜温髓细胞、嗜碱性粒细胞、b细胞、爆式集落形成单位(bfu)细胞(bfu-e和bfu-mk)、集落形成单位(cfu)细胞(cfu-bas、cfu-e、cfueo、cfu-g、cfu-gemm、cfu-gm和cfu-mk)、共同树突祖细胞、共同淋巴祖细胞、共同髓细胞性红细胞祖细胞、共同髓细胞性祖细胞、共同髓细胞性淋巴祖细胞、双阴性(dn)t细胞(dn1、dn2、dn3和dn4)、双阳性(dp)t细胞、嗜酸性髓细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、淋巴干细胞、淋巴相关树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、巨核细胞、记忆b细胞、记忆t细胞、成单核细胞、单核细胞、成髓细胞、骨髓干细胞、骨髓相关树突细胞、嗜中性髓细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、血小板、前b淋巴细胞(前b1细胞和前b2细胞)、前红细胞、前单核细胞、调节性t细胞、t细胞和t辅助细胞(th0、th1、th2、th3和th17)。
如本文所用，ras同源物家族成员h(rhoh)是鸟苷三磷酸(gtp)代谢酶的ras超家族的蛋白质。其在造血细胞中表达，调节细胞生长和存活。其基因的超突变(hypermutation)或错误表达已涉及一些白血病和淋巴瘤。rhoh序列如下：
本公开内容的一些方面涉及鉴定具有异常rhoh水平的造血细胞。在一些实施方案中，异常rhoh水平可以是相对于对照水平(例如，在对照细胞中)提高的水平。提高意味着细胞中的rhoh水平与对照细胞的水平(对照水平)相比具有统计学显著的提高。例如，统计学上显著的提高可以是细胞中rhoh水平比对照水平高至少10％、至少25％、至少50％、至少100％、至少250％、至少500％或至少1000％。类似地，统计学上显著的提高可以是比对照水平(例如，在对照细胞中)高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多的rhoh水平。
在一些实施方案中，异常rhoh水平可以是相对于对照水平(例如，在对照细胞中)降低的水平。降低意味着细胞中的rhoh水平与对照水平的水平(例如，在细胞中)相比具有统计学显著的降低。例如，统计学上显著的降低可以是与对照细胞中的水平相比，细胞中的rhoh水平为至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％或不可检测。类似地，统计学上显著的降低可以是比对照水平低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍或更多的rhoh水平。在一些实施方案中，rhoh水平降低至不可检测或低于使用标准检测方法(例如western印迹、northern印迹、定量rt-pcr或免疫组织化学法)获得的背景/噪音水平。
对照细胞中的rhoh对照水平是从健康对象或健康对象群体获得的健康造血细胞中的水平或造血细胞群体中的平均值。健康的对象是明显没有疾病并且没有疾病(例如造血障碍)史的对象。
统计学显著性可以通过使用适当的统计检验来确定。用于统计学显著性的检验在本领域中是公知的，并且在petruccelli，chen和nandram1999年的再版编辑的appliedstatisticsforengineersandscientists中例示。在一些实施方案中，使用假发现率<0.2的标准来选择差异表达的生物标志物。
本公开内容的方面涉及将rhoh水平恢复至对照水平。在一些实施方案中，恢复细胞中的rhoh水平涉及将细胞中的rhoh水平提高(例如提高rhoh表达)至对照水平。提高rhoh水平的方法包括但不限于：引入重组rhoh蛋白、rhohmrna、编码rhoh的质粒和病毒、使rhohmrna和/或蛋白质稳定的微小rna和/或小分子和/或肽和/或蛋白质，抑制使rhohmrna和/或蛋白质不稳定的分子实体，基因组编辑以抑制内源rhoh基因抑制性控制元件和/或激活内源rhoh基因激活子控制元件和/或向rhoh基因中引入重组激活子控制元件、激活rhoh基因的表观遗传修饰因子，抑制rhoh基因的表观遗传修饰因子的抑制剂。
在一些实施方案中，恢复细胞中的rhoh水平涉及将细胞中的rhoh水平降低(例如，降低rhoh表达)至对照水平。降低rhoh水平的方法包括但不限于：引入抗rhoh抗体、rhoh反义mrna和/或寡核苷酸、编码反义rhoh的质粒和病毒、使rhohmrna和/或蛋白质不稳定的微小rna和/或小分子和/或肽和/或蛋白质，抑制使rhohmrna和/或蛋白质稳定的分子实体，基因组编辑以抑制内源rhoh基因激活子控制元件和/或激活内源rhoh基因抑制子控制元件和/或向rhoh基因中引入重组抑制子控制元件、抑制rhoh基因的表观遗传修饰因子、抑制激活rhoh基因的表观遗传修饰因子。
本公开内容的方面涉及鉴定造血障碍相关分子。造血障碍相关分子可以是蛋白质、多肽、信使rna(mrna)、微小rna(mirna)或长非编码rna(lncrna)。
如本文所用，蛋白质是指由氨基酸或氨基酸类似物亚单位(通常是生物蛋白质中存在的20种常见氨基酸中的一些或全部)构成的生物聚合物。氨基酸链多肽可以具有任何长度，包括全长蛋白质，其中氨基酸通过共价肽键连接。
如本文所用，肽指通过共价肽键连接的2至100个或更多个氨基酸的分子。肽可以含有无规和/或柔性构象，包括无规卷曲；并且可缺乏通过二级和三级结构实现的较大蛋白质或多肽中观察到的稳定构象。
如本文所用，rna是指核糖核酸，它是单链或双链形式的含有核苷酸碱基的聚合物分子。
如本文所用，信使rna(mrna)是指没有内含子区段的任何多核苷酸，其能够在体外、体内、原位或离体被翻译以产生蛋白质。
如本文所用，微小rna(mirna)是指21至25个核苷酸的非编码rna分子，其可以在rna沉默和基因表达的翻译后调节中起作用。
如本文所用，lncrna(长非编码rna)是指长于200个核苷酸的非编码rna分子，其可与蛋白质编码基因分开定位(长基因间ncrna)或位于蛋白质编码基因附近或内部。lncrna包含许多mrna特征，包括5'加帽、剪接和聚腺苷酸化，但确实几乎没有或没有开放阅读框。
造血障碍相关分子的实例包括例如下表中列出的那些：
在一些实施方案中，造血障碍是急性髓细胞性白血病(aml)并且造血障碍相关分子是以下一种或多种：
在一些实施方案中，aml中的造血障碍相关分子是tescalcin(tesc)、cd93、kcnn4、slc4a2或cdc42ep1。
在一些实施方案中，造血障碍是毛细胞白血病(hcl)并且造血障碍相关分子是以下一种或多种：
在一些实施方案中，hcl中的造血障碍相关分子是cd21、cd121b、cd150、csf1r、gpr30、itgb7、fcrl2、fcrl3或cd22。
在一些实施方案中，造血障碍是成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)，并且造血障碍相关分子是以下中的一种或更多种：
在一些实施方案中，atll中的造血障碍相关分子是cd54、cd82、cd83、cd123、cd252或cd194。
在一些实施方案中，造血障碍相关分子是与其在对照细胞(例如健康的造血细胞)中如何表达相比，由造血细胞和/或与造血细胞相互作用和/通信的细胞以定量和/或定性地改变的方式表达的蛋白质、肽或rna(例如mrna、mirna、lncrna)。
在一些实施方案中，例如在治疗环境下，造血障碍相关分子是这样的靶标或可能的靶标(“可用药的靶标(druggabletarget)”)：其用于结合降低或抑制所述靶标的病理生理效应的药剂。在一些实施方案中，药剂与靶标的结合改变靶标的功能，向对象(例如，患者)提供治疗益处。
在一些实施方案中，例如在诊断环境中，造血障碍相关分子是疾病的标志物/生物标志物。在一些实施方案中，标志物/生物标志物是生物过程、病理过程或药理应答的指示物。标志物/生物标志物可测量细胞、组织或器官功能或另一种健康指标。
本公开内容所涵盖的造血障碍包括但不限于：白血病、淋巴瘤、免疫缺陷病、自身免疫病、炎性疾病、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血、血小板减少症和缺血再灌注损伤。
白血病包括但不限于：毛细胞白血病(hcl)、急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)、成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)、t细胞或b细胞幼淋巴细胞白血病(pll)、t细胞或b细胞大颗粒淋巴细胞白血病(lgll)、侵袭性自然杀伤细胞白血病。
淋巴瘤包括但不限于：霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，例如免疫缺陷相关的淋巴增生性障碍、原发性中枢神经系统淋巴瘤；前体淋巴赘生物，例如未另外说明的b成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、具有复发性遗传异常的b成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、t成淋巴细胞白血病/淋巴瘤；成熟t细胞和自然杀伤细胞赘生物，例如结外自然杀伤/t细胞淋巴瘤-鼻型、肠病相关t细胞淋巴瘤、肝脾t细胞淋巴瘤、母细胞性自然杀伤细胞淋巴瘤(blasticnaturalkillercelllymphoma)、蕈样肉芽肿病/塞扎里综合征(sezarysyndrome)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、未另外说明的外周t细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤；淋巴浆细胞性淋巴瘤，例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、结外边缘区b细胞淋巴瘤(malt淋巴瘤)、结内边缘区b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、未另外说明的弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、与慢性炎症相关的dlbcl、老年人epstein-barr病毒阳性dlbcl、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、alk+大b细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、hhv8相关多中心卡斯尔曼病(castleman’sdisease)中出现的大b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(burkittlymphoma)/白血病。
免疫缺陷病包括但不限于：威-奥综合征(wiskott-aldrichsyndrome)；获得性免疫缺陷综合征(aids)；毛细血管扩张性共济失调；慢性肉芽肿病；慢性黏膜皮肤念珠菌病；常见变异型免疫缺陷；迪格奥尔格综合征(digeorgesyndrome)；高免疫球蛋白血症e综合征；选择性免疫球蛋白缺少症；正常免疫球蛋白的选择性抗体缺乏；严重联合免疫缺陷；脾脏疾病和免疫缺陷；婴儿暂时性低丙种球蛋白血症；x连锁无丙种球蛋白血症，辐射、化疗、病毒感染或药物例如免疫抑制剂和抗惊厥药诱导的免疫缺陷。
自身免疫病包括但不限于：急性播散性脑脊髓炎(adem)、急性坏死性出血性脑白质炎、艾迪生病(addison’sdisease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗gbm/抗tbm肾炎、抗磷脂综合征(aps)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性家族性自主神经机能异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(aied)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病变、巴洛病(balodisease)、白塞病(behcet’sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯尔曼病、乳糜泻、查加斯病(chagasdisease)、慢性疲劳综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(cidp)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(crmo)、丘-斯综合征(churg-strausssyndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩病、科根综合征(coganssyndrome)、冷凝集素病、先天性心传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、crest病、自发混合性冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(devic’sdisease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征(dressler’ssyndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸细胞性食管炎、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、埃文斯综合征(evanssyndrome)、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(goodpasture’ssyndrome)、肉芽肿性血管炎(gpa)(以前称为韦格纳肉芽肿病)、格雷夫斯病、吉-巴综合征、桥本脑炎、桥本甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍紫癜(henoch-schonleinpurpura)、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(itp)、iga肾病、igg4相关硬化病、免疫调节脂蛋白、包涵体肌炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎、川崎综合征(kawasakisyndrome)、兰-伊综合征(lambert-eatonsyndrome)、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性形iga疾病(lad)、狼疮(sle)、慢性莱姆病、梅尼埃病(meniere’sdisease)、显微镜下多血管炎、混合性结缔组织病(mctd)、莫伦溃疡(mooren’sulcer)、穆-哈病(mucha-habermanndisease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(德维克病)、中性白细胞减少、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、pandas(pediatricautoimmuneneuropsychiatricdisordersassociatedwithstreptococcus，伴有链球菌的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)、帕罗综合征(parryrombergsyndrome)、帕森那-特纳综合症(parsonnage-turnersyndrome)、平坦部炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、poems综合征、结节性多动脉炎、i型、ii型和iii型自身免疫性多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象(raynaudsphenomenon)、反应性关节炎、反射交感性营养不良、赖特尔综合症(reiter’ssyndrome)、复发性多软骨炎、下肢不宁综合征(restlesslegssyndrome)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征(schmidtsyndrome)、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合症(sjogren’ssyndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(sbe)、苏萨克综合征(susac’ssyndrome)、交感性眼炎、高安动脉炎(takayasu’sarteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(ttp)、托-亨综合征(tolosa-huntsyndrome)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(uctd)、葡萄膜炎、血管炎、囊泡性皮肤病、白癜风、韦格纳肉芽肿病(现在称为肉芽肿性血管炎(gpa))。
炎性疾病包括但不限于：动脉粥样硬化、肥胖、牙周炎、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺病(copd)、肠易激疾病/炎性肠病、移植排斥、阑尾炎、滑囊炎、结肠炎、膀胱炎、皮炎、静脉炎、鼻炎、腱炎、超敏反应、盆腔炎、扁桃体炎、寻常痤疮、哮喘、自身炎性疾病、慢性前列腺炎、复杂性区域疼痛综合征(crps)、反射交感性营养不良(rsd)。
本公开内容的方面涉及治疗造血障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向对象(例如，患有造血障碍的对象)施用有效量的靶向根据本文中所述的方法鉴定的造血障碍相关分子的药剂。
如本文中使用的，造血障碍的“治疗”包括但不限于预防、减少、停止造血障碍的发展，减少或消除造血障碍的症状，和/或促进或诱导造血障碍的消退。考虑了本文中所述的任何造血障碍。
有效量的药剂是足以提供医学上期望的结果(例如治疗造血障碍)的量。有效量将根据所治疗的具体疾病、所治疗的对象的年龄和身体状况、疾病的严重程度、治疗持续时间、任何同时疗法的性质、具体施用途径等在健康从业者的知识和专业技能内的因素而变化。为了向对象施用，通常可以使用约0.001、0.01、0.1或1mg/kg直至50、100、150或500mg/kg或更大的剂量。
在一些实施方案中，药剂是小分子、反义寡核苷酸、小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、基因组dna编辑方法例如crispr或抗体。制造这样的药剂的方法在本领域中是已知的。抗体可为全长抗体或其抗原结合片段，例如fab、f(ab)2、fv、单链抗体、fab或sfab片段、f(ab')2、fd片段、scfv或dab片段。用于生产抗体及其抗原结合片段的方法在本领域中是公知的(参见例如sambrook等，"molecularcloning:alaboratorymanual"(第二版)，coldspringharborlaboratorypress(1989)；lewin，"genesiv"，oxforduniversity出版社，newyork，(1990)，以及roitt等，"immunology"(第二版)，gowermedical出版，london，newyork(1989)，wo2006/040153，wo2006/122786，和wo2003/002609)。在一些实施方案中，小分子可为分子量低于900、低于800、低于700、低于600或低于500道尔顿的有机化合物。制备这样的小分子的方法在本领域中是已知的。反义寡核苷酸可为长度小于50个核苷酸(例如，长度为13至25个核苷酸)的经修饰或未经修饰的单链dna分子。sirna可为长度约19至25个碱基对的双链rna分子，其中每条链上具有任选的3’二核苷酸突出端。通常通过本领域已知的化学合成方法来制备反义寡核苷酸和sirna。可将微小rna(mirna)转录，然后从初级微小rna(pri-mirna)加工成祖微小rna(pro-mirna)到前微小rna(pre-mirna)，并且最后加工成成熟的mirna。可通过递送编码pri-mirna的基因至对象中产生mirna，然后在对象中将其加工成成熟的mirna。在一些实施方案中，基因组dna编辑方法可以基于锌指核酸酶，或者在另一些实施方案中基于cas9(来源于ii型crispr-cas细菌适应性免疫系统的rna引导的核酸内切酶)。
药剂及其组合物可以配制成用于多种施用方式，包括全身、表面或局部施用。多种施用途径是可用的。所选择的具体方式将取决于所治疗的造血障碍的类型和治疗效力所需的剂量。一般而言，本公开内容的方法可使用医学上可接受的任何施用方式(意味着产生有效水平的活性化合物而不引起临床上不可接受的不良反应的任何方式)来实践。这样的施用方式包括但不限于经口、经直肠、经表面、经鼻、皮内或肠胃外途径。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内或输注。本文中所述的药物组合物还适当地通过瘤内、瘤周、病灶内或病灶周途径施用以发挥局部以及全身效应。
技术和制剂通常可以见于remington:thescienceandpracticeofpharmacy，pharmaceuticalpress；第22版和其他类似的参考文献中。当施用时，如本文中所述的药剂或抑制剂可以以可药用量和可药用组合物施用。本文中还描述了药物组合物和可药用载体。这样的制剂可常规地包含盐、缓冲剂、防腐剂、可相容载体和任选的其他治疗剂。当用于药物中时，盐应该为可药用的，但是不可药用的盐可方便地用于制备其可药用盐并且不排除在本公开内容的范围以外。这样的药理学上和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，可药用盐可以被制备为碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
本公开内容的一些方面涉及用于诊断对象中的造血障碍的方法。所述方法包括从患有、怀疑患有造血障碍或者具有升高的患造血障碍的风险的对象中获得细胞，并且确定一种或更多种根据本文中所述的方法鉴定的造血障碍相关分子的存在(在细胞内、在细胞表面上、或由细胞分泌)，其中造血障碍相关分子的存在表明对象患有造血障碍或具有患造血障碍的风险。
在一些实施方案中，来自对象的细胞处于来源于对象(例如，患者)的样品中。样品的非限制性实例包括血液、血清、尿液、组织和脑脊液。在一些实施方案中，在一段时间内收集对象的多个样品。“一段时间”旨在包括数天、数周、数月或甚至数年的时间。可在一段时间内获得对象的多个样品，即，以不同的间隔随时间周期性地获得样品。可以以任意间隔获得样品。例如，可以持续数周、数月或数年每天取样。或者，可以持续数周、数月或数年的时间来每周一次或每周六次获得样品。在一个实施方案中，在三个月的时间内每周一次获得样品。在一个实施方案中，持续数月或数年的时间来每月一次获得样品。
获取对象的样品意指拥有该对象的样品。从对象获取样品意指从对象中取出样品。因此，获得对象的样品并确定样品中造血障碍相关分子水平的人并不一定从对象获得生物样品。在一些实施方案中，样品可由执业医师(例如，医生、护士或临床实验室从业者)从对象中取出，然后提供给确定造血障碍相关分子水平的人。样品可由对象或执业医师(例如，医生、护士或临床实验室从业人员)提供给确定造血障碍相关分子水平的人。在一些实施方案中，确定造血障碍相关分子水平的人通过从对象中取出样品而从对象获得生物样品。
应当理解，可以以任何适当的方式处理样品以促进对造血障碍相关分子的水平的测量。例如，可适当地使用生物化学、机械和/或热处理方法来从生物样品中分离目的分子。造血障碍相关分子的水平也可直接在样品中确定。
如本文中使用的，确定造血障碍相关分子的存在是指确定样品中造血障碍相关分子的量或浓度。“确定”可以指造血障碍相关分子水平的确定、计算、核算、测量、感知和/或其组合。在一些实施方案中，确定是指进行测定以测量造血障碍相关分子的水平。在一些实施方案中，“确定”包括例如确定样品中造血障碍相关分子的表达水平或活性水平。在一些实施方案中，确定由造血障碍相关分子基因(或由其逆转录的cdna)编码的mrna的表达水平。在一些实施方案中，确定编码的蛋白质的表达水平。
造血障碍相关分子的水平可通过进行测定来测量。“进行测定”意指测试样品以量化本文中所述的造血障碍相关分子的水平。所使用的测定的实例包括但不限于质谱法、气相色谱法(gc-ms)、hplc液相色谱法(lc-ms)、免疫测定法、northern印迹、western印迹、反相蛋白质阵列(rppa)、用于rna检测的微阵列、流式细胞术和逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)。用于确定生物标志物水平的其他合适的方法对本领域技术人员来说将会明显。
质谱法
造血障碍相关分子的水平可使用质谱法确定，例如maldi/tof(飞行时间(time-of-flight))、seldi/tof、液相色谱法-质谱法(lc-ms)、itraqlc/lc/ms/ms、气相色谱法-质谱法(gc-ms)、高效液相色谱法-质谱法(hplc-ms)、毛细管电泳-质谱法、核磁共振光谱法或串联质谱法(例如，ms/ms、ms/ms/ms、esi-ms/ms等)。参见例如美国公开第20030199001、20030134304和20030077616号。
质谱法在本领域中是公知的并且已经用于量化和/或鉴定蛋白质(参见例如li等.(2000)tibtech18:151-160；rowley等.(2000)methods20:383-397；以及kuster和mann(1998)curr.opin.structuralbiol.8:393-400)。此外，已经开发了允许分离的蛋白质的至少部分从头测序的质谱技术。chait等，science262:89-92(1993)；keough等，proc.natl.acad.sci.usa.96:7131-6(1999)；综述于bergman，exs88:133-44(2000)中。
在某些实施方案中，使用气相离子分光光度计。在另一些实施方案中，使用激光解吸/电离质谱法来分析样品。现代激光解吸/电离质谱法(“ldi-ms”)可以以两种主要的变型实施：基质辅助激光解吸/电离(“maldi”)质谱法和表面增强激光解吸/电离(“seldi”)。这两种方法可以通过例如使用seldi亲和表面来捕获分析物并将含有基质的液体添加到捕获的分析物中以提供能量吸收材料来组合。
关于质谱仪的另外的信息，参见例如principlesofinstrumentalanalysis，第3版，skoog，saunderscollegepublishing，philadelphia，1985；和kirk-othmerencyclopediaofchemicaltechnology，第4版第15卷(johnwiley&sons，newyork1995)，第1071-1094页。
检测造血障碍相关分子的存在通常涉及信号强度的检测。这进而可以反映结合至底物的多肽的量和特性。例如，在某些实施方案中，可以比较来自第一样品和第二样品的光谱的峰值的信号强度(例如，目视、通过计算机分析等)，以确定特定生物分子的相对量。可以使用诸如biomarkerwizard程序(ciphergenbiosystems，inc.，fremont，calif.)的软件程序来帮助分析质谱。质谱仪及其技术对于本领域技术人员而言是公知的。
任何本领域技术人员理解，质谱仪的任何部件(例如，解吸源、质量分析器、检测器等)和多种样品制剂可以与本文中所述的其他合适的部件或制剂或者本领域已知的部件或制剂组合。
免疫测定
“放射免疫测定”是使用标记(例如，放射性标记)形式的抗原来检测和测量抗原浓度的技术。抗原的放射性标记的实例包括3h、14c和125i。样品中的一种或更多种造血障碍相关分子的浓度通过使生物样品中的抗原与标记(例如放射性地)的抗原竞争结合所述抗原的抗体来测量。
最常见的酶促免疫测定是“酶联免疫吸附测定(elisa)”。elisa是使用标记(例如酶连接)形式的抗体来检测和测量抗原浓度的技术。存在不同形式的elisa，其是本领域技术人员公知的。elisa的本领域已知的标准技术描述于“methodsinimmunodiagnosis”，第2版，rose和bigazzi，编辑.johnwiley&sons，1980；campbell等，“methodsandimmunology"，w.a.benjamin，inc.，1964；以及oellerich，m.1984，j.clin.chem.clin.biochem.22:895-904中。
在“夹心elisa”中，将抗体(例如，造血障碍相关分子的抗体)与固相(即微量滴定板)连接并使其暴露于含有抗原(例如造血障碍相关分子)的生物样品。然后洗涤固相以除去未结合的抗原。然后将标记的抗体(例如，酶连接的)与结合抗原(如果存在)结合形成抗体-抗原-抗体夹层结构。可以与抗体连接的酶的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶、脲酶和β-半乳糖苷酶。酶联抗体与底物反应以产生可以测量的有色反应产物。
在“竞争性elisa”中，将抗体(例如，造血障碍相关分子的抗体)与含有抗原(即造血障碍相关分子)的样品一起孵育。然后使抗原-抗体混合物与用抗原(即muc3、pga3和/或β2m)包被的固相(例如微量滴定板)接触。样品中存在的抗原越多，可用于与固相结合的游离抗体越少。然后将标记(例如酶连接)的二抗添加到固相中以确定与固相结合的一抗的量。
在“免疫组织化学测定”中，通过使组织暴露于对正被测定的蛋白质具有特异性的抗体来测试组织切片的特定蛋白质。然后通过多种方法中的任一种使抗体可视化以确定蛋白质的存在和存在的蛋白质的量。用于使抗体可视化的方法的实例例如是通过与抗体连接的酶(例如，萤光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖苷酶)或化学方法(例如，dab/底物发色团(substratechromagen))。
根据从业者的偏好并基于本公开内容，可使用其他技术来检测造血障碍相关分子。一种这样的技术是western印迹(towbin等，proc.nat.acad.sci.76:4350(1979))，其中使经适当处理的样品在转移至固体支持物例如硝酸纤维素滤膜之前在sds-page凝胶上运行。可检测标记的抗体优先结合本文中所述的造血障碍相关分子。水平可以例如通过密度测定法量化。
rna检测技术
rna转录物的检测可通过northern印迹来实现，例如，其中使rna的制备物在变性琼脂糖凝胶上运行，并转移至合适的支持物例如活化的纤维素、硝酸纤维素或者玻璃或尼龙膜。然后将放射性标记的cdna或rna与制备物杂交，洗涤并通过放射自显影术分析。
rna转录物的检测可以进一步使用已知的扩增方法完成。例如，将mrna转录成cdna，随后进行聚合酶链反应(rt-pcr)，或者使用如美国专利第5,322,770号中所述的用于两个步骤的单一酶，或者如r.l.marshall等，pcrmethodsandapplications4:80-84(1994)所述将mrna逆转录成cdna，随后进行对称空隙连接酶链反应(rt-aglcr)在本公开内容的范围内。
本文中可以利用的另一些已知扩增方法包括但不限于pnasusa87:1874-1878(1990)中所述的并且也描述于nature350(no.6313):91-92(1991)中的所谓的“nasba”或“3sr”技术；如公布的欧洲专利申请(epa)第4544610号中所述的q-β扩增；链置换扩增(如g.t.walker等，clin.chem.42:9-13(1996)和欧洲专利申请第684315号中所述的)；以及如pct公开wo9322461所述的靶介导的扩增。
也可使用原位杂交可视化，其中使放射性标记的反义rna探针与活检样品的薄切片杂交、洗涤、用rna酶切割并暴露于用于放射自显影术的感光乳剂。样品可用苏木精染色以证明样品的组织学组成，并且用合适的滤光器进行暗场成像显示显影的乳剂。也可使用非放射性标记例如地高辛。
在一些实施方案中，本文中公开的方法与本领域已知的用于诊断造血障碍的其他方法联合进行。
在一些实施方案中，概述分析结果(即对象的诊断)和与分析有关的任何其他信息的报告可以任选地作为分析的一部分生成(这可在本文中可互换地称为“提供”报告、“制作”报告或“生成”报告)。报告的实例可包括但不限于纸质报告(例如测试结果的计算机生成的打印输出)或存储在计算机可读介质(例如cd、计算机硬盘驱动器或计算机网络服务器等)上的等同格式和报告。报告(特别是存储在计算机可读介质上的报告)可以是数据库的一部分(例如患者记录数据库，其可以是具有限制访问报告的安全特征(例如，仅允许患者和患者的执业医师查看报告)的“安全数据库”)。除了生成有形报告以外或作为生成有形报告的替代方案，报告还可以显示在计算机屏幕(或另一种电子设备或仪器的显示器)上。可以将报告进一步传送、通信或报告(这些术语在本文中可互换使用)给例如被测试的个体、执业医师(例如，医生、护士、临床实验室从业者、遗传咨询师等)、医疗机构、临床实验室和/或旨在查看或拥有该报告的任何其他方。基于报告的形式，“传送”或“通信”报告的行为可以通过本领域已知的任何方式进行，并且包括口头和非口头传送。此外，“传送”或“通信”报告可以包括投递(“推送(pushing)”)报告和/或取回(“拉回(pulling)”)报告。例如，非口头报告可以通过这样的方式传送/通信：在各方之间物理地转移(例如对于纸质形式的报告)；例如通过物理地从一方递送给另一方；或者以电子方式或以信号形式(例如，通过电子邮件或通过因特网、通过传真、和/或通过本领域已知的任何有线或无线通信方法)传送；例如通过从存储在计算机网络服务器上的数据库中取回等。
通过以下实施例进一步说明本公开内容，所述实施例绝不应当理解为进一步的限制。整个本申请中引用的所有参考文献(包括著作文献、授权专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容在此通过引用明确地并入。
实施例
实施例1：毛细胞白血病中的cd38是不良预后的标志物和治疗的新靶标
毛细胞白血病(hcl)以细胞内信号传导分子rhoh的低表达为特征。rhoh表达的重建在小鼠模型中限制了hcl发病机理，表明这可能代表新的治疗策略。然而，尽管rhoh重建理论上可能作为一种疗法，但其在技术上非常具有挑战性，因为需要特异性靶向适当地发挥功能的rhoh蛋白。由于该问题，开始进行hcl表面上的依赖于rhoh低表达的可用药蛋白质的鉴定。一种这样的蛋白质被鉴定为cd38。51名hcl患者的分析表明18名是cd38阳性的。23名复发的hcl患者的临床记录询问表明，cd38阳性的那些患者到补救治疗的平均时间比cd38阴性患者短71个月。hcl细胞中cd38基因的敲除增加了凋亡，抑制了对内皮单层的黏附，并且损害了在体内产生肿瘤的能力。此外，抗cd38抗体证明针对预先存在的hcl肿瘤有效。总之，数据表明hcl中的cd38表达通过促进存活和异型黏附来驱动不良预后。数据还表明，cd38阳性hcl患者可从基于cd38靶向的治疗中受益。
毛细胞白血病(hcl)是一种顽固的淋巴组织增生性疾病，其以外周血、骨髓、肝和脾中的全血细胞减少、肝肿大、脾肿大、白细胞增多和赘生性单核细胞为特征(1)。可以通过用嘌呤核苷类似物喷司他丁或克拉屈滨的一线治疗和包括利妥昔单抗或维罗非尼的二线治疗来实现接近95％的完全缓解率(2、3)。然而，尽管有这些令人印象深刻的统计数据，但相当大比例的hcl患者无法对治疗作出响应或者发展耐药性疾病(3)。此外，约48％的患者在15年内复发，并且随着时间的推移复发发生率提高(4)。由于hcl通常出现在中年后期，因此人口老龄化的国家可以预期对新疗法的需求增加。
hcl的诊断标志物之一是编码cd11c的基因的异常表达(5)。通常，该基因仅在髓系细胞中转录(6)。然而，在hcl中，其也在赘生性淋巴细胞中转录。这种异常转录是由原癌基因jund与cd11c基因启动子的组成型结合驱动的(7)。沿着级联分子事件追溯，我们证明jund的这种活化是由通过细胞内ras途径的组成型信号传导引起的(7)。
已经显示，ras超家族成员的信号传导受到高定量水平的rhoh的抑制(8)。发现，hcl以rhoh的长期低表达为特征(9)。因此，在hcl中发现的低水平rhoh可能允许ras家族成员具有活性并驱动疾病发病机理。rhoh表达的体外重建抑制了cd11c的异常表达以及为hcl标志的黏附和跨内皮迁移(9)。在异种移植小鼠模型中，rhoh重建严重限制了hcl发病机理并防止死亡率(9)。
临床前研究表明rhoh重建可作为hcl的新疗法。然而，这种疗法从实验台过渡至医院病床在技术上极其困难。首先，它需要将重组蛋白质引入到毛细胞内。其次，它需要这种蛋白质仅特异性靶向毛细胞。第三，它需要蛋白质在细胞内时具有功能和适当的活性。由于这些挑战，寻找这样的蛋白质：其依赖于rhoh低表达，但在细胞表面上产生且如此易被靶向。
为了鉴定依赖于rhoh低表达的细胞表面蛋白质，利用差异微阵列分析来比较用rhoh重构的hcl的转录组与未重构的hcl的转录组。该分析表明编码细胞表面蛋白cd38的mrna依赖于rhoh的低表达。随后，这种依赖性在蛋白质水平上得到证实。这些发现导致了这样的假设：cd38可参与hcl的发病机理并且其靶向可能是治疗性的。为了检验该假设，对已经敲除cd38基因的hcl进行功能分析。这些研究表明，cd38促进hcl存活、异型黏附和小鼠中异种移植物的生长。该cd38在hcl发病机理中起作用通过cd38阳性患者比cd38阴性患者显著更快复发这一发现进一步证明。通过流式细胞术或免疫组织化学的51名hcl患者的分析证明18名患者是cd38阳性的。在小鼠模型中测试人源化抗cd38抗体sar650984表明，这种约三分之一的hcl患者可从抗cd38治疗的开发中受益。
结果
hcl中的cd38表达依赖于低水平rhoh
在先前的研究中，确定hcl以细胞内信号传导分子rhoh的低表达为特征(9)。这种低水平的表达可能通过发动ras信号传导而在疾病的发病机理中起作用，所述ras信号传导最终导致cd11c基因的异常转录和赘生性淋巴细胞的随后外渗(7、9)。rhoh表达的重建改善异种移植小鼠模型中的hcl发病机理(9)。然而，这种治疗方法向临床的过渡不太可能是固有的，因为以细胞内蛋白质的重建作为目标具有极大的挑战。因此，寻找依赖于rhoh低表达的可易于用药的表面蛋白质。这是通过使用细胞系jok-空和jok-rhoh实现的(9)。这些品系来源于hcl细胞系jok-1并稳定表达亲本载体pmep4或编码rhoh的相同载体。通过差异微阵列分析比较这两种衍生物的转录组证明，编码表面蛋白cd38的mrna在jok-rhoh中以其在jok-空(p＝0.003)中表达的水平的0.145表达。通过rt-pcr分析证实rhoh重构对cd38mrna表达的抑制(图1a)。通过western印迹证明cd38蛋白表达的抑制(图1b)。最后，流式细胞术证明rhoh重构抑制cd38的表面表达(图1c)。
cd38由hcl细胞系和hcl患者两者差异表达
最初通过western印迹通过检查一系列不同细胞系来评估jok-1以外的hcl中cd38的表达(图2a)。这样的分析表明，hcl细胞系jok-1、hc-1、hair-m和eskol是cd38阳性的，而hcl品系eh/k是阴性的。通过hcl患者的分析证实了hcl中cd38的差异表达这一发现。在美国gundersenhealthcenter诊断的八名hcl患者中的两名在骨髓活检中显示出cd38表达(图2b)。此外，在法国centrehospitalieruniversitairedecaen诊断的43名hcl患者的临床记录的检查显示，16名在骨髓和/或外周血中呈cd38阳性。总之，来自美国和法国的结果表明，约三分之一的hcl患者的赘生性淋巴细胞表现出cd38表达。该比例与瑞典对于hcl患者报道的一致(15)。
cd38表达是不良hcl预后的标志物
通过在centrehospitalieruniversitairedecaen诊断为经典hcl的43名患者的临床记录的回顾性分析来评估cd38表达对临床过程的影响。特别地，研究了一线治疗结束与第一次复发时补救治疗开始之间的时间。该间隔被指定为距离下一次治疗的时间(ttnt)。在43例中，发现，对于为cd38阴性的27名患者，ttnt为83个月，但对于为cd38阳性的16名患者，ttnt仅为42个月(图3a)。当具体分析43名患者中复发的23名时，cd38阴性病例与cd38阳性病例之间的ttnt的差异更加显著。在此，为cd38阴性的15名患者的ttnt为95个月，但对于为cd38阳性的8位患者仅为24个月(图3b)。
cd38表达通过防止凋亡促进hcl生长
临床证据表明hcl中的cd38表达与不良预后相关。接着，研究了cd38表达是否表示了hcl发病机理中的驱动者或过客。这通过利用为cd38阳性的hcl细胞系jok-1来解决(图1b、2a)。锌指核酸酶技术产生该品系的库，其在cd38编码区内含有纯合的移码突变或在该相同区域内不含突变(图8)。这些库分别被命名为jok-cd38-ko和jok-cd38-wt。两个库的比较证明，在具有相同数目的细胞的培养开始后8天，jok-cd38-ko细胞的数目比jok-cd38-wt少36％(图4a)。细胞在培养物中生长的速度表示细胞分裂与细胞死亡之间余数的总和。因此，研究了这些过程中的哪一个是jok-cd38-ko和jok-cd38-wt的生长速率差异的原因。5-乙炔基-2’-脱氧尿苷的并入证明，在jok-cd38-ko培养物中，细胞周期的dna合成阶段中细胞的百分比与jok-cd38-wt培养物中的细胞的百分比没有显著差异(图4b)。因此，cd38表达似乎不影响体外hcl增殖。然而，相比之下，当通过膜联蛋白v的细胞表面结合和dna对碘化丙锭的可接近性来评估细胞凋亡时，发现培养72小时后jok-cd38-ko的固有凋亡率比jok-cd38-wt高约三分之一(图4c)。因此，cd38表达似乎不是通过引起增殖增加而是通过增加细胞存活来增强hcl生长。
cd38表达促进hcl黏附
t细胞和cllb-淋巴细胞与内皮细胞的黏附先前已被证明是由cd38介导的(16、17)。因此，研究了cd38也有助于hclb-淋巴细胞黏附特性的可能性。制备人微血管内皮细胞的汇合单层，并用lps激活或不作处理。然后评估jok-cd38-ko和jok-cd38-wt黏附于这些单层的能力(图5)。该分析证明，与jok-cd38-wt相比，jok-cd38-ko结合未活化的内皮细胞的能力低34％，并且结合活化的内皮细胞的能力低39％。
cd38影响体内hcl肿瘤的生长
体外进行的分析表明，cd38驱动hcl存活和黏附(图4c、5)。这些结果表明cd38表达可能有助于体内hcl的发病机理。因此，为了解决该问题，将jok-cd38-wt和jok-cd38-ko皮下注射到免疫缺陷小鼠中。4周后，切下产生的肿瘤，称重并测量它们的尺寸。该分析证实，源自jok-cd38-ko的肿瘤的体积比源自jok-cd38-wt的肿瘤平均小40％(图6a)。此外，肿瘤重量平均减少43％(图6b)。因此，这些结果支持了cd38影响体内hcl发病机理的假设。
靶向cd38使体内预先存在的hcl肿瘤退化
用jok-cd38-ko进行的实验表明，靶向hcl中cd38表达可能具有治疗效力。这使用其中cd38表达保持完整的jok-cd38-ko的亲本来测试。亲本品系被设计成使其组成型地产生萤光素酶，并因此可以在萤光素的存在下通过发光而被可视化。然后将该品系注射到免疫缺陷小鼠的腹膜中并允许形成肿瘤。然后用非免疫对照抗体或抗cd38抗体sar650984处理这些肿瘤(18)。发光成像证明，肿瘤在用对照抗体处理之后倾向于继续生长，但通过用sar650984处理而倾向于减少(图7)。
讨论
hcl是主要具有与记忆b淋巴细胞有关的遗传特征的细胞的顽固的赘生物(1、19)。固定百分比的hcl病例对可用的治疗具有抗性或复发具有难治的疾病(3、4)。hcl通常存在于中年后期。因此，在婴儿潮一代达到退休的诸如北美和西欧的世界区域中，需要新疗法的hcl患者绝对数目必然增加。在此，首次报道了，靶向cd38可以代表一种这样的新疗法。约三分之一的hcl患者表现出cd38表达，并且该表达与不良预后有关。体外开发的证据表明，这种增强的发病机理的分子基础是cd38引起淋巴细胞存活增加和结合内皮的能力增加的能力。
hcl中cd38表达的自然历史与cll中的cd38表达具有惊人的相似性。两者均是具有与记忆b细胞表型有关的表型的顽固的赘生物(19-21)。当将阳性的截止点设置为30％的恶性克隆时，约三分之一的hcl和cll患者均是cd38阳性的(22-24)。在hcl和cll两者中，cd38介导与内皮细胞的黏附(16、17)。在hcl和cll两者中，cd38防止凋亡(25、26)。在hcl和cll两者中，cd38阳性为阴性预后指标(22、24、27-31)。
现在广泛接受的是，在cll中，在血流与淋巴组织之间存在赘生性细胞的动态转移。在循环中，cll细胞表现出对凋亡的抗性，但其增殖能力受损，而在淋巴组织中，它们易于凋亡或诱导增殖(32-35)。这些发现表明，淋巴组织的微环境对于cll增殖是必需的，但对于细胞凋亡抗性不是必需的(36)。cd38牵涉介导依赖于微环境的cll增殖和不依赖于微环境的生存两者(16、37、38)。从cll至hcl外推cd38的这些作用将为敲除cd38基因不能影响hcl单一培养物中的细胞分裂，但会损害存活这一观察结果提供解释。
除了cll以外，先前已经发现cd38在大范围的其他血液恶性肿瘤中表达，包括b细胞和t细胞急性成淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、b细胞非霍奇金淋巴瘤和急性髓细胞性白血病(39-42)。在这些恶性肿瘤的异种移植模型中靶向cd38已被证明具有治疗效力，并且目前正在进行试验以确定临床效用(43-50)。在此报告的结果表明，hcl应该被添加到评估抗cd38疗法的血液癌症列表中。然而，由于单一疗法常常导致耐药性疾病的演化，因此将cd38靶向与现有的hcl治疗例如嘌呤类似物和靶向cd20和b-raf的药剂组合可能证明特别有益。
材料和方法
患者材料
对从在gundersenmedicalcenter，lacrosse，wisconsin诊断患有经典hcl或慢性淋巴细胞白血病(cll)的患者收集的福尔马林固定的石蜡包埋的骨髓活检进行免疫组织化学分析(10、11)。cd38的预后能力通过检查在法国centrehospitalieruniversitairedecaen，caen诊断患有经典hcl的43名患者的临床记录来确定。在hcl的royalmarsden评分系统中，这些患者中的9名得分为3分，34名患者得分为4分(12)。将多参数流式细胞术显示30％或更多的hcl细胞表现出cd38表达的情况指定为cd38阳性。当患者的血小板计数低于100×109/l，血红蛋白水平低于10g/dl或绝对中性粒细胞计数低于1×109/l时，开始一线和补救治疗。
免疫组织化学
将含有骨髓活检试样的福尔马林固定的石蜡包埋块以4μm连续切片，并在
细胞培养
毛细胞系hc-1获得自deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsmz)(braunschweig，德国)。毛细胞系eh由guyb.faguet(veteransadministrationmedicalcenter，augusta，ga)提供。随后发现eh的真实身份是毛细胞系hk(13)。因此，在本文中该品系被称为eh/k。毛细胞系eskol由edwardf.srour(indianauniversityschoolofmedicine，indianapolis，in)提供。毛细胞系jok-1和hair-m由
稳定的细胞系库的产生
质粒pgl4.51[luc2/cmv/neo]包含受巨细胞病毒(promega，corp.，madison，wi，美国)的组成型基因启动子控制的萤火虫(photinuspyralis)的萤光素酶基因。该质粒用限制性核酸内切酶sali线性化并转染到hcl细胞系jok-1中。随后通过对1mg/mlg418(sigma-aldrich，corp.，st.louis，mo，美国)的抗性来选择细胞系库jok-luc。使用compozr锌指核酸酶(zfn)试剂盒(ckozfnd5725，sigma-aldrich，corp.)在hcl细胞系jok-1中设计cd38基因的敲除。亲本jok-1细胞用试剂盒中的两种zfn质粒中的每一种转染，并通过bdfacsariatmi细胞分选仪(bectondickinson，franklinlakes，nj，美国)使用fitc标记的小鼠抗-人cd38抗体和同种型匹配的非免疫fitc标记的抗体(分别为克隆ib6和is6-11e5.11)(miltenyibiotec，paris，法国)分离cd38阴性细胞。使用细胞分选仪的自动克隆模块在96多孔培养板中将cd38阴性细胞分离为单个克隆。以相同的方式从大多数转染的亲本jok-1细胞中分离cd38阳性克隆。接着，通过zfn靶向区域对每个分离克隆中的cd38基因进行测序(表1)。预期的靶序列是位于4号染色体上的cd38基因的正链上的
表1：可能被用于产生细胞系库jok-cd38-ko和jok-cd38-wt的zfn识别的靶序列的基因组定位(序列从上到下对应于seqidno：4-13)
鉴定出在cd38编码区内含有纯合的移码突变的6个克隆(图8)。鉴定出在该相同区域内不含突变的6个克隆。首先将所有经验证的克隆单独培养，然后将每种的106个细胞混合在一起以产生代表其中cd38基因分别为野生型或突变的hcl的细胞系库jok-cd38-wt和jok-cd38-ko。通过western印迹和流式细胞术评估每个这些库中cd38的表达(图9-10)。
微阵列分析
如先前所述使用人全基因组agilent44k60-聚体寡核苷酸微阵列和agilentdna微阵列g2505b扫描仪(agilenttechnologies，lesulis，法国)比较jok-rhoh和jok-空的转录物组(14)。表达数据通过featureextraction9.1.3.1版提取，然后通过genespring7.3版(agilenttechnologies)进行分析。
定量rt-pcr
将来自细胞培养物的总rna纯化，然后使用moloney鼠慢病毒逆转录酶和随机引物(invitrogen，lifetechnologies，corp.)逆转录成cdna(9,14)。接着，使用taqmanuniversalmastermix和含有cd38特异性taqman探针的cd38geneexpressionassayhs01120068_m1和引物(appliedbiosystems，lifetechnologies，corp.)使100ng产生的cdna经受定量pcr。使用由cd38阳性细胞系hc-1产生的cdna的连续稀释构建的线性回归曲线量化cd38表达水平，然后将其相对于ablmrna的表达归一化(9、14)。使用sds2.4软件(appliedbiosystems，lifetechnologies，corp.)的标准方案在7900ht实时pcr系统上进行pcr。
western印迹
使用
流式细胞术
通过将5×105个细胞与针对cd38的单克隆抗体ib6(miltenyibiotec)的fitc缀合形式一起孵育来进行jok-空、jok-rhoh、jok-cd38-wt和jok-cd38-ko的流式细胞术分析。这些实验的同种型匹配的对照使用igg2b克隆is6-11e5.11(miltenyibiotec)的fitc缀合形式。在与抗体孵育后，使用配备有summit软件4.3(beckmancoulter，inc.，fullerton，ca，美国)的cyantmadp流式细胞仪分析细胞。
细胞周期测定
使用
凋亡测定
启动jok-cd38-wt或jok-cd38-ko的培养。72小时后，将5×105个细胞在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤，然后与fitc缀合的膜联蛋白v和碘化丙啶(pi)(beckmancoulter，inc.，villepinte，法国)一起孵育。通过流式细胞术确定也为膜联蛋白v阳性的pi阳性细胞的百分比，并将其作为正在经历凋亡的培养物的比例。
异型黏附测定
如前所述，评估jok-cd38-wt或jok-cd38-ko黏附于hmec-1的能力(9)。简而言之，在96多孔组织培养板中产生hmec-1的单层，并用100ng/mllps活化或不作处理。将jok-cd38-wt或jok-cd38-ko培养物与5μmbcecf-am(lifetechnologies，corp.)一起孵育，洗涤，然后将105个这些标记的细胞放置到单层上。允许在37℃下黏附1小时，然后洗涤单层，并使用
小鼠饲养
将用于hcl的皮下异种移植的小鼠圈养在green
异种移植小鼠模型
使用细胞系库jok-cd38-wt或jok-cd38-ko的5×106个皮下注射到株系为nod.cg-prkdcscidil2rγtm1wjl/szj(jacksonlaboratory，barharbor，me，美国)的6至8周龄的雄性或雌性小鼠中来评估cd38在hcl中的作用。注射后四周，处死小鼠并切下肿瘤，称重并用电子卡尺测量。根据公式(4×π×l×w×t)/3计算肿瘤体积，其中l为长度，w为宽度，t为厚度。使用细胞系库jok-luc的4×106个注射到株系为hsd:athymicnude-foxn1mu(harlanlaboratories，inc.，indianapolis，in)的3至4周龄的雌性小鼠腹膜中来评估靶向cd38的治疗效力。3天后，将小鼠麻醉并静脉内注射150μl含有15mg/mld-萤光素钾盐(registechnologies，inc.，mortongrove，il)的dulbecco磷酸盐缓冲盐水。使用msfxpro体内成像系统(brukercorp.，billerica，ma)获得叠加发光和x射线图像。成像后第二天，向具有可见肿瘤的小鼠腹膜内注射120μl含有1mg/ml人源化抗cd38抗体sar650984(sanofioncology，cambridge，ma)或从人骨髓瘤血浆纯化的非免疫igg1κ抗体(sigma-aldrich，corp.)的磷酸盐缓冲盐水。两天后重复抗体注射，接下来一天再次对小鼠进行成像。腹膜内异种移植方案得到美国威斯康星州拉克罗斯市威斯康星大学的动物管理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)的批准。皮下异种移植方案得到法国nord-pas-de-calais的动物护理伦理委员会(animalcareethicalcommittee)的批准。
序列
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等同方案
前述书面说明书被认为足以使本领域普通技术人员能够实践本公开内容。本公开内容在范围上不受所提供的实施例的限制，因为这些实施例旨在仅作为本公开内容的一个或更多个方面的说明。其他功能上等同的实施方案被认为在本公开内容的范围内。根据前述描述，除了本文中所示的和所述的那些以外的本公开内容的多种修改对于本领域技术人员而言将变得明显。本公开内容的每个限制可以涵盖本公开内容的多种实施方案。因此，预期涉及任一个要素或要素组合的本公开内容的每个限制可以被包括在本公开内容的每个方面中。本公开内容在其应用上不限于附图中阐述或示出的部件的构造和布置的细节。本公开内容能够具有其他实施方案并且能够以多种方式实践或实施。
此外，本文中使用的措辞和术语是为了描述的目的，而不应该被认为是限制。本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意在涵盖其后列出的项目及其等同物以及附加项目。
在本申请中引用的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。