经常分析复杂样品，诸如血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和其他生物流体以鉴定样品内的分析物或表征样品内的分析物。鉴定或表征此类复杂样品的多个分子中的分析物经常是困难且耗时的。
附图简述
图1是实例酶促样品纯化系统的示意图。
图2是实例酶促样品纯化方法的流程图。
图3是实施图2的实例方法的实例酶促样品纯化系统的图。
图4是实例酶促样品纯化系统的示意图。
图5是实例酶促样品纯化系统的示意图。
实例的详述
本文公开了利用酶以促进用于分析的样品的更快且成本更低的制备的酶促样品纯化系统和方法的不同实例。许多复杂样品诸如血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和其他生物流体都含有蛋白的降解产物，诸如氨基酸和肽，其干扰复杂样品中靶分析物的检测和感测。因为蛋白降解产物可以具有与许多靶分析物的类似的尺寸和其他特性，所以此类蛋白降解产物的分离和去除可能是困难的。实例酶促样品纯化系统和方法利用与蛋白降解产物反应以形成尺寸大得多的多肽的酶。实例酶促样品纯化系统和方法利用具有不同尺寸的孔的多孔基质。较小的孔含有多肽合成酶，同时将来自接收的样品的靶分析物熵驱动地(entropically)保留在反应室内。较大的孔形成一系列孔以在反应室内形成多肽通道，并且通过所述多肽通道，由酶和蛋白降解产物的反应产生的形成的多肽行进至废物室，将具有靶分析物的纯化样品留在反应物内用于随后的提取和分析。形成的多肽向废物室的运输在反应室中产生非平衡状态，增强酶和剩余蛋白降解产物的进一步反应。增强的反应形成额外的多肽，其通过反应室中的多肽通道继续行进至废物室。循环继续，用于样品的增强纯化。
图1示意性说明实例酶促样品纯化系统20，其可以促进更快速、成本更低且更有效地纯化样品用于分析。系统20通过利用与蛋白降解产物反应以形成尺寸大得多的多肽的多肽合成酶来纯化样品。如下文将描述，系统20促进形成的多肽向废物室的连续迁移或运输，使得在反应室内持续非平衡状态。反应室内的持续非平衡状态增强剩余蛋白降解产物与酶的进一步反应以形成额外的多肽，其也移出反应室，将具有其靶分析物的更纯化的样品留在反应室中。
为了在反应室内产生持续的非平衡状态，系统20利用不同尺寸的孔的多孔基质和由基质的较大孔形成的多肽通道，以促进形成的多肽连续运输出反应室并进入废物室。同时，一定数量的较小孔熵驱动地诱捕或保留反应室内的靶分析物，其与已运输至废物室的多肽(和PDP)分离。这种熵驱动的诱捕是大量较小孔的结果，所述较小孔为较小的靶分析物提供了长得多、弯曲和迷宫样的可用路径，而较大孔提供了更受限制且更直接的路径，用于多肽移动至废物室。如图1所示，系统20包括反应室24、废物室26和多孔基质30。
反应室24包括具有端口34以接收含有靶分析物(A)52和蛋白降解产物(PDP)54的样品50的腔室(示意性显示)。反应室24含有多肽合成酶60(在图中用“E”示意性说明)。基于待分析的样品50中的靶分析物52的特征来特定地选择酶60。特定地选择酶60以便与PDP 54反应以形成多肽，同时不与分析物52反应以形成多肽。不同的蛋白合成酶60的实例包括，但不限于，蛋白酶诸如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等。根据靶分析物60，可以利用其他多肽合成酶60。
在一些实施方式中，反应室24可以含有其他元件，诸如酶辅因子、助溶剂和缓冲液。酶辅因子是催化酶和PDP 54之间的反应的非蛋白分子。酶辅因子的实例包括，但不限于，铜离子。
助溶剂包含悬浮酶60并溶解其他物质以形成溶液的液体分子。在一个实施方式中，可以选择助溶剂以增强酶60与PDP 54的反应性。在一个实施方式中，所述助溶剂可以是有机的。在其他实施方式中，所述助溶剂可以是含水的。助溶剂的实例包括，但不限于，甘油。
缓冲液包含作为溶液的一部分抑制溶液的pH变化的分子。此类缓冲液可以充当将pH保持在几乎恒定值的手段。缓冲液的实例包括，但不限于，磷酸盐缓冲液。可以选择酶辅因子、助溶剂和缓冲液中的每一种以促进有利于形成、而不是断裂酰胺键以形成多肽的热力学条件。
在一个实施方式中，反应室24预先填充酶60以及酶辅因子、助溶剂和缓冲液，其中然后将反应室24“工厂密封(factory sealed)”，直至使用。在一个实施方式中，可以标记系统20，用于与特定类型的样品50、特定类型的PDP 54和/或特定类型的靶分析物52一起使用，其中废物室24预先填充适当量和相对量的所选的一种或多种酶60以及最适合于特定类型的样品50、特定类型的PDP 54和/或特定类型的靶分析物52的各自的辅因子、助溶剂和缓冲液。作为结果，可以特定地调整反应室24内具有预先填充的溶液混合物的不同组合的不同的系统20，用于排除特定PDPs 54、特定氨基酸和/或寡肽。因为系统20可以在受控的制造规范下大规模生产，可以在范围上减小或消除单独制备酶促“鸡尾酒”的任务，潜在地减少技术人员错误。此外，减少与单独制备纯化样品50的溶液相关的时间和成本。因为系统20是独立的(self-contained)，所以系统20可以改为便携式应用。
多孔基质30包括在反应室24内布置或在反应室24内含有的一种或多种材料的网格或基质。多孔基质30包括互相连接的内部空间或体积(称为小室或孔)的基质。在所示实例中，多孔基质30包括开放小室孔70和开放小室孔72。
开放小室孔70(由较小尺寸八角形示意性代表)彼此互相连接并连接至孔72。开放小室孔70的尺寸设定为接收样品50的靶分析物52，但排除由PDP54和酶60的反应产生的多肽。开放小室孔70的尺寸设定为使样品50的PDP 54(氨基酸和寡肽)可进入，但随后形成的多肽不可进入。孔70的确切尺寸可以根据经验确定，并且可以取决于样品50的靶分析物52的特定尺寸特征以及将使用酶60从PDP 54形成并从反应室24排出的多肽的预期尺寸。
如图1所示，孔70如果没有含有大多数酶60的话，也含有大量的酶60。在一个实施方式中，酶60在不同孔70之间和不同孔70中移动。由于相对大量的孔70，酶60被熵驱动地诱捕在反应室24内。
开放小室孔72(由较大八角形示意性代表)彼此互相连接并散布在孔70中。孔72尺寸大于孔70。孔72尺寸被设定为等于或大于将由PDP 54和酶60的反应形成的多肽的预期分子尺寸。至少一些孔72彼此互相连接，以便形成一系列或一连串的互相连接的孔72。一连串互相连接的孔72形成多肽通道76，其从反应室24的内部延伸至废物室26。在一个实施方式中，至少一个多肽通道76，且在一个实施方式中，至少大部分多肽通道76，从废物室26延伸跨越基质30的至少50％的长度，且在一个实施方式中延伸跨越基质30的至少90％的长度，垂直地(orthogonally)远离废物室26，以便到达远离废物室26的基质30的更远端区域。每个多肽通道76促进形成的多肽在产生多肽时运输出反应室24并进入废物室26，促进室24内的形成的多肽和酶60之间的持续的非平衡状态。
在一个实施方式中，通过在反应室24中提供足够密度的孔72(每单位体积孔72的数量)以增加孔72将相互连接且将形成到达废物室26的多肽通道76的可能性，以随机方式实现孔72的互相连接以形成多肽通道76。在一个实施方式中，孔70包括至少10％且不大于95％的基质30，且其余部分包括孔72。在又另一个实施方式中，孔70包括至少80％且不大于95％的多孔基质30。
当孔70的相对数量相对于孔72的相对数量增加时，较大数量的多肽通道76的可能性降低，可能减慢形成的多肽可以运输出反应室24进入废物室26的速率。然而，同时，较大相对数量的孔70为基质30提供了熵驱动地诱捕和保留酶60以及靶分析物52的增强的能力。如下文将描述，在其他实施方式(其提供场以加速多肽通过通道76运输或移动至废物室26)中，基质30熵驱动地诱捕和保留靶分析物52的增强的能力可以允许提供的场的强度更强，以增加多肽迁移至废物室26的速率。孔70和孔72的相对数量可以变化，这取决于样品50的纯化的可用时间和样品50待纯化的程度(从反应室24中提取的最终纯化样品50中的少量PDP的容忍度)。
在其他实施方式中，在更受控的条件下实现孔72的连接以形成多肽通道76，其中更精确地控制多孔基质30包括多肽通道76的程度，以及可能甚至其位置或相对位置。在一个实施方式中，多孔基质30可以通过在致孔剂溶剂(诸如，但不限于，甲醇和己烷)存在的情况下通过单体(诸如，但不限于，甲基丙烯酸酯和二甲基丙烯酸乙酯)的自由基聚合来形成。在其他实施方式中，可以利用其他方法来形成多孔基质30。
尽管图2说明孔70和孔72以及实例多肽通道76的实例布置，但在其他实施方式中，孔70和72的确切布置可以以多种方式变化。多肽通道76可以比图示的更长，更短，更直或更弯曲。多肽通道可以在沿其长度的某些位置具有一定宽度的多个互相连接的孔72。多孔基质30的体积内的多肽通道72的数量或密度可以大于所示的数量或密度。单独的孔70和72可能不具有均匀的形状和/或尺寸。并非所有较大的孔72都可以连接至其他相邻的孔72。例如，单个较大的孔72或多个孔72的小簇可以在反应室24内与其他较大的孔72分离，以便不形成与废物室26连接的多肽通道的部分。
图2是实例酶促样品纯化方法100的流程图。图3是示意性说明在不同时间点的方法100的图。为了说明的目的，图3中示意性简化了多孔基质30、酶60以及样品50的分析物52和PDP 54。尽管方法100被描述为由系统20实施，但方法100可以可替代地由下文描述的任何其他酶促样品纯化系统或其他适当的酶促样品纯化系统实施。如方框102所示且在图3中的时间t0处所示，样品50通过端口34引入至反应室24中。样品50包含靶分析物52(用星号示意性示出)和PDP54(用实心圆形示意性示出为氨基酸)。样品50的实例包括，但不限于血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和/或其他生物流体。靶分析物52可以包含不能形成肽键(酰胺键)的小分子。此类靶标(markets)没有伯胺基团(primary and mine groups)或羧酸基团，且因此不能形成酰胺键。
分析物52可以额外或可替代地包含能够形成肽键、但在由于选择的特定酶60而在反应室24中存在的酶促条件或反应室24的其他条件下不能形成肽键的分子。此类分子可以具有伯胺基团或羧酸基团，但由于反应室24内的特定酶60而不能进行肽键形成。这种分析物可以包括从肽形成酶的活性位点空间排除的氨基酸或寡肽。此类分析物的实例包括，但不限于，生物标志物，诸如促甲状腺激素释放激素(三肽)、Leu-脑啡肽、Met-脑啡肽(五肽)等。在一种方法中，样品50的分析物52和PDP 54在纯化前具有重叠或类似的分子量和回转半径，以使得难以仅通过尺寸进行分离。此外，在一些实施方式中，分析物52的分子和PDP54的分子也可以具有类似的电荷、电泳迁移率、分配系数(与疏水性有关)、蛋白激酶A(pKa)特性，使得离子选择性的、电泳的和/或基于液体和固体的分离变得困难。
如方框102进一步指示，样本50沉积于其中的反应室24含有酶(E)60、酶辅因子和助溶剂。在一个实施方式中，反应室24另外包含缓冲液。上文各自描述了酶60、酶辅因子、助溶剂和缓冲液。
如方框106所示和在图3中的时间t1处所示，允许酶60和PDP 54彼此反应以形成多肽80(用空心圆形示意性示出)。在此类反应期间，样品50的PDP 54接近孔70内的酶60。这导致多肽80的形成。如图1中示意性说明，多肽80具有这样的分子尺寸以适合在孔72内并且以便可通过并穿过孔72移动，从一个孔72移动至其相邻的孔72中。
如方框110所示，并且在图3中的时间t1处进一步所示，形成的多肽80通过多肽通道76(在1中示出)迁移或行进至废物室26中。由于靶分析物52和形成的多肽80之间的分子尺寸差异，多肽80不能接近较小的孔70并且被包含在多肽通道76内，限制了多肽80沿着更线性或直接的路径朝向废物室26的移动。相反，靶分析物52可以在各个和每个孔70之间和其中行进，可能在基质30内和整个基质30中采用长得多和弯曲的路径。作为结果，靶分析物52被熵驱动地诱捕在基质30和反应室24内，与形成的多肽80相比，以慢得多得多的速率行进至废物室26(如果有的话)。相对于多肽80，靶分析物52由于其是尺寸较小的分子而被熵驱动地诱捕在基质30内。
在一个实施方式中，多肽80比靶分析物52大至少100％。在一个实施方式中，多肽80具有至少1000Da的尺寸且靶分析物具有不大于200Da的尺寸。
从反应室24除去产生的多肽80抑制了在反应室24内达到多肽80和酶60之间的平衡状态。作为结果，在反应室24内持续非平衡状态，以增强酶60与PDP 54的进一步反应以产生又更多的多肽70，其也被运输或也迁移至废物室26。
如方框114所示且在图3中的时间t2处所示，继续或重复进行PDP54酶60反应以形成多肽并连续或同时将形成的多肽80通过通道76迁移至室26的过程或循环，直到反应室24内的剩余样品50已达到预定的纯度水平，直到反应室24中的剩余的PDP 54已降至可接受的水平或量。在一个实施方式中，基本上所有的PDP 54已经由于与酶60的反应而被消耗，并且随后以被输送至废物室26的多肽80的形式被除去。在该过程完成时，从反应室24提取靶分析物52用于进一步分析。
图4示意性说明酶促样品纯化系统220，系统20的一个实例实施方式。系统220与系统20类似，除了系统220额外包括分隔件(partition)284和缓冲液286。将对应于系统20的系统220的那些剩余组件或元件类似地编号。
分隔件284包括夹在含有多孔基质30的反应室24和废物室(W)26之间的过滤器或膜。分隔件284将多肽80传输至废物室26，同时阻断或抑制样品50的靶分析物52流至废物室26。如图4所示，在一个实施方式中，分隔件284可以具有与多孔基质30的构造类似的构造，因为分隔件284包括多个不同尺寸的孔。在一个这种实施方式中，分隔件284包括较大的孔72和较小的孔270。较大的孔72与基质30的孔72类似，因为较大的孔72尺寸被设定为接收由反应室24中的PDP 54和酶60的反应产生的形成的多肽80并允许其通过。在一个实施方式中，较小的孔270尺寸被设定为小于孔70的尺寸，以便不仅阻断多肽80的传输，而且阻断靶分析物52的传输，使得靶分析物52没有被捕获或容纳在分隔件284内。在一些实施方式中，可以省略孔280，其被替换为实心或其他无孔层或结构。在还有其他实施方式中，孔270可以尺寸被设定为与孔70类似，其中允许靶分析物52进入此类孔270，但在到达废物室26之前被熵驱动地诱捕在分隔件284内。在还有其他实施方式中，分隔件24可以具有其他形式，其允许多肽80的传输，但与多肽80通过孔72的流动相比，更大地抑制或限制靶分析物52的流动。
缓冲液286包含作为废物室26中的溶液的一部分抑制废物室26中的溶液的pH变化的分子。根据化学特性选择缓冲液286，以便抑制或防止废物室26内形成的多肽80的分解，以便抑制PDP54返回下层回流(return floor back flow)至反应室24中。缓冲液的实例包括，但不限于，磷酸盐缓冲液。在一些实施方式中，可以省略缓冲液286。
图5示意性说明酶促纯化系统320，系统20的另一种实例实施方式。系统320类似于上述系统220，除了系统320额外包括场发生系统390。将对应于系统20和220的组件或元件的系统320的那些剩余组件或元件类似地编号。
场发生系统390穿过多孔基质30施加场，以便加速多肽80从反应室24通过多肽通道76运输、移动或迁移至废物室26。通过加速多肽80移动出反应室24，可以实现反应室24内的在多肽80和酶60的存在之间的更高非平衡状态以增强PDP 54与酶60的反应速率。场发生系统390包括场发生器391、392、传感器394和控制器396。场发生器391、392包括终端，在所述终端之间产生加速多肽80的运输移动的场。场发生器391确定场的路径和方向以及多肽80的加速移动的路径和方向。
在一个实施方式中，场发生器391、392包括电势梯度场发生器的节点，其中场发生器391、392处于两种不同的电势，产生通过并穿过基质30的电场以加偏压(bias)或加速多肽80从反应室24移动至废物室26。在一个这种实施方式中，电场通过电泳移动多肽80。在另一个这种实施方式中，电场通过电渗移动多肽80。在一个实施方式中，场发生器391、392包括热梯度场发生器的节点，其中场发生器391、392处于不同的温度，产生通过并穿过基质30的热梯度以加偏压或加速多肽80从反应室24移动至废物室26。在又另一个实施方式中，场发生器391和392包括压力梯度场发生器的节点，其中场发生器391、392是不同的流体压力水平以产生穿过和通过基质30的流体压力差以移动多肽80朝向并进入废物室26。在还有其他实施方式中，可以采用其他场发生器来加偏压或加速多肽80朝向废物室26的移动或迁移。
在采用场发生系统390的那些实施方式中，选择由场发生器391、392提供的偏压的强度或量以便足够强以加速多肽80通过多肽通道76移出反应室24并进入废物室26，同时不会太强以致也以这样的速率驱动靶分析物52，使得靶分析物52的移动克服了更多众多较小孔70对分析物52的熵驱动诱捕或保留，并且也被排出至废物室26。由场发生系统390提供的场的确切强度可以变化，并且可以经验地确定，这取决于靶分析物52可以移动通过多孔基质30的容易程度，其可以取决于孔70、72的相对尺寸，孔70的数量和尺寸，孔70的密度，孔72的密度，多肽通道76的密度以及靶分析物52的尺寸或靶分析物52与材料基质30的亲和力。
在所示的实例中，系统390的传感器394和控制器396提供由场发生器391、392提供的场的闭环反馈控制。传感器394包括感测或检测废物室26内的溶液的特性的装置。
控制器396包括处理单元，所述处理单元遵循非临时性计算机可读介质397中含有的指令，基于从传感器394接收的信号或感测值来调整由场发生器391、392穿过基质30施加的场。为了本申请的目的，术语“处理单元”应意指执行在非临时性存储器中含有的指令序列的电子器件或硬件。指令序列的执行引起处理单元执行步骤，诸如生成控制信号。可以将指令加载于随机存取存储器(RAM)中用于处理单元从只读存储器(ROM)、大容量存储装置或一些其他永久性存储器执行。在其他实施方案中，硬接线电路可以替代软件指令使用或与软件指令结合使用来实现所述的功能。例如，控制器396可以体现为一个或多个应用专用的集成电路(ASIC)的一部分。除非另外具体指出，否则控制器不限于硬件电路和软件的任何特定组合，也不限于由处理单元执行的指令的任何特定来源。
在一个实施方式中，传感器394感测多肽80的存在，其中多肽80的数量、量或其他感测值被传送至控制器396，其中控制器396使用多肽80的感测值来调整对多肽80的移动加偏压的场。例如，如果来自传感器394的信号指示废物室286内的多肽80的缓慢增加速率，则控制器396可以输出加强由场发生器391、392提供的场的信号。相反，如果来自传感器394的信号在使得靶分析物52也被运输至废物室26的可能性可能会高的程度上指示废物室286内的多肽80的数量、量或百分比的高增加速率，则控制器396可以输出控制信号，降低由场发生器391、392提供的场。
在另一个实施方式中，传感器394可以感测除了多肽80之外的分子的存在，生物标志物的存在和/或废物室26内的靶分析物52的存在，其中控制器396使用感测值来调整对多肽80的移动加偏压的场。例如，如果来自传感器394的信号指示废物室26中的非多肽分子、生物标志物和/或靶分析物52的量、百分比、体积或其他值且其中所述值超过预定阈值，则控制器396可以自动地减少或降低由发生器391、392提供的场，以便降低靶分析物52也被运输或加偏压至废物室26中的可能性。相反，如果来自传感器394的信号指示废物室26中的非多肽分子、生物标志物和/或靶分析物52的量、百分比、体积或其他值且其中所述值低于预定阈值，则控制器396可以自动地增加由发生器391、392提供的场，以便增加多肽80迁移至废物室26的速率，由此增加样品50被纯化的速率。此类预定阈值可以经验地确定，并且可以变化，这取决于靶分析物52可以移动通过多孔基质30的容易程度，其可以取决于孔70、72的相对尺寸，孔70的数量和尺寸，孔70的密度，孔72的密度，多肽通道76的密度以及靶分析物52的尺寸或靶分析物52与材料基质30的亲和力。
尽管已经参考实例实施方式描述了本公开，但本领域技术人员将认识到，可以在形式和细节上进行改变，而不脱离所请求保护的主题的精神和范围。例如，尽管不同的实例实施方式已经被描述为包括提供一种或多种益处的一个或多个特征，但考虑所述的特征可以彼此互换或者可替代地在所述的实例实施方式或在其他替代实施方式中与彼此组合。因为本公开的技术相对复杂，所以并非技术上的所有变化都是可预见的。参考实例实施方式描述并在以下权利要求中阐述的本公开显然旨在尽可能宽泛。例如，除非特别指出，否则记载单个特定要素的权利要求还涵盖多个此类特定要素。权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅区分不同的要素，并且除非另有说明，否则不与本公开中要素的特定顺序或特定编号具体相关。