本申请要求于2015年11月11日提交的序列号62/266189的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
联邦资金声明：
本发明是在国家卫生研究院授予的拨款号p20gm103548的政府资助下进行的。政府在这项发明中具有一定的权利。
背景技术：
诊断有局部乳腺癌(bca)的女性的5年生存率为98.6％。区间阶段的生存率下降到83.8％，而远期阶段的生存率骤降至23.3％[3]。在首次诊断时仅5％的美国女性患有转移性bca[4]；然而，大多数与bca相关的死亡是由于不可治愈的转移性疾病[5]，而不是初步诊断。不幸的是，当患者出现症状例如呼吸短促、慢性咳嗽、体重减轻或骨骼疼痛时，最常发现bca复发。
技术实现要素：
在一个方面，本发明提供了一种包含至少2种抗体检测标志物的组合物，其中所述抗体检测标志物包含用于检测针对选自由以下组成的组中的至少两种蛋白的人类自身抗体的试剂：a1at(α-1抗胰蛋白酶)(序列号：7)、angptl4(血管生成素样4)(序列号：1)、lrp10(ldl受体相关蛋白10)(序列号：5)、gfra1(gdnf家族受体α1)(序列号：3)、lgals3(半乳凝素3)(序列号：8)、cst2(胱抑素sa)(序列号：6)、dkk1(dickkopfwnt信号传导途径抑制剂1)(序列号：2)、capc(癌症中的细胞角蛋白相关蛋白)(序列号：9)、grp78(78kda葡萄糖调节蛋白)(序列号：12)和grn(颗粒蛋白)(序列号：4)，其中所述蛋白中的至少一种选自由a1at、lgals3和capc组成的组。在一个实施方式中，组合物包含用于检测针对选自由a1at、angptl4、lrp10、gfra1、lgals3、cst2、dkk1、capc、grp78和grn组成的组中的至少3种蛋白的人类自身抗体的试剂。在另一个实施方式中，组合物包含用于检测针对所述组中的至少5、6、7、8或全部9种蛋白的人类自身抗体的试剂。在另外的实施方式中，组合物由2-1000种抗体检测标志物或4-500种抗体检测标志物组成。在另一个实施方式中，组合物包括用于检测针对angptl4、gfra1、lgals3、dkk1和grn中的至少2、3、4或全部5种的人类自身抗体的试剂。在另外的实施方式中，组合物还包含用于检测针对gal1和muc1中的一种或两种的人类自身抗体的试剂。在一个实施方式中，用于检测人类自身抗体的试剂包含至少两种蛋白或其抗原片段。在另一个实施方式中，所述至少两种蛋白或其抗原片段包含原生胞外结构域和/或原生分泌蛋白或其抗原片段。在另外的实施方式中，试剂被可检测地标记。在又另外的实施方式中，所述至少两种蛋白或其抗原片段表达为与可检测结构域融合，包括但不限于fc结构域。在另一个实施方式中，试剂被固定在固体支撑物的表面上。
另一方面，本发明提供了用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：
(a)将来自正在进行或已经进行过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对选自由a1at、angptl4、lrp10、gfra1、lgals3、cst2、dkk1、capc、grp78和grn组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定所述体液样品中针对所述一种或多种蛋白的自身抗体的量；
其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的减少表明了对受试者的乳腺癌治疗的疗效。
另一方面，本发明提供了用于预诊断乳腺癌复发的方法，其包括：
(a)将来自已经接受过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对选自由a1at、angptl4、lrp10、gfra1、lgals3、cst2、dkk1、capc、grp78和grn组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定所述体液样品中针对所述一种或多种蛋白的自身抗体的量；
其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的增加表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。
在多个实施方式中，所述试剂包括用于检测针对所述蛋白中的3、4、5、6、7、8或全部9种的自身抗体的试剂。在另一个实施方式中，试剂包含本发明任何实施方式或实施方式组合的组合物。
在一个实施方式中，所述一种或多种试剂包含选自由angptl4、gfra1、lgals3、dkk1和grn组成的组中的2、3、4或全部5种蛋白或其抗原片段。
另一方面，本发明提供了用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：
(a)将来自正在进行或已经进行过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对grp78的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定所述体液样品中针对grp78的自身抗体的量；
其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对grp78的自身抗体的基线水平的增加表明了对受试者的乳腺癌治疗的疗效。
另一方面，本发明提供了用于预诊断乳腺癌复发的方法，其包括：
(a)将来自已经接受过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对grp78的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定所述体液样品中针对grp78的自身抗体的量；
其中所述自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对grp78的自身抗体的基线水平的减少表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。在另一个实施方式中，所述接触包括使用elisa。在另外的实施方式中，体液样品包含来自受试者的血清样品。在一个实施方式中，在实施本发明的方法之前，受试者已经进行过移除原发性肿瘤的手术。在另一个实施方式中，受试者正在接受或已经接受过放射治疗和化疗，或激素治疗和化疗。在另一个实施方式中，所述接触包括使用纵向试验筛选，其中可以在单个测试和稀释中对所有靶向生物标志物进行检测和定量。在又另外的实施方式中，体液样品包含来自受试者的血液样品。在一个实施方式中，如果确定了所述自身抗体的量相对于来自所述受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平没有降低，则所述方法还包括改变施用于受试者的乳腺癌治疗。在另一个实施方式中，该方法用于检测乳腺癌复发。
附图说明
图1.随访12个月后，根据治疗方案针对11种肿瘤相关抗原的自身抗体水平相对于基线所观察到的几何平均变化(95％置信区间)。*表示p值<0.05。对于仅手术或单独治疗(即激素治疗、放射治疗或化疗)没有观察到显著变化。
图2.在诊断有用
图3.随访6个月后，根据治疗方案针对11种肿瘤相关抗原的自身抗体水平相对于基线所观察到的几何平均变化(95％可信区间)。*表示p值<0.05。对于仅手术或单独治疗(即激素治疗、放射治疗或化疗)没有观察到显著变化。
具体实施方式
所有引用的参考文献通过引用以其全部内容并入本文。
在本申请中，除非另有说明，否则所使用的技术可以在多个公知的参考文献中的任一个中找到，例如molecularcloning:alaboratorymanual(sambrook,等人,1989,coldspringharborlaboratorypress),geneexpressiontechnology(methodsinenzymology,vol.185,由d.goeddel编辑,1991.academicpress,sandiego,ca),“guidetoproteinpurification”inmethodsinenzymology(m.p.deutshcer,ed.,(1990)academicpress,inc.)；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis,等人1990.academicpress,sandiego,ca),cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,2nded.(r.i.freshney.1987.liss,inc.newyork,ny),genetransferandexpressionprotocols,pp.109-128,ed.e.j.murray,thehumanapressinc.,clifton,n.j.),和theambion1998catalog(ambion,austin,tx)。
在第一方面，本发明提供了包含至少2种抗体检测标志物的组合物，其中所述抗体检测标志物包含用于检测针对选自由以下组成的组中的至少两种的人类自身抗体的试剂：a1at(α-1抗胰蛋白酶)(序列号：7)、angptl4(血管生成素样4)(序列号：1)、lrp10(ldl受体相关蛋白10)(序列号：5)、gfra1(gdnf家族受体α1)(序列号：3)、lgals3(半乳凝素-3)(序列号：8)、cst2(胱抑素sa)(序列号：6)、dkk1(dickkopfwnt信号传导途径抑制剂1)(序列号：2)、capc(癌症中的细胞角蛋白相关蛋白)(序列号：9)、grp78(78kda葡萄糖调节蛋白)(序列号：12)和grn(颗粒蛋白)(序列号：4)，其中所述蛋白中的至少一种选自由a1at、lgals3和capc组成的组。
本发明已经人出乎意料地发现针对所述蛋白的自身抗体为正在接受bca和/或bca复发治疗的受试者提供治疗疗效的指征。因此，本发明的组合物可以用于例如诊断试验中以监测乳腺癌治疗的效力，和/或复发。在一个实施方式中，组合物包含用于检测针对选自由a1at、angptl4、lrp10、gfra1、lgals3、cst2、dkk1、capc、grp78和grn组成的组中的至少两种蛋白的人类自身抗体的试剂。
在多个实施方式中，组合物包含用于检测针对所述组中的至少3、4、5、6、7、8或全部9种蛋白的人类自身抗体的试剂或由其组成。在多个另外的实施方式中，组合物包含用于检测针对angptl4、gfra1、lgals3、dkk1和grn中的2、3、4或全部5种的人类自身抗体的试剂或由其组成。
在另外的实施方式中，组合物还包括用于检测针对gal1和muc1中的一种或两种的人类自身抗体的试剂。
在多个另外的实施方式中，组合物包含2-1000、3-1000、4-1000、5-1000、6-1000、7-1000、8-1000、9-1000、2-500、3-500、4-500、5-500、6-500、7-500、8-500、9-500、2-100、3-100、4-100、5-100、6-100、7-100、8-100、9-100、2-50、3-50、4-50、5-50、6-50、7-50、8-50、9-50、2-25、3-25、4-25、5-25、6-25、7-25、8-25或9-25种抗体检测试剂或由其组成。
如本领域技术人员将理解的，所述组合物可以包括另外的抗体检测标志物和对照物，只要其适用于组合物的预期用途。
抗体检测标志物可以是可用于检测针对所述蛋白的抗体的任何合适的试剂，包括但不限于所述蛋白、蛋白的分泌形式(例如蛋白的原生分泌形式)或蛋白的胞外结构域。分泌蛋白更容易从肿瘤细胞递送到淋巴结，其中发生免疫细胞的相互作用以产生大量的高亲和性抗体。膜表面蛋白通常通过金属蛋白酶依赖性切割以可溶形式从肿瘤细胞释放。脱落蛋白比胞内蛋白更容易转移到淋巴结。因此，在一个实施方式中，抗体检测标志物可以是所述蛋白的分泌部分或膜部分。如所指出，所述人类蛋白的示例性氨基酸序列如下所示：
没有信号序列的全长蛋白：angptl4、a1at、cst2、dkk1、gfra1、grn、grp78、gal1、muc1。
没有信号序列的胞外结构域：capc、lrp10。
全长(蛋白中未预测到信号序列)：lgals3
angtpl4(序列号：1)
ksprfaswdemnvlahgllqlgqglrehaertrsqlsalerrlsacgsacqgtegstdlplapesrvdpevlhslqtqlkaqnsriqqlfhkvaqqqrhlekqhlriqhlqsqfglldhkhldhevakparrkrlpemaqpvdpahnvsrlhrlprdcqelfqvgerqsglfeiqpqgsppflvnckmtsdggwtviqrrhdgsvdfnrpweaykagfgdphgefwlglekvhsitgdrnsrlavqlrdwdgnaellqfsvhlggedtayslqltapvagqlgattvppsglsvpfstwdqdhdlrrdkncakslsggwwfgtcshsnlngqyfrsipqqrqklkkgifwktwrgryyplqattmliqpmaaeaas
dkk1(序列号：2)
vsatlnsvlnsnaiknlppplggaaghpgsavsaapgilypggnkyqtidnyqpypcaedeecgtdeycasptrggdagvqiclacrkrrkrcmrhamccpgnyckngicvssdqnhfrgeieetitesfgndhstldgysrrttlsskmyhtkgqegsvclrssdcasglccarhfwskickpvlkegqvctkhrrkgshgleifqrcycgeglscriqkdhhqasnssrlhtcqrh
gfra1(序列号：3)
drldcvkasdqclkeqscstkyrtlrqcvagketnfslasgleakdecrsamealkqkslyncrckrgmkkeknclriywsmyqslqgndlledspyepvnsrlsdifrvvpfisdvfqqvehipkgnncldaakacnlddickkyrsayitpcttsvsndvcnrrkchkalrqffdkvpakhsygmlfcscrdiacterrrqtivpvcsyeerekpnclnlqdscktnyicrsrladfftncqpesrsvssclkenyadcllaysgligtvmtpnyidssslsvapwcdcsnsgndleeclkflnffkdntclknaiqafgngsdvtvwqpafpvqtttattttalrvknkplgpagseneipthvlppcanlqaqklksnvsgnthlcisngnyekeglgasshittksmaappscglspllvlvvtalstllsltets
grn(序列号：4)
trcpdgqfcpvaccldpggasysccrplldkwpttlsrhlggpcqvdahcsaghsciftvsgtssccpfpeavacgdghhccprgfhcsadgrscfqrsgnnsvgaiqcpdsqfecpdfstccvmvdgswgccpmpqasccedrvhccphgafcdlvhtrcitptgthplakklpaqrtnravalsssvmcpdarsrcpdgstccelpsgkygccpmpnatccsdhlhccpqdtvcdliqskclskenattdlltklpahtvgdvkcdmevscpdgytccrlqsgawgccpftqavccedhihccpagftcdtqkgtceqgphqvpwmekapahlslpdpqalkrdvpcdnvsscpssdtccqltsgewgccpipeavccsdhqhccpqgytcvaegqcqrgseivaglekmparraslshprdigcdqhtscpvgqtccpslggswaccqlphavccedrqhccpagytcnvkarscekevvsaqpatflarsphvgvkdvecgeghfchdnqtccrdnrqgwaccpyrqgvccadrrhccpagfrcaargtkclrreaprwdaplrdpalrqll
lrp10(序列号：5)
hpdriifpnhacedppavllevqgtlqrplvrdsrtspanctwlilgskeqtvtirfqklhlacgserltlrsplqplislceappsplqlpggnvtitysyagarapmgqgfllsysqdwlmclqeefqclnhrcvsavqrcdgvdacgdgsdeagcssdpfpgltprpvpslpcnvtledfygvfsspgythlasvshpqschwlldphdgrrlavrftaldlgfgdavhvydgpgppessrllrslthfsngkavtvetlsgqavvsyhtvawsngrgfnatyhvrgyclpwdrpcglgsglgageglgercyseaqrcdgswdcadgtdeedcpgcppghfpcgaagtsgatacylpadrcnyqtfcadgaderrcrhcqpgnfrcrdekcvyetwvcdgqpdcadgsdewdcsyvlprk
cst2(序列号：6)
wspqeedriieggiydadlndervqralhfviseynkatedeyyrrllrvlrareqivggvnyffdievgrtictksqpnldtcafheqpelqkkqlcsfqiyevpwedrmslvnsrcqea
a1at(序列号：7)
edpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk
lgals3(序列号：8)
madnfslhdalsgsgnpnpqgwpgawgnqpagaggypgasypgaypgqappgaypgqappgaypgapgaypgapapgvypgppsgpgaypssgqpsatgaypatgpygapagplivpynlplpggvvprmlitilgtvkpnanrialdfqrgndvafhfnprfnennrrvivcntkldnnwgreerqsvfpfesgkpfkiqvlvepdhfkvavndahllqynhrvkklneisklgisgdidltsasytmi
capc(序列号：9)
qvsataspsgslgapdcpevctcvpgglascsalslpavppglslrlrallldhnrvralppgafagagalqrldlrenglhsvhvrafwglgalqlldlsanqlealapgtfaplralrnlslagnrlarlepaalgalpllrslslqdnelaalapgllgrlpaldalhlrgnpwgcgcalrplcawlrrhplpaseaetvlcvwpgrltlspltafsdaafshcaqplalrdlav
gal1(序列号：10)
lrvrgevapdaksfvlnlgkdsnnlclhfnprfnahgdantivcnskdggawgteqreavfpfqpgsvaevcitfdqanltvklpdgyefkfpnrlnleainymaadgdfkikcvafd
muc1(序列号：11)
apkpatvvtgsghasstpggeketsatqrssvpssteknafnssledpstdyyqelqrdisemflqiykqggflglsnikfrpgsvvvqltlafregtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsgagvpg
grp78(序列号：12)
eeedkkedvgtvvgidlgttyscvgvfkngrveiiandqgnritpsyvaftpegerligdaaknqltsnpentvfdakrligrtwndpsvqqdikflpfkvvekktkpyiqvdigggqtktfapeeisamvltkmketaeaylgkkvthavvtvpayfndaqrqatkdagtiaglnvmriineptaaaiaygldkregeknilvfdlgggtfdvslltidngvfevvatngdthlggedfdqrvmehfiklykkktgkdvrkdnravqklrrevekakralssqhqarieiesfyegedfsetltrakfeelnmdlfrstmkpvqkvledsdlkksdideivlvggstripkiqqlvkeffngkepsrginpdeavaygaavqagvlsgdqdtgdlvlldvcpltlgietvggvmtkliprntvvptkksqifstasdnqptvtikvyegerpltkdnhllgtfdltgippaprgvpqievtfeidvngilrvtaedkgtgnknkititndqnrltpeeiermvndaekfaeedkklkeridtrnelesyayslknqigdkeklggklssedketmekaveekiewleshqdadiedfkakkkeleeivqpiisklygsagppptgeedtaekdel。
在另外的实施方式中，抗体检测标志物是蛋白，例如以上公开的那些蛋白，其处于其原生形式。如所附实施例所公开的，本发明人利用真核表达系统来产生适当折叠并含有非连续表位的携带构象的肿瘤抗原，用于自身抗体的检测。在另一个实施方式中，所述试剂包含至少两种蛋白或其抗原片段，并且其中所述至少两种蛋白或其抗原片段表达为与可检测结构域融合。蛋白可以以任何合适的形式使用；在一个非限制性实施方式中，蛋白可以是表面结合型fc融合蛋白或分泌的fc融合蛋白。
在所有上述实施方式中，抗体检测试剂可以用可检测标记物进行标记。在一个实施方式中，用于检测针对一种蛋白的自身抗体的试剂的可检测标记物与用于检测针对另一种蛋白的自身抗体的可检测标记物是可区分的。用于检测标记物的方法包括但不限于光谱学技术、光化学技术、生物化学技术、免疫化学技术、物理技术或化学技术。可以使用任何合适的可检测标记。
组合物可以冷冻储存、以冻干形式储存或储存为溶液形式。在一个实施方式中，可以将组合物放置在固体支撑物的表面上。可以使用任何合适的固体支撑物。这种支撑物的实例包括但不限于微阵列、珠状物、柱状物、光纤维、擦拭物、硝化纤维素、尼龙、玻璃、石英、重氮化膜(纸或尼龙)、有机硅、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、陶瓷、金属、准金属、半导体材料、经涂覆的珠状物、磁性颗粒；塑料例如聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯；和凝胶形成材料、例如蛋白(例如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯聚合物；溶胶凝胶；多孔聚合物水凝胶；纳米结构表面；纳米管(例如碳纳米管)和纳米颗粒(例如金纳米颗粒或量子点)。该实施方式有利于在多种检测试验中使用组合物。例如，可以使用抗igg预涂覆微孔板的孔，并且可以将抗体检测试剂(例如本文讨论的蛋白)添加到预涂覆的孔中。
第二方面，本发明提供了用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：
(a)将来自正在进行或已经进行过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对选自由a1at、angptl4、lrp10、gfra1、lgals3、cst2、dkk1、capc、grp78和grn组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定体液样品中针对一种或多种蛋白的自身抗体的量；
其中自身抗体的量相对于对照、例如来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的减少表明了受试者的乳腺癌治疗的疗效。
另一方面，本发明提供了用于预诊断乳腺癌复发的方法，其包括：
(a)将来自已经接受过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对选自由a1at、angptl4、lrp10、gfra1、lgals3、cst2、dkk1、capc、grp78和grn组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定体液样品中针对一种或多种蛋白的自身抗体的量；
其中自身抗体的量相对于对照、例如来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平的增加表明了受试者的乳腺癌复发的可能性。
如以下实施例中所公开的，与基线水平相比(即：乳腺癌治疗开始之前)，一种或多种所述标志物的自身抗体的量随时间降低表明了有利的治疗应答，而自身抗体水平没有降低或增加表明了不利的治疗应答。鉴于所有因素，主治医疗人员确定乳腺癌治疗开始后，方法可以在任何合适的时间进行。在多个非限制性实施方式中，在治疗开始后，所述方法可以进行至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月等。如本领域技术人员将理解的那样，可以通过主治医疗人员认为适当的方式对指定的受试者进行该方法任何次数。因此，可以对指定的受试者进行该方法1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次，以监测治疗过程。在一个非限制性实施方式中，在乳腺癌治疗开始后6个月和/或12个月进行该方法。如本领域技术人员将理解的，该方法可以在治疗期间进行，也可以在完成治疗后进行，以监测可能的乳腺癌复发。
受试者可以是接受乳癌治疗的任何合适的受试者，包括但不限于人类受试者。如本文所用，“乳腺癌治疗”包括移除原发性乳腺肿瘤的手术放射治疗、化疗、
在一个实施方式中，所述一种或多种试剂包含选自由angptl4、gfra1、lgals3、dkk1和grn组成的组中的2、3、4或全部5种蛋白或其抗原片段。
抗体检测标志物可以是可用于检测针对所述蛋白的抗体的任何合适的试剂，包括但不限于所述蛋白、蛋白的分泌形式(例如蛋白的原生分泌形式)或蛋白的胞外结构域。分泌蛋白更容易从肿瘤细胞递送到淋巴结，其中发生免疫细胞的相互作用以产生大量的高亲和性抗体。膜表面蛋白通常通过金属蛋白酶依赖性切割以可溶形式从肿瘤细胞释放。脱落蛋白比胞内蛋白更容易转移到淋巴结。因此，在一个实施方式中，抗体检测标志物可以是所述蛋白的分泌部分或膜部分。所述蛋白的分泌部分或膜部分的示例性氨基酸序列如本文所公开。因此，使用的试剂可以是用于检测针对选自由a1at、angptl4、lrp10、gfra1、lgals3、cst2、dkk1、capc、grp78和grn、其分泌部分或其膜部分组成的组中的一种或多种蛋白的自身抗体的任何合适的一种或多种试剂，包括但不限于本发明组合物的任何实施方式的试剂或其组合。在多个非限制性实施方式中，所述试剂包括用于检测针对所述组中的至少3、4、5、6、7、8或全部9种蛋白的人类自身抗体的试剂。在另一个非限制性实施方式中，试剂包括所述的蛋白或其抗原片段。这些蛋白可以是原生形式。在另一个实施方式中，所述试剂包含至少两种蛋白或其抗原片段，并且其中所述至少两种蛋白或其抗原片段表达为与可检测结构域融合。蛋白可以以任何合适的形式使用；在一个非限制性实施方式中，蛋白可以是表面结合型fc融合蛋白或分泌的fc融合蛋白。在另一个实施方式中，可以将试剂可检测地标记。在另一个实施方式中，可以将试剂结合到固体支撑物的表面。
在多个实施方式中，抗体检测标志物中的至少1、2、3、4或5种选自由a1at、gfra1、lgals3、capc和cst2组成的组。在多个另外的实施方式中，抗体检测标志物中的至少1、2、3、4或5种选自由angptl4、gfra1、lgals3、dkk1和grn组成的组。
如下面的实施例所示，grp78是仅有的在激素治疗+化疗组中出现自身抗体应答显著增加的taa。因此，另一方面，本发明提供了用于监测乳腺癌治疗的方法，其包括：
(a)将来自正在进行或已经进行过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对grp78的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定体液样品中针对grp78的自身抗体的量；
其中自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对grp78的自身抗体的基线水平的增加表明了受试者中乳腺癌治疗的疗效。
另一方面，本发明提供用于预诊断乳腺癌复发的方法，包括：
(a)将来自已经接受过乳腺癌治疗的受试者的体液样品与用于检测针对grp78的自身抗体的一种或多种试剂接触；以及
(b)确定体液样品中针对grp78的自身抗体的量；
其中自身抗体的量相对于对照、例如来自所述受试者的类似体液样品中针对grp78的自身抗体的基线水平的减少表明了受试者中乳腺癌复发的可能性。
在每个这些方面的一个实施方式中，受试者正在接受或已经接受过激素治疗和化疗。
如本领域技术人员将理解的，所述方法可以包括使用另外的抗体检测标志物和对照，只要其适合组合物的预期用途。接触可以在用于促进体液样品中的自身抗体与试剂之间的结合以形成可检测的结合复合物的任何合适条件下进行。鉴于本文的教导，本领域技术人员基于预期试验可以确定适当的这种条件。类似地，可以在所述方法中使用任何合适的附加步骤，例如去除未结合的试剂的一个或多个洗涤步骤或其它步骤。
可以使用任何合适的检测技术，包括但不限于酶联免疫吸附试验(elisa)、基于珠状物的试验平台(例如
类似地，可以使用任何合适的体液，包括但不限于来自受试者的血清样品、血浆样品或血液样品。“血浆样品”是指血浆、血液的液体成分，例如通过将全血离心分离除去血细胞来制备。血清样品是去除了血液凝固因子的血浆样品。
在一个实施方式中，当自身抗体的量相对于来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平没有减少时，该方法还包括改变正在施用于受试者的乳腺癌治疗。由于自身抗体没有减少表明了对受试者不利的治疗结果，所以该实施方式允许根据主治医疗人员所认为的适当改变治疗(即：增加剂量，改变治疗等)以获得更有利的治疗结果。
在另一个实施方式中，任何实施方式或实施方式组合的方法用于检测乳腺癌复发。当确定自身抗体的量相对于来自受试者的类似体液样品中的自身抗体的基线水平没有减少(或增加)时，所述方法提供了乳腺癌复发的指征。在治疗过程中患者的自身抗体水平下降支持将对这些自身抗体水平的检测用作复发的预诊断指征的可能性。如果癌症复发，则自身抗体水平增加，并且该增加将通过试验检测。
实施例1：根据治疗方式，乳腺癌患者针对肿瘤相关性抗原的纵向自身抗体应答减少
早期诊断乳腺癌(bca)对于增加疾病存活率至关重要，不但是在最初得病时而且在复发时(1,2)。诊断有局部bca的女性的5年生存率为98.6％。区间阶段的生存率下降到83.8％，远期阶段的生存率骤降到23.3％(3)。首次诊断时只有5％的美国女性患有转移性bca(4)；然而，不可治愈的转移性疾病是造成大多数bca相关死亡的原因(5)。不幸的是，当患者出现症状如呼吸短促、慢性咳嗽、头痛、体重减轻或骨骼疼痛时，最常发现bca复发。一旦患者诊断有转移性bca，治疗目的不再是治愈性的；相反，目标是尽可能长时间地控制疾病(6,7)。目前，对于在身体检查时没有临床表现的无症状患者，不推荐替代筛查方法(8)。在通过身体症状确认为转移时，患者无病生存的机会大大减少。没有早期发现无症状患者的复发是无法治愈转移性bca的因素。
早期检测到原发性乳腺癌(bca)肿瘤使医生意图治愈地对患者进行治疗。然而，大多数与bca有关的死亡是由不可治愈的转移性疾病，而不是原发性肿瘤。目前还不清楚bca的初步诊断和治疗后患者自身抗体水平发生了什么变化。开发了
基于
在治疗前、手术后6个月和12个月，从200名bca患者收集三次连续抽血。测量这些样品针对32种taa的自身抗体应答，并将随访样品中存在的水平与手术时的自身抗体水平进行比较。根据治疗方案(包括手术、化疗、放射治疗、曲妥珠单抗和激素治疗)对患者进行分类。在用包括放射治疗+化疗、放射治疗+激素治疗或放射治疗+激素治疗+化疗的治疗方案手术后12个月，针对9种taa(a1at、angptl4、capc、cst2、dkk1、gfra1、grn、lgals3和lrp10)的自身抗体应答显著降低。与手术后6个月相比，在手术后12个月时的自身抗体水平通常更低，这与在治疗过程中患者的肿瘤负荷降低一致。因此，该数据表明自身抗体水平响应于转移而增加，并且检测到这种改变可以用作复发的早期指标。
材料和方法
质粒构建和蛋白产生
简而言之，将跨膜蛋白的胞外结构域或分泌蛋白和胞内蛋白的全长序列克隆到psectag2-兔fc或pfuse-rfc1中。这些质粒包括分泌信号以及c-末端兔fc(rfc)标签。用effectenetm(qiagen，valencia，ca)将taa-rfc质粒转染到293t细胞中，并将编码的蛋白分泌到细胞培养上清液中。转染后收集上清液，并用抗rfc夹心elisa测量taa-rfc含量。
偶联到磁珠的抗体
根据制造商的说明，利用
将肿瘤相关性抗原-兔fc融合蛋白加载到珠上
通过与含有分泌taa-rfc融合蛋白的细胞培养上清液一起温育，用每种taa-rfc融合蛋白包被与抗rfc抗体偶联的珠。将32种taa-rfc融合蛋白中的每一种都与一个
患者
病例的纳入标准是在sanfordhealth,siouxfalls,sd新诊断有bca(任何类型)的30岁以上的女性。在乳房切除术、乳房肿瘤切除术、放射治疗、化疗或其它治疗之前，患者提供一根10mledta管的血。如果潜在受试者以前有过任何类型的癌症病史，则将其排除在外。从09年10月8日至12年4月17日收集了来自200名bca患者的血样。手术后对参加研究的患者随访一年，手术后6个月和12个月在随访肿瘤访视时获取抽血。从10年4月15日至13年8月27日收集了后续抽血。所有患者都提供了书面知情同意书，并且sanfordhealthirb批准了研究方案。
血浆收集和储存
在抽血12小时内将10mledta管以2000×g离心10分钟。收集血浆作为上清液，等份放置并储存于-80℃直至试验自身抗体。
多重自身抗体珠试验
使用多重珠试验在单个孔中同时测量血浆样品中针对32种taa的自身抗体。将来自32个不同区域的各自包被有不同的taa-rfc融合蛋白的
统计方法
每个96孔板具有针对所有自身抗体的阴性对照背景和阳性对照标准。此外，每位患者具有其在相同的96孔板中分析的基线、6个月和12个月的样品。对于每种自身抗体，使患者的中位荧光强度(mfi)值减去其平板mfi背景水平，然后偏移最小常数以使所有值至少为1。然后通过标准mfi与所有8个平板上的平均标准mfi之比将该值标准化。最后，对数值进行对数转换以稳定方差并产生更对称的分布，即自身抗体应答＝ln[(自身抗体-背景+常数)*(标准-背景)/(标准-背景)平均值]。为了测量精确度，针对阳性对照和阴性对照在各平板上计算每种taa的批间cv。
在化合物对称性相关结构的情况下，作为探索性分析，使用重复测量anova(方差分析)来对随时间推移(即6个月和12个月)的每种自身抗体相对于基线的几何平均变化进行模型化。模型包括放射治疗、激素治疗和化疗随着时间的指标变量之间的所有相互作用。这种方法包括初步分析的200例bca患者中的183例；给予曲妥珠单抗
结果
从200名新诊断的bca患者收集系列血浆样品(13)。本研究纳入的200名bca患者的特征先前已由我们的实验室描述，包括人口统计学信息、肿瘤大小、肿瘤标志物状态、原位组分相对于侵袭性组分以及淋巴结涉入度(13)。在原发性肿瘤手术切除后6个月和12个月在治疗前获取抽血。为了确定患者在治疗过程中对癌症抗原的自身抗体应答，产生了由20种先前分析的taa(13)和12种新选择的癌症抗原(表1)组成的32种taa-rfc融合蛋白。先前开发的真核表达系统(13)用于产生用于多重免疫试验的所有携带taa-rfc构象的抗原。将包括独特的红色/红外发射光谱的32组
表1.用于产生rfc融合蛋白的附加候选物
表2.在珠平台上针对32种taa的阴性对照和阳性对照的批间变异系数
对各个受试者根据初步诊断后12个月期间接受的治疗进行分类。在研究中的所有入选的bca患者接受了用于切除原发性肿瘤手术，包括乳房肿瘤切除术或乳房切除术。除手术外，治疗还包括激素治疗、
表3.每种治疗方式和随访的患者抽血次数
*所有患者接受了切除原发性肿瘤的手术
主要探索性分析包括了200例患者中的183例，并包括了未接受
计算6个月和12个月时针对11种taa的相对于基线的实际几何平均变化(分别为图1和图3)。对于仅接受了手术或经手术和单一治疗(激素治疗、化疗或放射治疗)治疗的患者，未观察到针对11种抗原的自身抗体应答的显著变化。在12个月的时间点，grp78是仅有的在激素治疗+化疗组中出现44％的自身抗体应答显著增加的taa(图1)。尽管预测ny-eso-1在重复测量anova模型中具有显著的应答水平变化，但观察到的变化不显著(图1)。然而，在三个治疗组中观察到对11种taa中的9种(即a1at、angptl4、capc、cst2、dkk1、gfra1、grn、lgals3和lrp10)在基线与12个月时间点之间的应答水平显著降低。放射治疗+化疗、放射治疗+激素治疗和放射治疗+激素治疗+化疗针对9种显著taa的平均几何平均下降分别为-11％、-13％和-18％(图1)。与其它抗原和方案相比，在放射治疗+激素治疗+化疗组中，a1at和lrp10的自身抗体应答水平下降最大(分别为-26％和-28％)。放射治疗+激素治疗+化疗的三联治疗在减少针对taa的自身抗体应答中比任何其它治疗组合对更有效。此外，手术后6个月时的几何平均应答下降为-15％(图3)，相比之下，在12个月时间点下降更大，为-18％。显然，在治疗过程中自身抗体水平降低，并且随着患者进一步脱离初始诊断，其随着时间的推移而继续减少。
12个治疗组中的4组(共17例患者)经受
讨论
本研究提供了关于手术后bca患者发生的自身抗体应答的纵向变化的重要数据。我们能够用独特的多重珠试验法同时评价许多taa。此外，关于病理学和治疗信息的丰富数据使得本研究的结果与施用于每位患者的治疗方案相关联。我们的结果表明，所选择的9种抗原的组合显示出有希望开发针对早期检测转移性疾病的自身抗体试验。
本研究从纵向抽血分析中收集的数据表明，对原发性肿瘤进行手术切除并开始治疗后，对taa的自身抗体应答随时间而下降(图1)。大肿瘤的消失可能解释对taa自身抗体产生减少。随着大部分癌细胞被移除，免疫系统暴露于较少的癌抗原。在不继续暴露于癌症抗原的情况下，免疫系统降低自身抗体产生的水平。令人惊讶的是，我们还发现，移除原发性肿瘤后施用的治疗对这些患者的自身抗体分布具有很大的影响。在6个月的时间点可以检测到抗体应答的显著变化(表2)，手术后12个月可以检测到更大的减少(表3)。这些样品中所见的变化归因于对该患者施用的治疗，但是确认这些治疗是根据bca的每种亚型的特征。
为此，自身抗体应答水平下降最大的治疗方式组是放射治疗+激素治疗；放射治疗+化疗；和放射治疗+激素治疗+化疗(图1)。自身抗体应答水平发生显著变化的最受影响的三组共同点是放射治疗。然而，仅放射治疗不足以显著降低自身抗体的应答水平。经所有治疗(手术、激素治疗、化疗和放射治疗)联合治疗的患者，8种不同抗原的自身抗体应答水平显著降低(图1)。最后，激素治疗+化疗方案具有针对grp78抗原的自身抗体应答的显著变化。这组患者没有接受放射治疗，针对grp78的自身抗体应答是独特的，因为手术后12个月的应答显著增加而非下降(图1)。
数据初步分析显示，一组患者对erbb2抗原应答高(图2)。在进一步评价后，我们确定从这些患者中移除的肿瘤是her-2扩增的，并且这些患者是
在图2中记录的在治疗过程中自身抗体应答显著降低的9种抗原(a1at、angptl4、capc、cst2、dkk1、gfra1、grn、lgals3和lrp10)中，在之前发现在bca的存在下可预测的7种抗原的组中存在4种：angptl4、dkk1、gfra1和grn(13)。
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