本发明涉及一种检测特别是，但不仅仅是血液样品的生物样品中细菌的存在和活性的方法，，所述方法使用基于检测单元中气相色谱的技术。
本发明还涉及一种用于检测生物样品中细菌活性的检测单元。
根据本发明的方法可用于例如人体诊断、兽医领域、食品与其他任何领域，以检测所进行分析的各种生物样品中细菌的存在。
背景技术：
对生物样品中的细菌和其他微生物活性的快速且准确的检测是传染病诊断的基础，而因此也是制定正确的抗生素疗法的基础。
用于检测细菌活性的主要直接方法是将生物样品置于具有能够促进细菌发展的特定营养元素的培养基或培养液中。
使用培养基或培养液的技术的特征在于等待时间根据培养基或培养液的特征及促进细菌发展自身的条件而变化。
用于检测细菌存在的另一种技术包括：分析试管或其他适用容器(例如被称为小瓶(vial)的容器)的顶部空间中存在的气体。
所述“顶部空间”是指密封试管内位于受检样品上方的自由空间。
目前，所使用的试管在其底部设有锭剂(pastille)，其与含有细菌的生物样品接触，试管内加入有培养基与培养液；该锭剂的作用是吸收细菌所产生的气体。
专利申请us-a-2010/0255529描述了一种用于检测生物样品中气体物质的方法，该方法通过将生物样品接种于试管内培养基中进行检测。
此外，该文件提供了一种以不同时间间隔进行的对二氧化碳(co2)的测量，以排除可能的错误测量，并通过测量较空气中存在的正常量co2的增量来确定生物样品是阳性或阴性，其作为表明细菌存在于样品中并正在繁殖的信号。
如果co2的检测不确定，即没有超过能证明细菌存在的确定的可接受阈值，则除了第一步之外，还需要进行第二步孵育，以使气体再次充满顶部空间。
这些技术虽然是对其他更传统的流程的改进，但需要co2的检测时间，这取决于样品中存在的细菌负荷，其甚至可能需要几天的时间以进行培养并允许相应的阳性检测(细菌的存在)。
检测时间经常与响应紧迫性不相容。
已知地，为了分析全血样品中的气体，可使用捕获气体以检测co2的装置。例如，可以使用当前技术水平中所公知的，并且例如由biomerieux和bectondickenson所提出的装置。
食品领域中的其他解决方案，例如由f.gardini等人的文献f.gardinietal.,journalofmicrobiologicalmethods29(1997),103-114所描述的，包括：分析装有食物样品的密封试管顶部空间中的co2，使后者中存在的细菌数量与顶部空间中测得的co2百分比相关联。
该解决方案仅限于此特定领域，因其可获得食品样品中有关细菌数量的信息，测量高量的二氧化碳，即高于300ppm(partspermillion，百万分之)的量，这远远高于血液样本中通常存在的co2量。
当co2的量低于300ppm时，f.gardini等人所述的解决方案也需要很长时间以获得结果，而该结果不能给出精确且可靠的指示。
或者，可通过由位于试管自身的塞子上的传感器所测量并确定的压强变化来检测细菌的存在，例如使用versatrek-thermofischer装置。
另一种用于检测细菌活性的技术可以计算试管内部的压强差异，而无需确定检测到的气体种类，例如co2、o2与h2。
其他已知的解决方案，例如wo2014/128629(wo’629)与wo2006/079846(wo’846)，描述了测定分析的样品中存在的细菌、去除并分析挥发性物质的方法，所述挥发性物质在该特定的情况下是指顶空中存在的有机物质或有机衍生物质。
这些已知的解决方案提供了单次测量，也称为一个点，其不提供关于所检查的样品中可能存在的细菌发展和繁殖的信息。
本发明的一个目的是完善一种检测生物样品中细菌活性和存在的方法，该方法快速，易于应用并确保可信的结果。
本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法允许同时检测co2和o2的存在，其可同时验证例如co2量的增加和o2量的减少，其中o2用于形成碳和氧键。该测量可在气态组分的连续测量流中进行。
本发明的另一个目的是提供一种方法，该方法可以减少检测存在的细菌所需的生物样品的量，而现有的检测co2的方法该则在试管中需要超过10ml的全血。
本专利申请人设计、测试并实施了本发明，以克服现有技术的缺点并获得上述与其他的目的和优点。
技术实现要素：
本申请的独立权利要求阐述并表征了本发明，而从属权利要求描述了本发明的其他特征或主要发明构思的变型。
依照上述目的，本发明涉及一种检测细菌活性的方法，即通过分析引入有所述生物样品的密封试管的顶部空间中的特别是，但不仅仅是co2、h2与o2的无机气态物质，来检测生物样品中进行繁殖的活细菌。
本发明基于的是以下原理：活细菌的活性代谢之一必然引起co2的产生，作为其代谢与当前测量的o2减少的标志。
co2和o2的测量有利地以动态测量的形式进行，即在多个不同读取时间的顶部空间内的气态物质的连续流动中进行。
因此，动态测量的次序可提供时间测量曲线，由此构建细菌繁殖的活性动态，特别是通过引入密封小瓶中的生物样品上方的顶部空间的co2的增加和o2的减少(用于与碳结合)来确定。
该方法还用于检测生物样品中存在的真菌和酵母。
因此，本发明包括：移除顶部空间中所含的气体，以分析特别是co2、h2和/或o2的无机气态物质的含量，。
在一个实施方案中，为了促进生物样品中可能存在的细菌的繁殖，本发明包括：向顶部空间中引入可加速细菌繁殖的佐剂物质，例如烃(甲烷、乙烷、丙烷和其他类似的或相当的物质)。
在一个有利的实施例中，本发明包括：在小瓶内引入裂解剂物质以收集样品，裂解剂溶解血红细胞并允许细胞间细菌在样品试管中繁殖。
无机气态物质存在的检测的读取开始时间为t0，并且随着时间，在随后的时间间隔t1、t2，...，tn中再次读取，以构建时间检测曲线，该检测基于发展动态与指数检测，可减少对细菌存在的检测(由检测到无机物质诱发)的时间。
因此，与现有技术中已知的应用不同，本发明可获得检测发展曲线并以此量化至ppm量级。
因此，根据可能的实施例，本发明可测定与生物样品中细菌的存在相关的无机物质，例如co2，其例如在1ppm至10ppm的范围内。
在一个实施例中，本发明还包括：引入培养基或培养液，所述培养基或培养液提供有细菌的营养物质，并有利地增加细菌的发展。以这种方式，本发明产生了有利于细菌发展的培养物，从而减少分析所需的时间。
在一个实施方例中，本发明通过使用具有热导率检测的高速、小型化气相色谱仪进行用于检测co2，h2和/或o2浓度变化的分析。
特别地，本发明使用微型气相色谱仪，通过在试管内引入针而从顶部空间中移除气体。
在该解决方案中，所述针连接于抽吸构件，所述抽吸构件能够移除在试管顶部空间内形成的气体。
根据本发明的一个变型，其还包括：通过第二针将从试管内部取出的气体进行再次引入。
向微型气相色谱仪内的顶部空间再次引入的体积产生了气体循环，这有助于微型气相色谱仪检测到无机气态物质。测量流可以测量可检测的，随着时间的气体量的增加值(delta)，以便使得连接于针头的泵具有可吸入的气态物质。该连续流量流允许第二次采样，以检测到可测量且可用的气体，并在测量时间内比较co2的增加和o2的减少。
若没有这种流动再循环，则第二次采样将找不到可用的气体，因其已被第一次采样所提取。
在一个实施例中，本发明在试管内提供了磁性元件，以搅动生物样品或细菌培养物。检测样品的混合有助于细菌繁殖，以便在培养液中提供营养物质，并通过加入裂解剂物质促进血红细胞的溶解。
附图说明
通过参考以下作为非限制性示例且与一些实施例描述相关的附图，本发明的上述及其他特征将得到进一步的阐述，其中：
图1是根据一个实施例的检测方法的示意图。
为了便于理解，在可能的情况下，本文使用相同的附图标记来标识附图中的相同的共同元件。应当理解的是，一个实施例的元件和特征可轻易地结合到其他实施例中，而无需进一步说明。
具体实施方式
图1所示为检测细菌活性的方法10，即通过检测密封的试管中co2，h2和/或o2的存在与量，来检测带有生物样品的气密封试管中活且繁殖中的细菌的存在。
例如，生物样品14可包括但不限于血液、尿液、唾液、粘液、泪液或其他合适的样品。
在一个实施例中，生物样品14被插入试管或小瓶12中，后者适当地密封并灭菌。
试管12由塞子16密封，所述塞子16包括膜，例如橡胶，其自密封并且允许例如针的穿过。
本发明通过在试管12内部引入最少量的生物样品14(例如少于5ml)来分析生物样品14。
本发明的该方面特点有利地允许了：即使在可获得少量生物样品14时也可应用本发明，例如对新生儿的分析。
根据本发明的一个方面，试管12内留有自由空间或顶部空间18，其设置在塞子16和生物样品14的水平面之间，即在生物样品14的上方。
顶部空间18中允许气体或挥发性物质的积聚，即在试管12内由细菌在其发展期间产生的无机气态物质(细菌分解代谢)。
在此处和下文，本文将涉及理解为无机气态物质的挥发性物质，例如co2、h2和/或o2，鉴于该挥发性物质在本申请公开中的定义，其不包括有机物质。
在一个实施例中，本发明将体积固定的量的气体送至检测单元22，如下文所述。
因此，本发明提供了至少一个步骤，即从顶部空间18中取出存在于试管12内的挥发性样品。
在另一个实施方案中，所述检测单元22为气相色谱仪或微型气相色谱仪22，以进行gc分析。
所述微型气相色谱仪22适当地配置为小型化并且将转移体积减至最小，还配备有用于对塞子16进行穿孔的装置。
在一个实施例中，本发明在从顶部空间18内取出挥发性样品的过程中使用了针装置20，所述针装置20穿过试管12的塞子16并在生物样品14上方吸入所需量的气体物质，该生物样品14内存在由细菌产生的气体。
挥发性样品随后由微型气相色谱仪22分析以检测co2、h2和/或o2的存在和/或量。
特别地，所述微型气相色谱仪22提供有控制和指令装置28。
根据可能的实施例，所述微型气相色谱仪22配置为测定与生物样品中细菌的存在相关的无机物质，例如co2、h2和/或o2，其范围在1ppm至10ppm内。
控制和命令装置28能够处理co2的检测模式30，即在顶部空间18中产生并存在的气态分解代谢物质的检测模式。
此外，作为测量co2的替代或补充，控制和命令装置28能够处理o2的检测模式32。
同时测量两种或更多种无机气态物质(如co2和/或o2)的时间变化的可能性，可使各模式相关并获得精确、可靠且完整的结果。
此外，该测量是通过在每次测量后将气体重新引入顶部空间而进行的，从而可以依次进行测量并获取每种物质的时间演变，继而获得相关的细菌活性的信息。
特别地，气体的移除与随后的再引入过程可提供：在测量时间0时，移除试管内的全气体组分。在t1时，由于在抽吸之前已经吸入了全部物质，对同一试管的第二次读取将产生真空，即负压。
因此，将吸入的物质重新引入同一试管允许了在时间t0，t1，t2，t3...处进行第二次、第三次或第四次读取，该读取是对细菌检测的组分对象的测量评估。
因此，在时间t0，t1，t2，t3...的时间和细分测量中，本发明可以检测无机组分是否随时间增加或稳定。在一个实施例中，针装置20包括针24，以从顶部空间18取出挥发性样品。
挥发性样品的获取可通过试管12中的正压实现，其使得挥发性样品进入微型气相色谱仪22内部。
在一个实施例中，本发明可以使用合并入针装置20的回路中并连接到针24的抽吸构件29，通过抽吸从试管12中取出挥发性样品，以便于测量顶部空间18内的气态物质，且若试管12内的压强等于大气压或负压，也可适用于检测顶部空间18内存在的低浓度气态物质。
在另一个实施例中，所述针装置20包括两个针24。特别地，第二针24适于将从顶部空间18取出的气体再次引入试管12内。
所述第二针24可连接于试管12内的挥发性样品的引入构件33。
两个针24的存在允许了试管12内气体的再循环，从而避免上文所述的现有技术中的以将co2释放到顶部空间18中的等待时间。
此外，随着细菌代谢的增加，co2、o2的周期性测量也将增加，这也有利于定期测量o2。以一个或多个限定的时间间隔进行的顶部空间的周期性测量给出了动态测量结果，即与时间相关的动态测量，作为细菌存在量的根据。因此，微型气相色谱仪22可检测待检测和测量的气态物质的发展量，以便获得相对于时间而检测的气态物质的发展动态，其可由图表表示。
在一个实施例中，本发明可以将生物样品14引入、接种在含有培养液的试管12内。
在孵育期过后，所述生物样品14与培养基或培养液一起形成细菌培养物26。
在另一个实施例中，本发明包括：在没有艾格(eugonic)培养液的情况下，仅将天然生物样品14引入试管12内。
在另一个实施例中，本发明可以在试管12内引入佐剂物质，其能够加速可能存在于生物样品14中的细菌的代谢过程。
所述佐剂物质是指气态物质，例如甲烷、乙烷、丙烷或其他气体，或者液体或固体物质。
在另一个实施方例中，本发明将裂解剂物质引入生物样品14或细菌培养物26内，以释放血红细胞内的细菌。
本文所述螯合剂物质是指碳或树脂，或其他能够在抗生素治疗开始后对样品中存在的抗生素物质进行螯合作用的物质。
在附图中未展示的另一个实施例中，本发明将磁性元件引入试管12的底部以搅动细菌培养物26。
所述磁性元件与搅拌装置相互作用，使其旋转，从而促进细菌与培养基或培养液中存在的代谢物质之间的接触，增加它们的发展并促进裂解剂物质的混合以破坏内部存有细菌的血红细胞。
使用微型气相色谱仪22对存在于挥发性样品中的特别是co2和/或o2的气体的分析，可非常快速地获得结果，例如5至40秒。
在一个实施例中，本发明的方法还配有特定类型的真空试管12。
以此种方式，本发明可以直接从一个系统中取出生物样品14，以直接从患者体内获取生物液体，例如血液。
根据一个实施例的变型，如果必要，本发明方法10可包括：检测试管12内的压强的步骤。以此种方式，本发明可检测附加参数，以识测定生物样品中存在的细菌的类别或种类。
例如，可以测量并检测由顶部空间18中存在的细菌的分解代谢产生的气态物质，同时通过小型化传感器测量试管12中的总压强变化。
应理解的是，在不脱离本发明的领域和范围的情况下，可以对如上所述的方法10和检测单元22进行部件的修改和/或添加。此外，尽管本文参考了一些具体示例以对本发明进行阐述，但本领域技术人员应当能够实现具有如权利要求所述的特征的方法10和检测单元22的许多其他等效变型，而所有这些变型都在于本发明的保护范围内。