利用CD4、CD8细胞信息的HIV诊断方法与流程

本发明涉及利用cd4、cd8细胞信息的hiv诊断方法，具体涉及利用纳米过滤器捕捉细胞，通过观察捕捉到的cd4阳性t细胞及cd8阳性t细胞判断需要开始治疗aids的时间及有效监控aids治疗过程的诊断方法。

背景技术：

据推算全世界范围的aids感染者达到4000万人，而感染者主要在发展中国家。作为aids致病病毒的hiv感染血液中的cd4阳性t细胞，经过数月乃至10年的潜伏期，通过逐渐破坏cd4阳性t细胞降低患者的免疫功能，而免疫力减弱的患者因各种并发症走向死亡。

为判断是否需要治疗aids，有测量血液中的cd4阳性t细胞的方法。上述测量方法有计算cd4阳性t细胞的绝对数的方法、计算全部淋巴球中cd4阳性t细胞所占的比率的方法(cd4/淋巴哦细胞)、计算相对于cd8阳性t细胞数的cd4阳性t细胞数的比率的方法(cd4/cd8)。cd4/淋巴球和cd4/cd8不受年龄的影响，其值的变动比较小，因此，主要使用计算cd4/淋巴球和cd4/cd8比率的方法。在who指导手册中，在cd4阳性t细胞数小于350cells/μl以下，或在5岁之前的幼儿的情况下，在cd4/淋巴球小于0.25的情况、cd4/cd8小于1的情况下，判断为需要开始治疗aids的时间。

上述测量cd4阳性t细胞数的方法通常通过flowcytometry方法来完成。flowcytometry方法虽然具有准确度高的优点，但需要专业人员，设备昂贵，发展中国家难以使用flowcytometry方法。

相关的现有技术如下所述。

美国公开专利第2014-0273018号，为判断是否存在aids发病危险，公开用于cd4阳性t细胞绝对数计算、cd4/淋巴球、cd8/淋巴球比率的仪器和系统，但因捕捉白血球的纳米过滤器的孔间间距是随机的，从而无法在抗原-抗体反应中获得再现性，因非特异性抗体不好被清洗，不容易观察结果。

韩国公开专利第2012-0042518号公开用于捕捉癌细胞的金属筛过滤器，但目的在于捕捉癌细胞之后回收癌细胞，发明的目的不同。

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明涉及一种在利用纳米过滤器高效过滤目标细胞的同时，可判断是否需要开始治疗aids及有效监控aids治疗过程的诊断方法。

解决问题的方法

为解决上述问题，本发明的一实施例提供一种利用包括纳米过滤器的hiv诊断装置的hiv诊断方法，上述纳米过滤器包括用于捕捉细胞的上部主体100；上述上部主体100包括贯通基板110的多个过滤孔120；上述多个过滤孔120中的任意过滤孔与其他过滤孔相邻；上述任意过滤孔和相邻的其他过滤孔之间的中心间距为23μm～27μm；上述hiv诊断方法，包括：(a)上述纳米过滤器捕捉上述细胞中的白血球的步骤；(b)光源部500向上述纳米过滤器的整个面积照射光的步骤；(c)光检测部600检测通过上述纳米过滤器的光的步骤；(d)显示装置700利用通过上述光检测部600获得的信息输出上述纳米过滤器整个面积的图像的步骤；及(e)分析装置800分析输出至上述显示装置700的图像的步骤；上述(e)步骤包括上述分析装置800分析cd4阳性t细胞数对cd8阳性t细胞数的比率信息的步骤。

在一实施例中，较佳地，上述(e)步骤还包括上述分析装置800分析cd4阳性t细胞数及cd4阳性细胞数对淋巴球细胞数的比率信息的步骤；还包括在通过上述分析装置800分析的信息表示，上述cd4阳性t细胞数小于350cells/μl，或上述cd阳性t细胞数对cd8阳性t细胞数的比率小于1，或上述cd阳性t细胞数对淋巴球细胞的比率小于0.25时，判断为需要开始治疗aids的时间的步骤。

在一实施例中，较佳地，上述过滤孔120的平面为圆形，而上述过滤孔120的直径为3μm～5μm。

在一实施例中，较佳地，上述基板110由金属材质或塑料材质构成。

在一实施例中，较佳地，还包括：过滤部130，位于上述基板110上部，供投入样品溶液；吸入部140，位于上述基板110下部，未被上述过滤孔120过滤的物质移动到此；及通道300，连接上述吸入部140和下部主体400；在上述(a)步骤之前，还包括上述下部主体400以一定速度从上述上部主体100隔开，以使投入上述过滤部130的样品溶液以预定的速度吸入至吸入部140的步骤。

在一实施例中，较佳地，上述预定的速度为100μl/min～500μl/min。

在一实施例中，较佳地，上述光检测部600，包括：透镜610，将通过上述纳米过滤器的光变换为平行光形式；激发光过滤器620，允许通过上述透镜610的光成分中的特定波长的光通过；及图像传感器630，检测通过上述激发光过滤器620的光。

在一实施例中，较佳地，在上述(e)步骤之后，还包括上述显示装置700还表示经上述分析装置800分析的信息的步骤。

在一实施例中，较佳地，上述细胞还包括jm细胞或immuno-trol细胞。

在一实施例中，较佳地，在上述(a)步骤之前，还包括将上述cd4阳性t细胞及上述cd8阳性t细胞，各利用alexafluor488标记项humancd4lgg抗体pe-alexafluor610标记项humancd8lgg反应10～30分钟的步骤。

发明效果

根据本发明，任意过滤孔与相邻的过滤孔之间的中心间距固定，可为捕捉细胞调节过滤孔的大小，从而可高效捕捉目标细胞。

另外，本发明的纳米过滤器包括金属材质或塑料材质的基板，从而可简单清洗掉不与抗原反应的抗体。

另外，可以固定速度吸入样品溶液，从而可高效捕捉目标细胞。

另外，在捕捉目标细胞的同时，可实时观察纳米过滤器整个面积。

另外，本发明的利用分析装置的诊断方法，因可计算出cd4/淋巴球、cd4/cd8比率，从而可判断需要开始治疗aids。

另外，不仅可观察cd阳性t细胞、cd8阳性t细胞，而且，还可观察存在于cd19、cd45等白血球中的cd抗原。

附图说明

图1a为本发明实施例的纳米过滤器的斜视图；

图1b为表示因图1a的纳米过滤器的下部主体从上部主体隔开，以使投入至过滤部的样品溶液吸入的示意图；

图1c为图1b的纳米过滤器的截面图，是沿a-a’的截面图；

图2a为利用图1a的纳米过滤器的分析装置的概略图；

图2b为图1a的纳米过滤器的显微镜照片；

图3a为对捕捉于图1a的纳米过滤器中的白血球进行染色之后观察的荧光显微镜图像；

图3b为利用本发明实施例的分析装置观察cd4阳性t细胞、cd8阳性t细胞进行观察的示意图，其中，(1)表示pe标记cd8阳性t细胞；(2)表示alexaflur488标记cd4阳性t细胞；

图4-(a)为表示在荧光显微镜及本发明实施例的分析装置中测量的cd4/cd8比率的相关关系的图表；图4-(b)为利用本发明实施例的分析装置表示cd4/cd8比率的图表；

图5为根据过滤孔大小的白血球回收率图表；

图6为根据样品溶液的吸入速度的白血球回收率图表；

图7为与作为用于计算cd4/cd8比率等的现有的方法的flowcytometry方法的测量比较结果示意图；

图8为本发明的利用分析装置的诊断方法的顺序图。

具体实施方式

1、对纳米过滤器的说明

下面，对本发明实施例的纳米过滤器进行说明。

参考图1a及图1b，本发明实施例的纳米过滤器包括用于捕捉细胞的上部主体100。

上部主体100在内部包括贯通基板110的多个过滤孔120，以通过多个过滤孔120捕捉目标细胞(例如，白血球)。在捕捉白血球时，会一并捕捉存在于血液内的红血球，但在向过滤部130投入血液之前，通过红血球溶解过程减少红血球的大小，从而不会被过滤孔120过滤。因此，只有所希望的白血球才被过滤孔120捕捉。对红血球溶解过程，在此不再赘述。

可通过调节各多个过滤孔120捕捉目标细胞。若将过滤孔120调节成小于目标细胞的大小，则因目标细胞不能通过过滤孔120，从而可捕捉所希望的目标细胞。较佳地，任意过滤孔和相邻的其他过滤孔之间的中心间距为23μm～27μm。若相隔的距离过短，则在显示于将要后述的显示装置700的影像中，各过滤孔120的图像有可能重叠，而若过长，则用于捕捉目标细胞的过滤孔120的数量不充分。

较佳地，上述过多个过滤孔120的平面为圆形，而过滤孔120的直径为3μm～5μm。

若过滤孔120的直径比这个大，则无法准确捕捉白血球，从而降低包含于样品血液中的白血球的回收率。根据过滤孔120的直径的大小的白血球回收率的实验将在以后的内容中详述。

较佳地，上述基板110由金属材质或塑料材质构成。因基板110由金属材质或塑料材质构成，在目标细胞的抗原和荧光标记的抗体的抗原-抗体反应之后，可简单清洗掉未与抗原反应的抗体(washing过程)。

本发明实施例的纳米过滤器，还包括：过滤部130，与基板110连接并未与基板110上部；吸入部140，与基板110连接并位于基板110下部。

过滤部130为投入包含目标细胞的样品溶液的空间。由可容纳一定容量的空间构成，投入至过滤部130的样品溶液经过滤孔120过滤，而未被过滤的物质将移动至吸入部140。

吸入部140为未被过滤孔120过滤的物质移动到的空间。因小于过滤孔120大小的物质不被过滤孔120过滤，从而通过过滤孔120移动到吸入部140。

本发明实施例的纳米过滤器，还包括连接上述吸入部140和下部主体400的通道300。

上述下部主体400以固定速度从上述上部主体100相隔，从而起到吸入样品溶液的泵的作用。参考图1b，在下部主体400从上部主体隔开的过程中，吸入过滤部130的空气，从而吸入投入至过滤部130的样品溶液。若不吸入样品溶液，则过滤部130的样品溶液不被过滤，而强停留在过滤部130。通过吸入杨平溶液，较之不吸入样品溶液的纳米过滤器，可进行过滤。

此时，因下部主体400以固定速度从上部主体100相隔，样品溶液也以预定的速度被吸入，而较佳地，预定的速度为100μl/min～500μl/min。

若吸入速度慢，则与不吸入的纳米过滤器没有差别，但若吸入速度快，则因包含于样品溶液的白血球在被挤的状态下功能通过过滤孔120，从而降低白血球的回收率。根据吸入速度的白血球回收率的实验将在以后的内容中详述。

2、对利用纳米过滤器的分析装置的说明

下面，对本发明实施例的利用纳米过滤器的分析装置进行说明。

参考图2a，本发明实施例的分析装置，包括：本发明实施例的纳米过滤器；光源部500，位于上述纳米过滤器下部，向上述纳米过滤器照射光；光检测部600，隔着上述纳米过滤器与上述光源部500相对，检测通过上述纳米过滤器的光。

纳米过滤器通过上部主体100捕捉目标细胞(例如，白细胞)。捕捉目标细胞的方法已在前面详述，在此不在赘述。

光源部500向上述纳米过滤器照射光。捕捉于纳米过滤器的目标细胞处于与荧光标记的抗体结合的状态。此时，荧光物质通过吸收特定波长的光成为激发态(excitedstate)。白色光中包括可见光区域的所有波长的光，从而不受荧光物质的种类的影响，都可以造成激发态。因此，较佳地，上述光源部500为照射白色光的led或水银灯或卤素灯。

光检测部600检测通过纳米过滤器的光。光检测部600包括位于下部的透镜610、位于透镜610上部的激发光过滤器620及位于激发光过滤器620上部的图像传感器630。

透镜610将通过纳米过滤器的光变换为平行光形式。较佳地，透镜610为将光平行的光学部件。通过将光变换为平行光形式，达到图像传感器630的光为平行光形式，从而使图像观测变得容易。

激发光过滤器620只允许特定波长的光通过。标记于抗体的荧光物质在吸收光源部500照射的光的特定波长之后，成为激发态(excitedstate)。此时，在回到基态(groundstate)的同时，发射特定区域的波长。激发光过滤器620只允许特定波长的通过，阻断其余波长，从而可只观测荧光标记的目标细胞。

图像传感器630检测激发光过滤器620的光变换为电信号，从而形成数字图像。因此，通过纳米过滤器的光变换为数字图像。较佳地，图像传感器630为cmos传感器。

本发明实施例的分析装置，还包括：显示装置700，输出通过光检测部600获得的信息；及分析装置800，从显示于显示装置700的影像分析信息。

显示装置700显示经图像传感器630变换的数字图像。从而可通过肉眼确认荧光标记的目标细胞(请参考图3a及图3b)。

分析装置800分析显示于显示装置700的影像。经过分析的信息可以是cd4/淋巴球比率或cd4/cd8比率。

显示装置700还表示经分析装置800分析的信息。从而可通过肉眼确认cd4/淋巴球比率或cd4/cd8比率。

显示装置700包括提示部，当经分析装置800分析的信息表示cd4阳性t细胞数小于350cells/μl或cd4/cd8比率小于1时，启动提示部。因此，可通过声音确认存在aids发病危险与否。

3、对利用分析装置的诊断方法的说明

下面，对本发明实施例的利用分析装置的诊断方法进行说明。

本发明实施例的诊断方法，包括：(a)纳米过滤器捕捉目标细胞中的白血球的步骤；(b)光源部500向纳米过滤器的整个面积照射光的步骤；(c)光检测部600检测通过纳米过滤器的光的步骤；(d)显示装置700利用通过光检测部600获得的信息输出纳米过滤器整个面积的图像的步骤；及(e)分析装置800分析输出至显示装置700的图像的步骤；上述(e)步骤包括分析装置800分析cd4阳性t细胞数对cd8阳性t细胞数的比率信息的步骤。

(a)步骤是目标细胞被纳米过滤器捕捉的步骤，目标细胞在将包含目标细胞的样品溶液投入至上部主体100之前，与经荧光标记的抗体进行反应。目标细胞较佳为白血球，而与白血球反应的抗体额种类可以是一种以上。由此，可通过肉眼同时观察各种目标细胞。

(b)步骤是光源部500向纳米过滤器的整个面积照射光的步骤，标记于抗体的荧光物质通过吸收特定波长的光成为激发态(excitedstate)。

(c)步骤是光检测部600检测通过纳米过滤器的光的步骤(s220)，光检测部600包括透镜610、激发光过滤器620、图像传感器630。

透镜610将通过纳米过滤器的光变换为平行光形式，以使图像观察变得容易。通过透镜610的平行光形式的光通过激发光过滤器620。

激发光过滤器620只允许特定波长通过，吸收从光源部500照射的光的荧光物质，在从激发态(excitedstate)回到基态(groundstate)的过程中发射特定区域的波长。激发光过滤器620根据荧光物质的种类改变允许通过的波长的区域，从而可只观测荧光标记的目标细胞。

图像传感器630检测激发光过滤器620的光变换为电信号，从而形成数字图像。因此，通过纳米过滤器的光变换为数字图像。

(d)步骤是显示装置700利用通过光检测部600获得的信息输出纳米过滤器整个面积的图像的步骤，可通过显示装置700肉眼确认经光检测部600变换的数字图像。若在(a)步骤中使用了多种抗体，可根据标记于抗体的荧光物质的种类，同时观察到各种不同颜色的图像。

(e)步骤是分析装置800分析输出至显示装置700的图像的步骤，例如若在(a)步骤中利用了抗cd4抗体(用绿色荧光物质标记)和抗cd8抗体(用黄色荧光物质标记)，则可从显示于显示装置700的影像分析cd4阳性t细胞数对cd8阳性t细胞数的比率信息。

在(e)步骤中，分析装置800不仅可分析cd4阳性t细胞数对cd8阳性t细胞数的比率信息，还可分析cd4阳性t细胞数及cd8阳性t细胞数对淋巴球数的比率信息。

另外，本发明实施例的诊断方法，还包括在通过上述分析装置800分析的信息表示，上述cd4阳性t细胞数小于350cells/μl，或上述cd阳性t细胞数对cd8阳性t细胞数的比率小于1，或上述cd阳性t细胞数对淋巴球细胞的比率小于0.25时，判断为需要开始治疗aids的时间的步骤。因此，可利用本发明实施例的诊断方，法简单准确地判断需要开始治疗aids的时间。

4、根据过滤孔大小的白血球回收率实验

为确认根据本发明实施例的纳米过滤器的过滤孔120大小的白血球回收率进行了实验。

以200μl/min的速度吸入投入至过滤部130的血液样品，利用5个血液样品进行了实验。

如图5所示，可看到当过滤孔120的直径为3μm～5μm时，白血球回收率高，而但当6μm时，白血球回收率急剧减少。基于上述结果，可确认过滤孔120的直径较佳为3μm～5μm。

5、根据样品溶液吸入速度的白血球回收率实验

为确认根据本发明实施例的纳米过滤器的样品溶液吸入速度的白血球回收率进行了实验。

以各不同的速度吸入投入至过滤部130的血液样品，将过滤孔120的直径固定为3μm，利用5个血液样品进行了实验。

如图6所示，可看到当吸入速度为100μl/min～500μl/min时，白血球回收率高，而但高于上述速度时，白血球回收率减少。基于上述结果，可确认样品溶液的吸入速度较佳为100μl/min～500μl/min。

6、验证实验1

为确认本发明实施例的分析装置的目标细胞捕捉效率的优秀性进行了实验。

通过图2a的分析装置，利用作为取自t淋巴肿瘤的培养细胞株的jm细胞进行捕捉。染色及清洗培养的jm细胞之后，使用cellstrainer(40μm，bdbiosciences)过滤免疫细胞。之后，利用fuchs-rosenthal测量细胞数，制造细胞样品(5×10⁴cells/ml)。利用制得的样品将纳米过滤器的吸入部140用pbs填充之后，向过滤部130投入荧光标记的jm细胞样品200μl，以200μl/min吸入投入至纳米过滤器的样品，以此进行利用纳米过滤器的细胞捕捉。捕捉之后，利用4％paraformaldehyde对捕捉于纳米过滤器的细胞进行15分钟的固定，完全去除纳米过滤器上的水。在利用本发明的分析装置观察图像之前，利用普通的荧光显微镜进行观察，确认细胞捕捉在纳米过滤器上。接着，为了计算纳米过滤器上的细胞捕捉率，利用控制血球样品进行细胞捕捉实验。向质控管理用控制血球(人白血球/红血球保存液，immuno-trolcells，beckmancoulte公司)添加标准化抗体混合物、核染色试剂(hoechst33342，浓度：5μg/ml，ex/em＝343/483nm)之后，在遮光条件下室温反应45分钟。染色处理后，用cellcounter确认细胞浓度之后，将用pbs稀释制得的细胞悬浮液200μl(4500cells)投入新的纳米过滤器并吸入，以此进行细胞捕捉，利用荧光显微镜进行观察(请参考图3a)。结果表明，可以97±2.2％的效率捕捉细胞。由此可知，本发明实施例的分析装置具有足够的细胞捕捉能力。

7、验证实验2

对本发明实施例的分析装置的cd阳性t细胞的可测量与否进行了实验。在实验中，利用了cd阳性细胞和cd8阳性t细胞。此时，为了利用相同的激发光和不同波长的荧光检测两种细胞，使用两种荧光色素进行分离的dualcolorimaging。为此，通过激发光过滤器620的波长设定为可同时观察绿色荧光和黄色荧光的波长(λex＝464.5-499.5nm，λem≥519nm)。首先，在纳米过滤器上捕捉利用取自白鼠的alexafluor488(λex＝499nm，λem＝520nm)标记项人cd4igg抗体及取自白鼠的pe-alexafluor610(λex＝567nm，λem＝627nm)标记项人cd8igg抗体进行抗原-抗体反应，以免疫染色的cd4阳性t细胞和cd8阳性t细胞，利用本发明实施例的分析装置观察的结果表明，可通过显示装置700同时观察到标记于cd4阳性t细胞及cd8阳性t细胞的荧光(请参考图3b)。由此可知，用于本发明的分析装置可测量cd4阳性t细胞。

8、验证实验3

为确认利用本发明实施例的分析装置的cd4阳性t细胞测量的优秀性，利用现有的细胞组进行了实验。

作为细胞样品，使用标记有血中t细胞的浓度的质控管理用控制血球(immuno-trolcells或immuno-trollowcells，beckmancoulter)。通过抗逆转录病毒治疗药的开始使用标准的350cells/μl值，将cd4阳性t细胞数多，cd4/cd8比率大于1的血液样品定义为highsample(cd4阳性t细胞数：566±165cells/μl，cd8阳性t细胞数：263±118cells/μl，cd4/cd8＝2.15)，将cd4阳性t细胞数少于350cells/μl，cd4/cd8比率小于1的血液样品定义为lowsample(cd4阳性t细胞数：140±70cells/μl，cd8阳性t细胞数：232±116cells/μl，cd4/cd8＝0.60)。将各血液样品利用取自rat抗人cd4igg及取自白鼠的抗人cd8igg混合溶液(浓度：10μg/ml)，各与cd4阳性t细胞核cd8阳性t细胞进行30分钟的抗原-抗体反应。利用0.1mpbs稀释血液样品200μl，以包括相当于1μl血液的血球并投入过滤部130作为样品。另外，各利用6个lowsample、highsample进行实验。

在纳米过滤器上捕捉细胞之后，首先利用荧光显微镜测量被绿色(cd4阳性t细胞)及黄色(cd8阳性t细胞)染色的细胞。之后，利用本发明实施例的分析装置，以纳米过滤器整个区域作为对象测量细胞数，计算cd4/cd8比率，并与荧光显微镜观察结果进行比较。结果发现，两者之间存在很高的相关性(请参考图4-a)。由此可知，可利用本发明实施例的分析装置计算与利用dualcolorimaging的荧光显微镜相同精密度的cd4/cd8比率。另外，利用本发明实施例的分析装置计算cd4/cd8比率的结果表明，可获得与期待值相同的额值(请参考图4-b)。由此可知，可利用本发明实施例的分析装置进行基于aids治疗开始标准(cd4阳性t细胞数小于350cells/μl或cd4/cd8<1)的cd阳性t细胞数的high/low判断。

9、验证实验4

利用本发明实施例的纳米过滤器捕捉血液样品1μl的白血球(10³～10⁴cells)，并利用本发明实施例的分析装置测量之后，利用所获得的值进行了实验。

对照组为利用作为现有的cd4阳性t细胞测量方法的flowcytometry测量的结果值。结果获得如图7所示的结果。如图7所示，与作为现有的方法的flowcytometry方法的结果值差异不大。由此可知，本发明实施例的分析装置可进行aids的适合的开始治疗时间的判断和治疗后的有效的监控。

上述实施例仅用以说明本发明而非限制，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行修改、变形或者等同替换。而在不脱离本发明的精神和范围之内，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。