一种基于回音壁模式微腔阵列的微流控检测芯片的制作方法

本发明涉及一种基于回音壁模式微腔阵列的微流控检测芯片，属于微流控检测芯片领域。

背景技术：

微流控检测芯片技术出现于以功能基因组学和蛋白质组学为核心的后基因组时代，从20世纪90年代初、中期发明至今仅十余年时间，却已经在生命科学研究中的诸多领域进行应用，在临床上广泛被应用在癌症的检测、病原性疾病和免疫性疾病的诊断等方面。但是现在大多数微流控检测芯片检测载体需使用双抗夹心法进行检测，反应过程需要进行两步反应，三步洗涤，操作复杂、耗时且成本高。

解决上述问题的解决方案是以非标记的检测载体代替现有的利用双抗夹心法的检测载体。利用具有回音壁模式微腔的荧光微球作为固相载体进行生物分子检测就是一种能够实现非标记检测的有效方法。其原理是微球中的荧光染料受泵浦之后，在回音壁微腔中形成受激辐射，其辐射模式对微球表面的折射率变化响应灵敏，因此微球表面抗原抗体的结合会导致其辐射模式的改变，改变的大小则可以反应待测物浓度的高低。为了能够同时检测多个组分，实现多元非标记检测，微球可以用其所含有的荧光染料作为编码，不同的荧光染料产生不同的受激辐射模式，可以对不同的待测物做出响应。本发明旨在提供一种利用回音壁模式微腔阵列的微流控芯片，实现非标记多元生物分子检测。

技术实现要素：

技术问题：本发明目的是提供一种基于回音壁模式微腔的微流控芯片，通过将荧光染料编码的微球排列于微孔板中，待测样品溶液以流过式穿过微球，充分与微球接触，待测物与微球表面的生物探针分子反应之后引起回音壁微腔中荧光染料受激辐射模式的改变，从而实现多元非标记生物分子检测，该芯片制备简单，可以用于核酸和蛋白质等的高通量检测，操作简单，灵敏度高，成本低。

技术方案：本发明提供了一种基于回音壁模式微腔阵列的微流控检测芯片，该芯片由盖片、微孔板和基片自上而下组装而成，所述盖片依次由进液口、进液口通道和上反应腔组成，且上反应腔的下部具有下开口，所述的基片依次由出液口、出液口通道和下反应腔组成，且下反应腔的上部具有上开口，其中下开口和上开口对齐放置构成反应池，微孔板平放于下开口和上开口之间，进液口管线贯穿进液口，出液口管线贯穿出液口，所述微孔板的中部排列有微球阵列。

其中：

所述盖片和基片的材料为聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃共聚物、环烯烃聚合物或玻璃。

所述的微球阵列由具有回音壁模式的微球组成，所述微球的内部含有荧光染料，且表面固定有生物分子探针，利用所述微球的粒径大小、内部含有的荧光染料和表面固定的生物分子探针对该微球进行编码，通过微球的粒径大小的差异、内部含有的荧光染料的差异和表面固定的生物分子探针的差异实现对靶标分子的多元非标记检测。

所述的荧光染料在微球内部受激发光，由于微球的回音壁模式，激发强度达到一定阈值之后，荧光染料产生受激辐射；不同荧光染料的受激辐射模式不同，用于编码不同的微球，不同编码的微球表面固定不同的生物分子探针，检测不同的靶标分子。

所述的荧光染料在微球内的受激辐射模式响应微球表面折射率的变化，固定在微球表面的生物分子探针捕获靶标分子引起微球表面折射率的改变，从而使荧光染料受激辐射模式产生变化，通过生物分子探针与靶标分子结合前后荧光染料受激辐射模式的变化实现靶标分子的非标记检测。

所述的不同荧光染料受激辐射模式的变化响应生物分子探针与靶标分子相互作用的变化区间位于不同的光谱区间，并且不重合，在不同荧光染料编码微球表面分别检测不同的靶标分子，从而实现靶标分子的非标记多元检测。

所述微球的直径为1～500μm，微球的材料是微球的材料是聚苯乙烯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸、苯乙烯-甲基丙烯酸、苯乙烯-丁二烯-苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氧化乙烯、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚丙交酯、聚(乳酸-羟基乙酸)、聚己内酯、聚芳醚酮、聚苯硫醚、聚醚醚酮、聚苯胺、聚噻吩、聚丙烯腈、聚苯并咪唑、聚酰亚胺、尼龙、聚4-乙烯吡啶、聚氨酯、聚乙烯、聚醋酸乙烯酯、海藻酸钠、聚乙烯咔唑、聚(乙烯-醋酸乙烯酯)、聚(乙烯-乙烯醇)、聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚硅氧烷、聚甲醛、聚乙醛、聚碳酸酯、聚羟基丁二酸戊酸酯、聚对苯二甲酸苯二胺、聚对苯二甲酸苯二酯、纤维素或聚醚酰亚胺。

所述的荧光染料是异硫氰酸荧光素、尼罗红、Alexa Fluor系列染料、水溶性3H-吲哚菁型生物荧光标示染料、藻红蛋白、卟啉、荧光增白剂、吖啶、菲啶类染料、嗪类染料、罗丹明类染料、二氟垸硼类染料、萘酰亚胺类染料、芴类荧光染料或酞菁类染料。

所述的荧光染料需要泵浦源激发，其中泵浦源是指激光器、汞灯光源或者弧光光源。

所述的生物分子探针是具有识别功能的分子。

所述的具有识别功能的分子是核酸、蛋白质、多肽。

所述微孔板为是玻璃微孔板、金属微孔板或硅微孔板，其上的微孔为正方形，微孔的边长为0.6～300μm，微球被捕获在方形微孔中。

该检测芯片利用具有分液阀门的进样泵将溶液通过进液口管线注入进液口通道，其中进样泵是蠕动泵或者注射泵。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、芯片制备简单：只要将基片、盖片、微孔板、微球、进液口管线、出液口管线、进样泵等进行组装即可完成，大大降低了芯片的成本。

2、样品需要量少，检测速度快，灵敏度高：由于检测反应只在芯片内进行，反应液来回流动，可以减少溶液的挥发和目的靶分子到达探针的时间，提高反应的速度，缩短检测时间；同时，检测反应以微球为载体，比表面积大，检测灵敏度高。

3、降低成本，简化操作步骤：通过使用固定有生物分子探针的具有回音壁模式微腔的荧光编码微球作为检测的固相载体，可以在与样品溶液一次反应并洗涤后进行检测，而不需要进行多次抗原抗体的反应以及多次的洗涤，从而既节约了成本，又简化了操作步骤。

4、检测方便：由于具有回音壁模式的荧光编码微球被封装在反应池中且彼此之间有一定的距离，不用对单个微球进行单独操作，可以对微球逐个检测，简化了操作难度；

5、检测通量高：采用具有回音壁模式微腔的荧光编码微球作为检测反应的固相载体，因此可以进行多元生物分子检测，同时检测同一个样品中的多个指标；在芯片中放入n种标记不同探针的荧光编码微球就可以检测n种分子，检测通量高。

6、可扩展性高：由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同样品预处理等微流控芯片集成，促进了分析系统的微型化和自动化。

附图说明

图1为本发明基于回音壁模式微腔的微流控芯片的结构示意图；

图2为单个微球的回音壁模式光路图；

其中有盖片1、进液口1-1、进液口管线1-2、进液口通道1-3、上反应腔1-4、下开口1-5、基片2、出液口2-1、出液口管线2-2、出液口通道2-3、下反应腔2-4、上开口2-5、微孔板3、微球4、进样泵5、溶液6。

具体实施方案

本发明提供了一种回音壁模式微腔的微流控芯片，芯片中设有具有回音壁模式的微球4作为生物分子检测的固相载体，微球4被放置在微孔板3的微孔中。芯片通过装备有分液阀的进样泵5输入溶液6：待测样品、反应液以及洗涤液。

实施例1：

微流控芯片的制备：

1、盖片1和基片2的制备：使用2cm×3cm×3mm(长×宽×高)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，通过激光微加工在PMMA片中切削出所需结构：其中进液口通道1-3(或出液口通道2-3)长度为5mm，直径为1.5mm，上反应腔1-4(或下反应腔2-4)的直径为2.5mm，高度为1.5mm，下开口1-5(或上开口2-5)直径为2.5mm。

2、微孔板3为圆形方孔镍网，其直径为3mm，孔径50μm，具有回音壁模式的微球卡在微孔板的方孔中。

3、芯片的组装：在基片2的上开口2-5所在的面上涂一层PDMS(下反应腔2-4内部不涂)，放入75℃烘箱预固化10min，之后将微孔板3盖在上开口2-5处，再将盖片1中的下开口1-5与基片1中上开口2-5相对齐粘合，压紧后放入75℃烘箱固化2h。

4、将进液口1-1和出液口2-1分别用胶水做密封，将材质为硅胶的、外径为1mm、长度为10mm的进液口管线1-2和出液口管线2-2分别贯穿进液口1-1的密封处和出液口2-1的密封处。

实施例2：

用基于回音壁模式微腔阵列的微流控芯片检测血液中肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚还原(CEA)、糖原125(CA125)：

1、微流控芯片的制备同实施例1，其中微孔板3为圆形方孔硅网，直径3mm，微孔边长为0.6μm。

2、将固定有甲胎蛋白(AFP)、癌胚还原(CEA)、糖原125(CA125)抗体的三种荧光编码的微球4各五个通过进液口管线1-2通入反应池5，将微球4固定到微孔阵列中，微球4的直径为1μm，；采集每个微球4的荧光染料受激辐射模式光谱；

3、然后，将进液口硅胶管线与装备有分液阀门的往返式蠕动泵相连，通过蠕动泵输入待检测血清，使待检测血清与15个微球4充分接触，设置蠕动泵为往返运动模式，使血清在芯片中来回流动，充分与微球4混合反应，保持反应体系温度为37℃；

4、反应完毕，通过蠕动泵将待测血清泵出，同时不断泵入洗涤缓冲液对微球4进行洗涤，洗涤充分后，采集每个微球4的荧光染料受激辐射模式光谱，并与反应前的模式光谱对应，得出分析结果。

实施例3：

用基于回音壁模式微腔阵列的微流控芯片检测血液中肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚还原(CEA)、糖原125(CA125)：

1、微流控芯片的制备同实施例1，其中微孔板3为圆形方孔硅网，直径3mm，微孔边长18μm。

2、将固定有甲胎蛋白(AFP)、癌胚还原(CEA)、糖原125(CA125)抗体的三种荧光编码的微球4各五个通过进液口管线1-2通入反应池5，将微球3固定到微孔阵列中，微球3的直径为20μm，；采集每个微球3的荧光染料受激辐射模式光谱；

3、然后，将进液口硅胶管线与装备有分液阀门的往返式蠕动泵相连，通过蠕动泵输入待检测血清，使待检测血清与15个微球4充分接触，设置蠕动泵为往返运动模式，使血清在芯片中来回流动，充分与微球4混合反应，保持反应体系温度为37℃；

4、反应完毕，通过蠕动泵将待测血清泵出，同时不断泵入洗涤缓冲液对微球4进行洗涤，洗涤充分后，采集每个微球4的荧光染料受激辐射模式光谱，并与反应前的模式光谱对应，得出分析结果。

实施例4：

用基于回音壁模式微腔阵列的微流控芯片检测血液中肿瘤标志物糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特异抗原(PSA)。

1、微流控芯片的制备同实施例1，其中微孔板为圆形方孔硅网，直径3mm，微孔边长85μm。

2、将固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特异抗原(PSA)抗体的三种荧光编码微球各5个通过进液口管线通入反应池，将微球固定到微孔阵列中。微球的直径为100μm；采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱。

3、然后，将进液口管线与装备有分液阀门的往返式蠕动泵相连，通过蠕动泵输入待检测血清，使待检测血清与15个荧光微球充分接触，设置蠕动泵为往返运动模式，使血清在毛细管中来回流动，充分与荧光微球混合反应，保持反应体系温度为37℃；

4、反应完毕，通过蠕动泵将待测血清泵出，同时不断泵入洗涤缓冲液对荧光微球进行洗涤，洗涤充分后，采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱，并与反应前的模式光谱对应，得出分析结果。

实施例5：

用基于回音壁模式微腔阵列的微流控芯片检测血液中肿瘤标志物糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特异抗原(PSA)。

1、微流控芯片的制备同实施例1，其中微孔板为圆形方孔硅网，直径3mm，微孔边长170μm。

2、将固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特异抗原(PSA)抗体的三种荧光编码微球各5个通过进液口管线通入反应池，将微球固定到微孔阵列中。微球的直径为200μm；采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱。

3、然后，将进液口管线与装备有分液阀门的往返式蠕动泵相连，通过蠕动泵输入待检测血清，使待检测血清与15个荧光微球充分接触，设置蠕动泵为往返运动模式，使血清在毛细管中来回流动，充分与荧光微球混合反应，保持反应体系温度为37℃；

4、反应完毕，通过蠕动泵将待测血清泵出，同时不断泵入洗涤缓冲液对荧光微球进行洗涤，洗涤充分后，采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱，并与反应前的模式光谱对应，得出分析结果。

实施例6：

用基于回音壁模式微腔阵列的微流控芯片检测血液中肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚还原(CEA)、糖原125(CA125)：

1、微流控芯片的制备同实施例一，其中微孔板为圆形方孔硅网，直径3mm，微孔边长280μm。

2、，将固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特异抗原(PSA)抗体的三种微球各5个通过进液口管线通入反应池，将微球固定到微孔阵列中；，微球的直径为300μm，采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱；3、然后，将进液口管线与装备有分液阀门的往返式蠕动泵相连，通过蠕动泵输入待检测血清，使待检测血清与15个荧光微球充分接触，设置蠕动泵为往返运动模式，使血清在毛细管中来回流动，充分与荧光微球混合反应，保持反应体系温度为37℃；

4、反应完毕，通过蠕动泵将待测血清泵出，同时不断泵入洗涤缓冲液对荧光微球进行洗涤，洗涤充分后，采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱，并与反应前的模式光谱对应，得出分析结果。

用基于回音壁模式微腔阵列的微流控芯片检测血液中肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚还原(CEA)、糖原125(CA125)：

实施例7：

1、微流控芯片的制备同实施例一，其中微孔板为圆形方孔硅网，直径3mm，微孔边长300μm。

2、，将固定有糖原242(CA242)、糖原199(CA19-9)、前列腺特异抗原(PSA)抗体的三种微球各5个通过进液口管线通入反应池，将微球固定到微孔阵列中；，微球的直径为500μm，采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱；3、然后，将进液口管线与装备有分液阀门的往返式蠕动泵相连，通过蠕动泵输入待检测血清，使待检测血清与15个荧光微球充分接触，设置蠕动泵为往返运动模式，使血清在毛细管中来回流动，充分与荧光微球混合反应，保持反应体系温度为37℃；

4、反应完毕，通过蠕动泵将待测血清泵出，同时不断泵入洗涤缓冲液对荧光微球进行洗涤，洗涤充分后，采集每个微球的荧光染料受激辐射模式光谱，并与反应前的模式光谱对应，得出分析结果。