一种多波段光谱成像光源、成像方法及显微镜与流程

本发明涉及医学光谱成像技术领域，具体的说是一种多波段光谱成像光源、成像方法及显微镜，用于细胞成分的定位和定量分析，特别是医学领域的细胞内组分的定量分析。

背景技术：

光谱成像技术起源于20世纪70年代的多光谱遥感技术，并随着对地遥感应用的需要而发展.光谱成像技术的最重要特征和标志是光谱和图像结合为一体，它所获取的地球表面图像包含了丰富的空间、辐射和光谱三重信息，因而在地质、农业、植被、环境、城市、军事、水文、大气等方面都有良好的应用。

将光谱成像技术应用于生物组织样本的检测,对生物组织光谱数据进行定性、定量和定位分析,可以真正实现对生物组织进行“在哪处、有什么、有多少”的综合分析目标，从而实现对某些病理变化的早期诊断。

光谱成像实现的方法目前主要有三种：

1.采用基于电声光原理的aotf或基于偏振光的干涉原理的lctf电控调制器件滤光，用ccd采集滤光后的图像。这类方法的短板是电控滤光器件的不均匀性、杂散光以及低透过率影响较大，实现成本较高。

2.采用薄膜干涉滤光片制成的电控滤光轮滤光，转动到不同的滤光片，用ccd采集不同波长滤光后的图像。缺点是受滤光轮切换速度制约，成像速度较慢。

3.沿用航空遥感中推帚式成像光谱仪的原理，采用棱镜或光栅组合元件在后光学系统进行光谱分光，利用高精度载物台自动装置驱动进行推扫成像。优点是光谱分辨率较高，缺点是成像速度依然很慢。

技术实现要素：

本发明提供了一种多波段光谱成像光源、成像方法及显微镜，解决医学领域快速多光谱成像的问题。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来具体实现：

本说明书中描述的以下名称意义为：

离散单色光，指一个以上(含一个)的多个单色波长的单色光组合。

组合光源，指能发出一个以上(含一个)多个单色波长组合的离散单色光的光源。

一种多波段光谱成像光源，包括：

第一组合光源，至少能够发出第一波长的离散单色光，并且经第一准直镜准直后以第一入射角度射向反射镜的镜面；

反射镜，用于接收所述第一组合光源的入射光并反射出去，所述第一组合光源与所述反射镜之间形成第一光路；

第一半反半透镜片，设在所述第一单色光源与所述反射镜之间的第一光路上，所述第一半反半透镜片包括相互背离且平行的第一镜面和第二镜面，所述第一组合光源以第一入射角度射向所述第一半反半透镜片的第一镜面；

第二组合光源，能够发出第二波长离散单色光，第二组合光源设在所述第一光路以外的位置，并且所述第二组合光源以第二入射角度射向所述第一半透半反镜片的第二镜面；

其中，所述第一波长与所述第二波长不相等，并且所述第一入射角度在30-60度之间，所述第二入射角度在30-60度之间。

优选地，在所述第一组合光源的出射方向设有第一准直透镜，所述第一组合光源位于所述第一准直透镜的光心上；

和/或，所述第二组合光源的出射方向上设有第二准直透镜，所述第二组合光源位于所述第二准直透镜的光心上。

优选地，所述第一组合光源和/或所述第二组合光源能够发出一种或一种以上波长的离散单色光，并且第一组合光源、第二组合光源能够发出的离散单色光的波长不相等。

优选地，所述第一半透半反镜片为二色性滤光镜片，或者所述第一半透半反镜片为部分透射部分反射的金属膜镜片。

优选地，还包括：

第二半透半反镜片，设在所述第一半透半反镜片与所述反射镜之间的光路上，所述第二半透半反镜片包括相互背离且平行的第三镜面和第四镜面，所述第一组合光源以第三入射角度射向所述第二半透半反镜片的第三镜面；

第三组合光源，至少能够发出第三波长的离散单色光，所述第三组合光源以第三入射角度射向所述第二半透半反镜片的第四镜面；

其中，第三波长与所述第一波长、第二波长不相等，所述第三入射角度在30-60度之间。

优选地，所述第一波长、第二波长、第三波长之间具有第一波长<第二波长<第三波长的关系，使三个光源的波长呈递增的趋势；或者所述第一波长、第二波长、第三波长之间具有第一波长>第二波长>第三波长的关系，使三个光源的波长呈递减的趋势。

优选地，所述第三组合光源能够发出一种或一种以上波长的离散单色光，并且第一组合光源、第二组合光源、第三组合光源能够发出的离散单色光的波长均不相等。

优选地，所述第三组合光源的出射方向上设有第三准直透镜，所述第三组合光源位于所述第三准直透镜的光心上。

优选地，所述第一入射角度为45度；

和/或，所述第二入射角度为45度。

优选地，所述第三入射角度为45度。

本发明光源中的反射镜主要实现光路折叠，节省空间，特别是在显微多光谱成像的应用中。如果不考虑空间占有，反射镜可以省略，而主光路被拉直。

一种多波段光谱成像方法，包括：

根据待曝光的单色光数量，按照曝光的时序设定检测相机的曝光周期，每个曝光周期中，针对每一种单色光设计对应曝光时段，一个曝光时段对应一种单色光，相邻两个曝光时段之间保留一时间间隔用于数据传输与保存；

在每个曝光时段对应的单色光，单色光在曝光时段的起始点之前被点亮，并持续到曝光时段结束后被熄灭，相邻两种单色光的曝光时间不重叠。

一种显微镜，包括如上所述的成像光源，或者使用如上所述的成像方法。

本发明提供的一种多波段光谱成像光源及成像方法，具有低成本，快速成像的效果，可以实现60帧/秒以上的多波段多光谱成像，满足大部分医学多光谱成像应用的要求。

附图说明

下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

图1是一实施例所述一种多波段光谱成像光源的结构示意图。

图2是一实施例所述组合光源的led(或半导体激光)发光芯片布局结构示意图。

图3是一实施例所述一种多波段光谱成像方法的时序示意图。

图4是又一实施例所述一种多波段光谱成像光源的结构示意图。

具体实施方式

如图1-4所示，本发明实施例提供一种多波段光谱成像光源，包括：

第一组合光源11，至少能够发出第一波长的离散单色光，并且经第一准直镜31准直后以第一入射角度射向反射镜50的镜面；

反射镜50，用于接收所述第一组合光源11的入射光并反射出去，所述第一组合光源11与所述反射镜50之间形成第一光路；

第一半透半反镜片21，设在所述第一组合光源11与所述反射镜50之间的第一光路上，所述第一半透半反镜片21包括相互背离且平行的第一镜面和第二镜面，所述第一组合光源11以第一入射角度射向所述第一半透半反镜片21的第一镜面；

第二组合光源12，至少能够发出第二波长的离散单色光，第二组合光源12设在所述第一光路以外的位置，并且所述第二组合光源12以第二入射角度射向所述第一半透半反镜片21的第二镜面；

其中，所述第一波长与所述第二波长不相等，并且所述第一入射角度在30-60度之间，所述第二入射角度在30-60度之间。

优选地，在所述第一组合光源11的出射方向设有第一准直透镜31，所述第一组合光源11位于所述第一准直透镜31的光心上；

所述第二组合光源12的出射方向上设有第二准直透镜32，所述第二组合光源12位于所述第二准直透镜32的光心上。

当第一组合光源11、第二组合光源12为点光源时，采用准直透镜的方式，对发散的点光源进行准直，准直后的光源再进入光路中。

优选地，所述第一组合光源11和所述第二组合光源12能够发出一种或一种以上波长的离散单色光，并且第一组合光源11、第二组合光源12能够发出的离散单色光的波长不相等。具体地，如图3所示，在第一组合光源11上采用阵列的方式设置多个波长不同的led(或半导体激光)发光芯片，并且多个led发光芯片之间采用并联的方式，并且每个led发光芯片采用独立控制。

优选地，所述第一半透半反镜片为二色性滤光镜片，或者所述第一半透半反镜片为部分透射部分反射的金属膜。其中二色性滤光片(又称分色镜)广泛用于荧光分析中把光源与荧光团的发射光谱分开，可以避免干涉分析的进行。在二色性滤波片中，当长波的荧光被透过而波长较短的激发光被高度反射。

优选地，本发明提供的多波段光谱成像光源，还包括：

第二半透半反镜片22，设在所述第一半透半反镜片21与所述反射镜50之间的光路上，所述第二半透半反镜片22包括相互背离且平行的第三镜面和第四镜面，所述第一组合光源11以第三入射角度射向所述第二半透半反镜片22的第三镜面；

第三组合光源13，至少能够发出第三波长的离散单色光，所述第三组合光源13以第三入射角度射向所述第二半透半反镜片22的第四镜面；

其中，第三波长与所述第一波长、第二波长不相等，所述第三入射角度在30-60度之间。

优选地，所述第一波长、第二波长、第三波长之间具有第一波长<第二波长<第三波长的关系，使三个光源的波长呈递增的趋势；或者所述第一波长、第二波长、第三波长之间具有第一波长>第二波长>第三波长的关系，使三个光源的波长呈递减的趋势。

优选地，所述第三组合光源13能够发出一种或一种以上波长的离散单色光，并且第一组合光源11、第二组合光源12、第三组合光源13能够发出的离散单色光的波长均不相等。具体可参考第一组合光源11和第二组合光源12的实施方式要求。

优选地，所述第三组合光源13的出射方向上设有第三准直透镜33，所述第三组合光源13位于所述第三准直透镜33的光心上。

优选地，所述第一入射角度为45度；

所述第二入射角度为45度。

优选地，所述第三入射角度为45度。

附图1是本发明提出的显微镜照明多光谱光源光路。本实施例的多波段光谱成像光源，使用第一组合光源11、第二组合光源12、第三组合光源13(甚至还可以有第四组合光源、第五组合光源)，它们分别被第一准直镜31、第二准直镜32、第三准直镜33等准直成平行光。第一组合光源11发出的光经第一准直镜31准直后到达第一半透半反镜片21(二色性滤光镜)，第二组合光源12发出的光经第二准直镜32准直后也到达第一半透半反镜片21的另一面，第一半透半反镜片21(二色性滤光镜)选择的原则时能透过第一组合光源11发出的光，反射第二组合光源12发出的光。这样第一组合光源11和第二组合光源12的准直光将到达第二半透半反镜片22(二色性滤光镜)，而第三组合光源13发出的光经光源准直镜3准直后将到达第二半透半反镜片22的另一面，第二半透半反镜片22选择的原则时能透过第一组合光源11、第二组合光源12发出的光，反射第三组合光源13发出的光，这样第一组合光源11、第二组合光源12、第三组合光源13准直的光都能到达反射镜，反射后进入聚光镜照明待成像观察的样品。

多个组合光源安排的一个简单的选择时将第一组合光源11、第二组合光源12、第三组合光源13依次安排成波长递减(增)的方式，这样二色性滤光镜就可以简单选择成长(短)波长通过的二色性滤光镜，截至的波长选择在反射和透过波长的中间即可。

二色性滤光镜可以用部分透过和部分反射的金属膜反射镜代替，但这样光能量会损失较大。

这样的可以安排多于3个的光源，但由于显微镜空间的限制，以及光通过二色性滤光镜光能的损失，光源的数目总是有限的。

为进一步增加成像波段数目，我们在每个组合光源上进行了创新。考虑到led光源发光芯片体积可以很小，远小于传统的卤素灯的体积，我们选择多个单色小体积的发光芯片，将其紧密排列在光源中心的周围，最多可以排列1-9个单色led发光芯片，图3示意了四个led芯片的排列。

这样假设我们用了n个光源，每个光源排列m个单色不同波长的芯片，我们就可以实现mxn个波段的多光谱成像。

本实施例还提供一种多波段光谱成像方法，包括：

根据待曝光的单色光(波段)数量，按照曝光的时序设定检测相机的曝光周期，每个曝光周期中，针对每一种单色光设计对应曝光时段，一个曝光时段对应一种单色光，相邻两个曝光时段之间保留一时间间隔用于数据的传输和保存；

在每个曝光时段对应的单色光，单色光在曝光时段的起始点之前被点亮，并持续到曝光时段结束后被熄灭，相邻两种单色光的曝光时间不重叠。

成像的过程是这样的：

附图3第一行表示相机曝光的时序，高电平表示相机在曝光。第二到四行表示各个led(或半导体激光)点亮的时序，高电平表示led被点亮发光。

以四个led(四波段)为例说明多光谱成像的过程。

led1在相机曝光前被点亮，并持续点亮到相机曝光完成后才熄灭，此时相机曝光采集的图像是单色led1波长的一个光谱图像，随后立即被存储。

在相机第二次曝光前，led2在相机曝光前被点亮，并持续点亮到相机曝光完成后才熄灭，此时相机曝光采集的图像是单色led2波长的一个光谱图像，随后立即被存储。

在相机第三次曝光前，led3在相机曝光前被点亮，并持续点亮到相机曝光完成后才熄灭，此时相机曝光采集的图像是单色led4波长的一个光谱图像，随后立即被存储。

在相机第四次曝光前，led4在相机曝光前被点亮，并持续点亮到相机曝光完成后才熄灭，此时相机曝光采集的图像是单色led4波长的一个光谱图像，随后立即被存储。

四个存储的光谱图像共同形成了被观察样品的四波段光谱成像。

本实施例中，采用所需的多个不同波长的单色led发光器件以及与其相对应的薄膜干涉二色性滤光片组合形成照明光源，通过适当的电子同步控制电路与摄像机采集图像同步依次点亮各个led光源，通过摄像机采集获得不同的波长的图像。

这样我们完成了同一个视野的四个波长图像的采集。

波长数增加只是需要增加曝光和采集图像的次数，在此同步相机和光源是非常重要的。

附图4是本发明具体实施方式之一。

在这里第一组合光源11采用了如蓝(470nm)、绿(530nm)、红(630nm)三色led集成的led，此三色和人眼视锥细胞感光对应，便于实现彩色成像，同时是窄带离散单色光谱，满足朗伯定律，有利于定量分析，同时此led市场有现成产品。第二组合光源12采用了570nm的单色led，细胞福尔根染色的染料在此波长上吸收很强。

因为蓝(470nm)、绿(530nm)、红(630nm)三色中，蓝(470nm)、绿(530nm)波长小于570nm，红(630nm)大于570nm，因此本实施方式采用了半透半反(50％透过，50％反射)而不是二色性滤光镜。尽管损失了50％的光能量，但因为led发光强度很大，仍然能满足实际应用需要。

采用本实施方式，我们实现了470nm、530nm、570nm和630nm的四波段显微多光谱快速成像；借助相关的分析技术，实现了巴氏和福尔根复染条件下的细胞dna倍体分析，满足了同时在一张玻片上实现dna倍体分析和tbs细胞分析的需求。

最后应说明的是：以上所述仅为发明的优选实施例而已，并不用于限制发明，尽管参照前述实施例对发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在发明的保护范围之内。