本发明涉及一种尿蛋白制备方法及尿蛋白质组的检测方法，特别涉及可用于高通量定量深度尿蛋白质组检测的尿蛋白制备方法及尿蛋白质组的检测方法。
背景技术：
：尿液是临床检验中除血液外最常用的体液样本，尿常规中对胆红素、葡萄糖、酮体、蛋白、血细胞等指标的检测被用于各种疾病的诊断或疗效监测。鉴于尿液检测在健康医学方面的重要价值，世界各国科学家一直在利用蛋白质组学技术试图从尿液中找到新的用于疾病诊断、预后判定、疗效监测的蛋白标志物。尿蛋白质组的检测过程包括尿蛋白的制备、在蛋白或肽水平的分离、质谱鉴定。目前常用的尿蛋白制备方法包括以下3种：(1)有机溶剂沉淀法：包括用各种浓度的乙酸、丙酮、乙腈、氯仿、乙醇、甲醇等；(2)多步离心法，如先用1000-17000g离心5-15分钟去除细胞残渣或膜碎片，然后再用200000g离心60-120分钟收集沉淀部分尿蛋白；(3)离心超滤法，在利用常规离心去除尿样中的细胞残渣或膜碎片后，利用不同规格截留分子量的超滤离心管浓缩富集尿蛋白。双向电泳是尿蛋白常用的分离方法，分离后每个蛋白点进行胶内酶切后利用基质辅助激光解离飞行时间质谱(maldi-tof)进行蛋白鉴定。也有人利用一维电泳对富集后的尿蛋白进行分离，然后切成10-30个条带进行胶内酶切，之后利用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)分别对每个条带的酶切产物进行分析。也有人对上述尿蛋白制备方法进行组合使用分成更多组分，然后利用lc-ms/ms进行鉴定。通过这些方法，目前尿蛋白质组的检测深度可达1500-2300种蛋白质。但目前这些用于尿蛋白质组检测的工作流程都存在着样品制备流程繁琐，质谱检测时间过长的缺点。样品制备的每一步都会引入误差及蛋白损失，因此流程繁琐除费时外还会导致定量不准确及可重复性差；根据几个已报道的深度尿蛋白质组研究，为达到1500-2300的蛋白质组检测深度，每个样品需要24-48小时的质谱检测时间。这些低通量的检测方法应用于从尿蛋白质组中寻找新生物标志物时有很大的局限性。因为通量低，在发现阶段所能检测的样品数量很有限，通常对照组和疾病组分别只能包括10例左右样品，这些有限的样品很难覆盖尿蛋白质组固有的较大的生理性波动及个体间差异。因此在有限样品数量的情况下，很难找到能真正反映对照和疾病状态差异的标志性蛋白。这是当前临床尿蛋白质组研究中普遍存在的问题，发现阶段找到的差异蛋白无法通过后面大样本量的验证研究，因此到目前为止还没有新的尿蛋白标志物通过fda认证用于临床。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，为了解决定量深度尿蛋白质组检测的低通量问题，本发明人对基于离心技术的尿蛋白制备方法进行了系统性改进，形成了一种可用于高通量定量深度尿蛋白质组检测的样品制备方法。此外，我们也提出了一种基于硅藻土亲和富集的尿蛋白制备技术也可用于高通量定量深度尿蛋白质组检测。本发明的一个目的是提供一种尿蛋白制备方法，本发明方法提高了尿蛋白质组检测的准确性和重复性，并且可用于高通量定量深度尿蛋白质组检测。本发明一方面，提供了一种尿蛋白制备方法，包括下面步骤：(1)将尿液样品在常温下超速离心一段时间，弃去上清液，保留沉淀；(2)向步骤(1)所述的沉淀中加入适量的重悬缓冲液使沉淀重悬；(3)向步骤(2)所得的重悬液中加入能打开二硫键的还原剂，于37-80℃温度下加热10-60分钟，用于打开尿调素蛋白(uromodulin，umod)与其他蛋白间的二硫键。使用90-100℃的高温加热虽有助于快速打开尿调素与其他蛋白间的二硫键，但同时也破坏了沉淀部分中的膜结构成分，导致其他蛋白的大量丢失；而低温下无法快速有效地打开二硫键。此外，重悬缓冲液中的高浓度蔗糖也会在加热时对膜结构起到保护作用。(4)向步骤(3)所得的溶液中添加清洗缓冲液，然后高速离心一段时间，弃去上清，保留沉淀；此时去除了打开二硫键后在溶液中的尿调素。加入清洗缓冲液的目的是降低蔗糖的浓度使溶液的密度变小，这样可以在后面的离心中回收更多的蛋白成分。(5)用消化缓冲液重新溶解步骤(4)所得的沉淀，之后进行蛋白的溶液内酶解，或用一维电泳(sds-page)进行蛋白分离。所述步骤(3)中，还原可去除样品中绝大部分的尿调素蛋白。umod是尿液中丰度最高的蛋白，如不能有效去除此蛋白，将直接影响lc-ms/ms鉴定结果。定义：重悬缓冲液：包括浓度在10-100mm能提供缓冲范围在ph7.0-8.5的任何缓冲盐溶液(如tris或磷酸盐缓冲液等)以及50-500mm的蔗糖、葡聚糖或海藻糖等能提供合适渗透压的物质；在典型应用中，重悬缓冲液的成分为50mmtris，250mm蔗糖，ph8.5。清洗缓冲液：包括浓度在10-100mm能提供缓冲范围在ph6.5-8.0的任何缓冲盐溶液(如tris或三乙醇胺缓冲液等)以及50-300mm的盐溶液；在典型应用中，清洗缓冲液的成分为10mm三乙醇胺和100mm氯化钠，ph8.5。消化缓冲液：包括浓度在10-100mm能提供缓冲范围在ph8.0-8.5的碳酸氢铵或tris缓冲液，含或不含去污剂(如10-100mm的tris或碳酸氢铵，含或不含0.1-2％的脱氧胆酸钠)。在一些实施方式中，所述步骤(1)中，所述尿液样品的量为100微升(ul)至50毫升(ml)，优选地1ml-10ml；超速离心的离心力为100000-300000g，优选地200000g；所述的常温为4-25℃，典型地20℃；和/或所述时间为20-120分钟，更优选地60-80分钟，最优选75分钟。在一些实施方式中，所述步骤(2)中，所述重悬缓冲液为50mmtris，250mm蔗糖，ph8.5；加入重悬缓冲液后在室温静置约5-60分钟，然后充分吹打重悬沉淀。在一些实施方式中，所述步骤(3)中，所述还原剂为二硫苏糖醇或β巯基乙醇，或者巯基乙酸，或者三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，tcep)。在一些实施方式中，所述步骤(4)中，所述清洗缓冲液为10mm三乙醇胺，100mm氯化钠，ph8.5)，超速离心的条件同上述步骤(1)中的条件。在一些实施方式中，所述步骤(5)中，所述消化缓冲液可用1％十二烷基硫酸钠缓冲液(1％sds，50mmtris，ph8.5)替代进行沉淀的溶解和后续的sds-page电泳。在一些实施方式中，包括下面步骤：(1)100微升(ul)至50毫升(ml)(典型的应用为1ml或10ml)尿样，以100000-300000g(典型为200000g)的离心力在4-25℃(典型为20℃)条件下离心20-120分钟(典型为75分钟)，弃去上清，留沉淀；(2)向离心管中加入30ul-1ml的重悬缓冲液(50mmtris，250mm蔗糖，ph8.5)，在室温静置5-60分钟，用移液器充分吹打重悬沉淀；(3)向其中加入二硫苏糖醇(或其他能打开二硫键的还原剂，如β巯基乙醇等)至终浓度20-200mm，37-90℃加热10-60分钟，此步可去除样品中绝大部分的尿调素蛋白(uromodulin,umod,见图1)；注：umod是尿液中丰度最高的蛋白，如不能有效去除此蛋白，将直接影响lc-ms/ms鉴定结果(见图2及下面表1)。(4)补加清洗缓冲液(10mm三乙醇胺，100mm氯化钠，ph8.5)至200ul-4ml，然后以100000-200000g(典型为200000g)的离心力在4-25℃(典型为20℃)条件下离心20-120分钟(典型为75分钟)，弃去上清，留沉淀；(5)如后续采用溶液内酶解，则跳过此步，按第(6)步进行操作；如后续采用一维电泳(sds-page)进行蛋白分离，用30-60ul的1％十二烷基硫酸钠缓冲液(1％sds，50mmtris，ph8.5)溶解沉淀，取30ul上样进行电泳；(6)用20-200ul的消化缓冲液重溶沉淀，之后进行蛋白的溶液内酶解。本发明还提供了一种富集尿蛋白的方法，包括如下步骤：(1)向尿液中加入适量硅藻土或含硅藻土成分的固体颗粒，摇匀；(2)于37-100℃的温度下加热上述步骤(1)中得到的混合物，然后冷却至常温，例如4-25℃；(3)常温如4-25℃旋转混合，离心，弃上清；(4)加入消化缓冲液，进行富集尿蛋白的溶液内酶切。溶液内酶切样品利用lc-ms/ms进行检测，该方法的检测通量为每天10-15个尿样。所得数据利用前述方法进行数据库搜索、组装及定量。本发明另一方面，提供了一种尿蛋白质组的检测方法，包括尿蛋白的制备、在蛋白或肽水平的分离、质谱鉴定，其特征在于，所述尿蛋白按照前述任一实施方式中所述的方法来制备。在一些实施方式中，所述分离为电泳分离；优选地，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在一些实施方式中，所述分离为蛋白的溶液内酶解；优选地，酶解前用消化缓冲液重溶。在一些实施方式中，所述质谱鉴定为液相色谱-质谱联用鉴定。在一些实施方式中，所述质谱鉴定为液相色谱二级质谱联用鉴定。经上述超速离心法制备的尿蛋白可利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离，之后将胶切成6条带进行胶内酶解，然后合并为2组分利用lc-ms/ms进行检测。利用该方法每天可以完成8个尿样的检测；超速离心法制备的尿蛋白也可以直接溶解于消化缓冲液进行溶液内消化，然后利用lc-ms/ms进行检测，该方法的检测通量为每天10-15个尿样。所得数据用mascot2.3搜索引擎(matrixscience公司)和美国生物技术信息国家中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的人类蛋白质参考序列数据库进行搜索，所得肽片段数据利用本发明人自主开发的软件grouper(或thermofisher公司的proteomediscovererv1.4/2.0/2.1软件)进行蛋白组装及定量。利用这种方法，每个尿样可鉴定1500-2000蛋白。本发明的检测方法，在研发和临床试验阶段，可用本方法寻找尿蛋白或肽中与健康状态评估以及疾病诊断、评估、分期、分型、疗效评价、治疗药物或方案选择、预后评估相关的生物标志物；或收集尿蛋白质组数据用于健康和疾病管理等。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明的尿蛋白制备方法样品制备过程简单，通过一次超速离心法就可实现尿液中蛋白的初步分离；提高了尿蛋白质组检测的准确性和重复性，并且可用于高通量定量深度尿蛋白质组检测。尿蛋白质组检测中，质谱检测时间短。特别是，还原剂存在下，还原步骤(3)中的温度控制，可去除样品中绝大部分的尿调素蛋白(uromodulin,umod,见图1)并尽可能保护了沉淀中的膜结构成分，增加蛋白的回收率(见表2，65℃和95℃加热结果的比较)。附图说明图1显示利用二硫苏糖醇(dtt)及加热的方法去除尿调素蛋白。泳道1：20ml尿液经200kg离心70分钟后，所得沉淀直接溶于1％sds缓冲液，取10μl上样；m：为蛋白分子量markers；泳道2：同一个尿样同样方法所得沉淀经50mmdtt还原后，再次离心所得沉淀溶于60μl的1％sds缓冲液，取30μl上样；图2显示尿蛋白质谱检测结果；图3显示利用本方法检测的尿蛋白质组的定性重复性结果。从5名自愿者收集的16份尿样分为2等份后平行制备并上质谱检测，平行样本间的定性重复性达到90％。图4显示利用本方法检测的尿蛋白质组的定量重复性结果。从5名自愿者收集的16份尿样分为2等份后平行制备并上质谱检测，平行样本间的定量相关性达到90％以上。具体实施方式下面结合实施例对发明作进一步详细的说明，但是无论如何不能解释为是对本发明的限制。实施例1尿蛋白制备方法(1)1ml尿样，以200000g的离心力在20℃条件下离心75分钟，弃去上清，保留沉淀；(2)将沉淀转移至1.5ml离心管，向所述离心管中加入400μl的重悬缓冲液(50mmtris，250mm蔗糖，ph8.5)，在室温静置30分钟，用移液器充分吹打重悬沉淀；(3)向上述重悬沉淀中加入二硫苏糖醇至终浓度大约100mm，于65℃加热30分钟，去除样品中绝大部分的尿调素蛋白(uromodulin,umod,见图1)；(4)补充填加清洗缓冲液(10mm三乙醇胺，100mm氯化钠，ph7.4)至4ml，然后以200000g的离心力在20℃条件下离心75分钟，弃去上清，留沉淀；(5)用30μl的消化缓冲液(如10mm的tris或碳酸氢铵，含或不含0.1-2％的脱氧胆酸钠)重溶沉淀，之后进行蛋白的溶液内酶解。下表表示了鉴定的蛋白数，并且给出了与不去除umod情况下的对比表1实施例2尿蛋白制备方法(1)10ml尿样，以100000的离心力在4℃条件下离心20分钟，弃去上清，留沉淀；(2)将上述沉淀转移至离心管，向离心管中加入60ul的重悬缓冲液(50mmtris，250mm蔗糖，ph8.5)，在室温静置10分钟，用移液器充分吹打重悬沉淀；(3)向上述重悬沉淀中加入二硫苏糖醇至终浓度50mm，80℃加热10分钟，去除样品中绝大部分的尿调素蛋白；(4)补充填加清洗缓冲液(10mm三乙醇胺，100mm氯化钠，ph7.4)至400ul，然后以100000的离心力在4条件下离心20分钟，弃去上清，留沉淀；(5)采用一维电泳(sds-page)进行蛋白分离，用30ul的1％十二烷基硫酸钠缓冲液(1％sds，50mmtris，ph8.5)溶解沉淀，取30ul上样进行电泳分离。实施例3一种富集尿蛋白的方法，包括如下步骤：(1)向1毫升尿液中加入10毫克硅藻土，摇匀；(2)37-100℃之间某一温度加热5分钟，冷却至常温；(3)常温旋转混合30分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清；(4)加30-100微升的消化缓冲液，进行富集尿蛋白的溶液内酶切。实施例4一种尿蛋白质组的检测方法尿蛋白的制备方法同实施例1，所得尿蛋白沉淀用30μl消化缓冲液重溶后，经95℃加热3分钟，冷却至室温后，加入200ng胰酶混匀，37℃孵育4小时，加入30μl的1％甲酸终止反应，之后加入200μl乙腈萃取肽样品真空抽干。消化后所得肽样品用20μl的上样缓冲液(5％甲醇，0.1％甲酸)溶解，然后取5μl上样，利用thermoscientific的纳升级液相色谱串联高分辨质谱系统(nlc-easy1000-qexactive-hf)进行数据采集。纳升液相上样柱规格如下：内径100微米、填料为dr.maischgmbh公司的c18填料(颗粒直径为3微米、颗粒孔径为120纳米)、填料柱床长度为2厘米；纳升液相分离柱规格如下：内径150微米、填料为dr.maischgmbh公司的c18填料(颗粒直径为1.9微米、颗粒孔径为120纳米)、填料柱床长度为12厘米。流动相a为0.1％甲酸；流动相b为乙腈及0.1％甲酸。肽分离洗脱梯度如下：0-69分钟为5％-31％流动相b，70-75分钟为95％流动相b。质谱数据以datadependentacquisition方式进行采集，qexactive-hf所用参数如下：一级质谱分辨率为12万，扫描范围为300-1400m/z，agc为3e+6，最大离子注入时间为80毫秒；二级质谱根据一级质谱中肽片段的信号强度由高向低依次分离碎裂(以top20模式)，二级质谱的分辨率为1.5万，二级质谱母离子质量分离窗口为3m/z，agc为2e+4，离子最大注入时间为20ms，hcd相对碰撞能量为27％，数据采集时采用12s动态排除。所得质谱数据利用内嵌mascot2.3搜索引擎的proteomediscovererv2.0软件进行肽序列数据库搜索和蛋白组装定量分析。在“mascot”模板中对数据库搜索的各项参数进行设定：在“proteindatabase”中选取人蛋白质序列数据库；在”enzymename”中选取trypsin；在“maximummissedcleavage”中填入2(代表允许的最大漏切位点数为2)；在”instrument”中选default；在”taxonomy”中选allentries；在“precursormasstolerance”中填20ppm；在”precursormasstolerance”中填50mmu；在“useaverageprecursormass”中选false；在”fromquanmethod”中选none；在“showallmodifications”中选false；在”dynamicmodification“中除选取通常存在的acetyl(proteinn-term)、destreak(c)、oxidation(m)、carbamidomethyl(c)等继续数据库搜索和定量分析。所得结果见表1。表1续实验条件蛋白数肽数肽谱匹配数二级质谱数不去除umod160374881381759887还原去除umod2094119731965065466注：肽片段进入质谱后要通过二级质谱打碎产生相应的二级质谱谱图，二级质谱谱图经数据库搜索产生肽谱匹配(即二级质谱谱图能与数据库中的肽片段的理论二级质谱谱图匹配)；并不是每一个二级质谱谱图都有足够高的质量能匹配数据库中肽片段的理论谱图；一个肽片段在其色谱峰宽的时间内可能被采集多个二级质谱谱图，因此会有多个二级质谱谱图匹配一个肽片段的情况；对肽谱匹配去冗余后，就会得到该样品中的肽数；根据蛋白质的氨基酸序列和肽的氨基酸序列，能将与一个蛋白对应的肽进行组装，从而知道样品中有该蛋白的存在，最后得知样品中的蛋白数。实施例5比较还原温度对实验结果的影响分别用1ml尿液进行两个平行对照实验比较还原温度对尿蛋白质组检测结果的影响。尿蛋白的制备步骤同实施例1，在步骤3中加入二硫苏糖醇后，两个样品分别用65℃或95℃加热30分钟，之后完全按照实施例1的方法进行。之后的溶液内消化、肽分离、质谱分析及数据分析同实施例4，对比结果见表2，各实验的详细结果见表2。表2实验条件蛋白数肽数肽谱匹配数二级质谱数95℃还原16658147125045657265℃还原180591571395257475表2续65℃时的检测结果明显优于95℃时的检测结果。umod是尿液中丰度最高的蛋白，如不能有效去除此蛋白，将直接影响lc-ms/ms鉴定结果(见图1及上面表1)。实验例1发明人利用实施例1和4中的方法分别检测40例健康人的尿蛋白质组和40例胃癌病人的尿蛋白质组，对两组尿蛋白质组的结果进行了比较分析，筛选出了50个显著差异表达的蛋白，作为候选标志物进行后续的大样本量验证分析。表3表3为筛选出的50个显著差异表达的蛋白，即标记性蛋白。这些蛋白后续可以用于多种科学研究分析，例如从它们中选取可能的胃癌早期诊断候选标志物进行大规模的临床实验验证研究等。实验例2稳定性和可重复性为了验证上述方法的稳定性和可重复性，我们将来自5个人的16份尿样，分成两等份，利用超速离心、sds-page分离、胶内酶解及lc-ms/ms进行平行制备和检测，所得数据利用前述方法进行数据库搜索、组装及定量。制备(1)20毫升(ml)尿样，以200000g的离心力在20℃条件下离心70分钟，弃去上清，留沉淀；(2)向离心管中加入400ul的重悬缓冲液(50mmtris，250mm蔗糖，ph8.5)，在室温静置10分钟，用移液器充分吹打重悬沉淀(如起始为10ml尿样，可转移至1.5ml离心管)；(3)向其中加入二硫苏糖醇至终浓度50mm，65℃加热30分钟，此步可去除样品中绝大部分的尿调素蛋白(uromodulin,umod)；(4)补加清洗缓冲液(10mm三乙醇胺，100mm氯化钠，ph8.5)至4ml，然后以200000g的离心力在20℃条件下离心40分钟，弃去上清，留沉淀；(5)用60ul的1％十二烷基硫酸钠缓冲液(1％sds，50mmtris，ph8.5)溶解沉淀，取30ul上样进行电泳；经上述超速离心法制备的尿蛋白可利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离，之后将胶切成6条带进行胶内酶解，然后合并为2组分利用lc-ms/ms进行检测。所得数据用mascot2.3搜索引擎(matrixscience公司)和美国生物技术信息国家中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)的人类蛋白质参考序列数据库进行搜索，所得肽片段数据利用我们自主开发的软件grouper进行蛋白组装及定量。两重复之间鉴定到蛋白的情况见图3，每个尿样鉴定到1200-1600种不同的蛋白，其中90％的蛋白可被两重复共同鉴定到；两重复之间共同鉴定到蛋白的定量重复性见图4，相同蛋白在两重复间的定量相关系数的平方为0.93-0.96。这些结果表明本发明的方法具有非常优秀的稳定性和可重复性。以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页12