本发明属于化学品急性毒性检测领域，尤其涉及一种化学品毒性藻红外测试的三指标评价方法。
背景技术：
藻类细胞具有光合磷酸化和氧化磷酸化的两套能量代谢系统，毒物作用前后藻代谢能量会产生微量变化，这种微能量变化可被红外测温仪测试，对测试藻温进行处理便能分析藻对毒物的响应。该技术具有快速、简便、价廉、可现场测试等特点，然而，该技术一直存在4个问题：一是未考虑红外测温仪测试的末位藻温波动性，每次每个测试杯只测1个藻温，与波动藻温平均值的偏差较大；二是未考虑到两个测试杯的藻温之差伴随整个测温过程，在毒性测试藻响应温差时未减去；三是用加药组和对照组只能得到1种藻温差，不能藻温差比较分析；四是只用了藻响应温差这一个指标分析藻对毒物的响应，效果较差。这4个问题的存在，使藻红外测试技术测试毒物毒性的性能较低。
目前，国内外关于急性毒性的单细胞微生物测试法改进的研究报道主要有发光细菌生物毒性测试方法的改进、发光细菌毒性测试条件的优化、发光细菌急性毒性测试方法的优化、水质急性毒性发光细菌测试法的改进、对测试水质发光细菌的菌种进行改进、Menz J等对发光细菌法进行改进。关于藻红外测试研究有敏感藻的确定方法、重金属急性毒性藻红外测试、农药急性毒性藻红外测试、有机毒害物急性毒性藻红外测试、急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法、藻红外测试多元有机毒物急性毒性的初步分析、急性毒性藻红外测试中联合作用评价法的重现性，有关化学品急性毒性藻红外测试技术改进方法的研究尚未见报道。
技术实现要素：
本发明针对现有藻红外测试方法测试毒物毒性性能较低的问题，提供一种化学品毒性藻红外测试的三指标评价方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种化学品毒性藻红外测试的三指标评价方法，包括以下步骤：
(1)藻响应测试
选择滇池铜绿微囊藻为供试藻，其藻密度≥3.16×109个/L；
藻温测试过程：空白组3重复，对照组3重复，加药组3重复，在每个测试杯中分别加入5mL藻液，加完后测试每个测试杯的藻温；
然后进行以下加药测试：①蒸馏水毒性测试时，用滴液管分别滴加蒸馏水0.05mL于加药组和对照组的测试杯中，待藻温稳定时测试每个测试杯的藻温；②待测药品的毒性测试时，用滴液管滴加0.05mL待测药液于加药组的测试杯中，用滴液管滴加蒸馏水0.05mL于对照组的测试杯中，滴加完后测试每个测试杯的藻温；
(2)数据分析
藻响应温差计算方法为：ΔT＝∣ΔTj∣―∣ΔTd∣，ΔT＞0
加药组藻温差计算方法为：ΔTj＝(Tj-ti-Tj-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)
对照组藻温差计算方法为：ΔTd＝(Td-ti-Td-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)
式中：Tj-ti—加药后加药组的藻温；Tj-t0—加药前加药组的藻温；Tk-ti—加药后空白组的藻温；Tk-t0—加药前空白组的藻温；Td-ti—加水后对照组的藻温；Td-t0—加水前对照组的藻温；j—加药组，滴加药液；d—对照组，滴加蒸馏水；k—空白组，不滴加药液或蒸馏水；ti—测温遍数，i＝0,为加药前的测温；i＝1,2…n,为加药后第1,2…n遍测温；
(3)三指标法评价藻对药液的响应
当藻温差数据同时满足下面三个指标时，表示藻对药液有响应：
指标①—最大藻温差比较值，︱ΔTj-max︱＞︱ΔTd-max︱；
指标②—平均藻温差比较值，∣Δ〒j∣＞∣Δ〒d∣；
指标③—藻响应率(ψ)，∣ΔTj∣＞∣ΔTd∣的出现次数≥6；
其中：ΔTj-max—加药组的最大藻温差，ΔTd-max—对照组的最大藻温差，Δ〒j—加药组的平均藻温差，Δ〒d—对照组的平均藻温差。
作为优选，步骤(1)中测藻温时，每次每个测试杯连测3个藻温，3个藻温的平均值即为测试杯的藻温。
作为优选，步骤(1)中加药前测温1遍，加药后测温10遍，其中，三个重复测温完成即为测温1遍，前一遍测温完成后，按相同的测温顺序进行下一遍测温。
作为优选，三指标法评价藻响应重金属的灵敏度为0.001～0.1mg/L。
作为优选，所述待测药品为重金属、农药、有机药品、抗生素。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用三指标法(即最大藻温差比较值、平均藻温差比较值、藻响应率的分析法)分析藻对毒物的响应，降低了分析结果的偶然性，能够控制假结果出现率为20％，由其评价藻响应重金属的灵敏度为0.001～0.1mg/L，由其得到的测试结果的平均重现率为86.8～100％、重现性出现率为100％，具有准确性高，重复性好，灵敏度高的特点；
2、本发明每次每个测试杯连测3个藻温，用其平均值避免了仪器测试藻温的波动性造成的偏差，用空白组、对照组、加药组三个测试组，得到两种藻温差，避免了现有测试技术只能得到一种藻温差，不能进行藻温差比较分析的问题。
附图说明
图1为实施例1测试杯的布局图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明所采用的原料和设备若非特指，均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
本实施例以重金属为例对藻红外测试的三指标评价方法进行详细说明。
1、试验材料
藻种：滇池铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa in Dianchi Lake in china)及其培养基配方由中国科学院武汉水生生物研究所提供。该藻具有春化作用，为滇池水华藻种，生长快、饱和密度高，可保证实验所需的藻密度和藻用量。
药品：ZnCl2，Pb(NO3)3，CuSO4，FeCl3·6H2O，MnSO4.H2O，CrCl3·6H2O，HgSO4，AlCl3·6H2O，Cd(NO3)3·4H2O。
上述药液的配制要求为：取1滴药液(约0.05mL)加入5mL藻液中，使得加入藻液中的重金属浓度等于《生活饮用水卫生标准》GB5749-2006对应毒理指标重金属浓度(见各重金属毒性分析表)。
其中，藻液中重金属浓度计算方法为：
N＝M÷(1000×D)×(重金属原子量÷药品分子量)×1000ml÷V
式中：N—藻液中药品浓度，M—药液浓度，D—移液管滴定1ml药液的滴数，V—测试杯中藻液毫升数。
仪器：红外测温仪，型号ST60，灵敏度0.1℃。
测试杯：直径4cm、高3cm、厚0.1～0.2cm的透明塑料容器。
2、试验方法
2.1、藻温测试方法
藻温测试在室内条件下进行，采用散射日光或灯光采光。实验的藻液用量为5ml/杯，藻密度≥3.16×109个/L；测试杯加藻液前，藻液充分摇均；当培养时藻增长率≤0时，藻液不再用于实验；滴加药液前，药液充分摇匀。
本实施例测试杯布局如图1所示，在每个测试杯中加入5mL藻液，加完后进行加药前测温记录，每次每杯连测3个藻温。然后，滴加药液，蒸馏水毒性测试时，用滴液管分别滴加蒸馏水1滴(约0.05ml)于加药组、对照组的测试杯中，重金属毒性测试时，用滴液管滴加药液1滴与加药组的测试杯中，用滴液管滴加蒸馏水1滴于对照组的测试杯中，立即进行加药后的测温记录，每次每杯连测3个藻温。测温时，红外测温仪头部距离藻液正上方10～15cm，指示红色光点对准藻液面中心时测温。每杯每次连测3个藻温，用于计算平均值。测温顺序：按如图1所示的布局从上到下，从左到右。测温遍数：三个重复测温完时即为测温1遍。药液滴入藻液后到藻产生响应有一个过程，藻对不同药液的响应过程不同，加药前测温1遍，加药后测温10遍。前一遍测温完后接着下一遍测温。
本实施例中藻温的计算公式为：
T＝(Tn1+Tn2+Tn3)÷3 (1)
Tni＝(Tb1+Tb2+Tb3)÷3 (2)
Tbi＝(T1+T2+T3)÷3 (3)
(1)、(2)、(3)中：T—每遍测温的处理藻温；Tn1、Tn2、Tn3—分别为重复一、二、三的平均藻温；Tni—重复组的平均藻温，i＝1,2,3；Tbi—每个测试杯的平均藻温,i＝1,2,3；Tb1、Tb2、Tb3—分别为空白、对照、加药的测试杯的平均藻温；Ti—每个测试杯连续测试的藻温(3个藻温)，i＝1,2,3。
2.2、藻温差计算方法
藻响应温差计算：藻响应温差是指加药组藻温差的绝对值与对照组藻温差的绝对值的差值，该差值大于零，其计算方法为：
ΔT＝∣ΔTj∣―∣ΔTd∣，ΔT＞0
加药组藻温差计算：ΔTj＝(Tj-ti-Tj-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)
对照组藻温差计算：ΔTd＝(Td-ti-Td-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)
式中：Tj-ti—加药后加药组的藻温；Tj-t0—加药前加药组的藻温；Tk-ti—加药后空白组的藻温；Tk-t0—加药前空白组的藻温；Td-ti—加水后对照组的藻温；Td-t0—加水前对照组的藻温；j—加药组，滴加药液；d—对照组，滴加蒸馏水；k—空白组，不滴加药液或蒸馏水；ti—测温遍数，i＝0,为加药前的测温；i＝1,2…n,为加药后第1,2…n遍测温。
3、藻对药液响应的三指标评价法
当藻温差数据同时满足下面三个指标时，表示藻对药液有响应：
指标①—最大藻温差比较值，︱ΔTj-max︱＞︱ΔTd-max︱；
指标②—平均藻温差比较值，∣Δ〒j∣＞∣Δ〒d∣；
指标③—藻响应率(ψ)，∣ΔTj∣＞∣ΔTd∣的出现次数≥6；
其中：ΔTj-max—加药组的最大藻温差，ΔTd-max—对照组的最大藻温差，Δ〒j—加药组的平均藻温差，Δ〒d—对照组的平均藻温差。
4、结果与讨论
分析三指标法的评价效果是利用水平比较法和垂直比较分析法，水平比较分析法是指不同指标法评价同一种药液浓度的藻温差的比较方法，用来分析控制假结果出现率，如蒸馏水毒性测试实验。垂直比较分析法是指不同指标法评价不同浓度药液的藻温差的比较方法，用来分析不同评价法对藻响应药液的灵敏度，如重金属毒性测试实验。
评价法的控制假结果出现率与灵敏度的关系是正相关关系，即控制假结果出现率的效果好，则评价的灵敏度就高(见4.2.1c)。这是控制假结果出现率是检验技术可行性的唯一标准的原因，也是控制测试结果质量的原因。
4.1、蒸馏水毒性测试试验
检验的理论：在10次蒸馏水毒性测试中，10个测试结果为藻无响应，可能三指标法门槛过高，实测时一些有毒药液毒性可能不能被测出；藻有响应的测试结果占多数，可能三指标法门槛过低，实测时一些无毒药液可能被测出有毒性；藻无响应的测试结果占大多数，表明藻有响应(假结果)出现率得到控制，这样的三指标法才能评价藻温差。因此，能否控制假结果出现率，是检验三指标法的唯一标准。
4.1.1、不同藻响应率对三指标法影响的分析结果
由表1可知，连测3个藻温的三指标法的藻响应率为60％、50％、70％、80％时，藻无响应结果(真结果)出现率分别是80％、60％、80％、100％，当藻响应率达到60％时，藻无响应结果(真结果)的出现率达到80％，藻无响应结果(真结果)的出现率已足够高，因此三指标法中设计的藻响应率60％是合理的。
表1三指标法中藻响应率与测试分析结果
4.1.2、蒸馏水毒性的不同指标分析结果
由表2可知，连测3个藻温的不同指标法评价的真结果重现率：三指标法为80％、①指标法为30％、②指标法为20％、①②指标法为50％，表明三指标法中真结果的出现率为80％，远远高于单指标法，可把假结果出现率控制在20％，能够有效的控制假结果出现率。
表2不同指标法的评价结果
4.1.3、蒸馏水毒性的不同藻温数的三指标法分析结果
由表3可知，连测3个藻温的三指标法评价的真结果出现率为80％，即假结果出现率为20％，测试1个藻温的三指标法评价的真结果出现率为50％，即假结果出现率为50％，表明连测3个藻温的三指标法真结果出现率较高，相对于测试1次藻温的三指标法，能够有效控制假结果出现率。
表3 两种藻温数的三指标法评价结果
由上述蒸馏水毒性测试试验，分析表1、2和3可知，每次每杯测试3个藻温的三指标法藻无响应结果(真结果)的出现率可达到80％，可有效控制“假结果”的出现率。
4.2、重金属毒性测试试验
4.2.1、不同指标法评价的分析结果
a、毒物的生物毒性与总浓度：由表4可知，毒理指标浓度的5种重金属单独存在时，藻对其无响应，而它们以4种不同形式共存时，藻对其产生响应，这主要是共存的浓度高于非共存的浓度，这符合混合毒物的生物毒性与总浓度正相关的情况。
b、三指标法评价共存重金属毒性：由表4可知，不同指标法的评价效果用平均重现率(％)/重现性出现率(％)分析的结果是，测试3个藻温的所有评价法都为100/100，而测试1个藻温的三指标法为67/100，表明在共存重金属浓度(实验的高浓度0.066～0.156mg/L)时，所有评价方法都可藻对药液评价的响应，但测试3个藻温的三指标法优于测试1个藻温的三指标法。
c、不同指标法评价共存重金属毒性：由表4可知，不同指标法的评价效果用平均重现率(％)/重现性出现率(％)分析的结果是，测试3个藻温中的三指标法为100/100、双指标法为0/13.4、单指标法为0/0和0/13.4，从中可以看出，双指标法和单指标法评价得到的无响应结果没有重现性，因为它们不能控制假结果出现率(见4.1.2)，假结果大量出现；相反，三指标法能够控制假结果出现率；分析说明，控制假结果出现率对技术非常重要。平均重现率(％)/重现性出现率(％)比较是：测试3个藻温中的三指标法为100/100，测试1个藻温的三指标法为81.2/100，说明后者评价结果的重现性较低，是因为后者控制假结果重现率低于前者(见4.1.3)，导致评价效果不如前者。分析可知，在单一重金属浓度低浓度(实验的低浓度0.001～0.1mg/L)时，测试3个藻温的三指标法评价效果最好。
由上述分析可知，测试3个藻温的三指标法能够评价藻对实验的高低浓度药液的响应，即能够评价的药液浓度范围更大，评价的灵敏度高，可达0.001～0.1mg/L。
表4单一、共存重金属毒性的不同指标法评价结果
注：重现率＝相同结果数÷总结果数×100％，重现性出现率＝重复性结果数÷总结果数×100％。
4.2.2、共存重金属毒性三指标法评价的分析结果
a、评价指标的分析：从测试的3个藻温的三指标法评价中评价结果与各指标的关系(表5-1)可知，测试数据在指标①、指标②的分析值大于0，而指标③的分析值大于或等于60％，表明藻对共存重金属的响应通过了三指标的评价，但测试结果有待重现性分析。
表5-1 共存重金属毒性三指标法的评价结果
b、评价结果的重现性分析：由表5-2可知，藻对5种不同共存重金属的有响应结果“+”都有重复性，表明有重现性的测试结果可靠。由表5-2还可知，共存重金属数(元数)的测试结果重现率是：2元、3元共存的为67％，低于两个4元共存、一个5元共存的100％，平均为86.8％，表明测试3个藻温的三指标法的灵敏度好。
表5-2 三指标法评价结果的重现性分析
4.3、重现性试验分析
测试结果的可靠性需要重现性实验分析，当3次实验有2次测试结果相同，测试结果具有重现性，有重现性的测试结果才是可靠的测试结果。在重金属毒性测试实验结果中，测试3个藻温的三指标法评价不同藻温差的测试结果都有重现性，其平均重现率为86.8％(表5-2)、100％(表4)，重现性出现率为100％(表4，表5-2)，表明改进后的技术具有很好的稳定性、具有重现性的测试结果可靠。在测试急性毒性时，重现性分析不可或缺。
4.4、总结
测试3个藻温的三指标法能够很好地控制假结果出现率，表明该三指标法能够控制测试结果的质量。为使测试结果可靠，重现性实验也是测试结果的重要质量保证。测试3个藻温的三指标法能够控制假结果出现率为20％，由其评价藻响应重金属的灵敏度为0.001～0.1mg/L，由其得到的测试结果的平均重现率为86.8～100％、重现性出现率为100％。由此可知，测试3个藻温的三指标法具有准确性高，重复性好，灵敏度高的特点。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。