一种ASE‐HPLC法测定半枝莲中野黄芩苷含量的方法与流程

本发明属于化学检测领域，尤其是一种ase‐hplc法测定半枝莲中野黄芩苷含量的方法。

背景技术：

半枝莲为唇形科植物半枝莲scutellariabarbatad.don的干燥全草，味辛、苦，寒。归肺、肝、肾经。清热解毒，化瘀利尿。可用于疔疮肿毒，咽喉肿痛，跌扑伤痛，水肿、黄疸，蛇虫咬伤。临床多用于治疗肝癌、胃癌、肺癌等疾病，其主要有效成分是黄酮类化合物。野黄芩苷是半枝莲中一种含量较高的活性物质，《中国药典》(2015年版一部)以野黄芩苷含量作为其质量评价的重要指标，具有降低脑血管阻力，改善脑血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集的作用，现代药理研究表明野黄芩苷对肿瘤细胞、肝癌细胞增殖及侵袭能力有明显的抑制作用。目前，半枝莲中野黄芩苷的提取方法有醇提回流法、超临界萃取法、索氏提取法、超声提取、大孔树脂纯化法等，测定方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、但上述方法前处理提取时间长、测定步骤繁琐。与传统方法相比，ase突出的优点是缩短提取时间，减少溶剂消耗，提高萃取效率。

本发明采用ase-hplc法测定半枝莲中野黄芩苷的含量，操作简便、快速、结果准确。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明旨在提供一种更简便、快捷控制半枝莲药材及其配方颗粒的质量的方法，该方法采用ase‐hplc法测定半枝莲中野黄芩苷的含量。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase‐hplc法测定半枝莲中野黄芩苷含量的方法，依次包括下述步骤：

步骤1：采用ase萃取粉碎后的半枝莲样品，其中ase萃取方法包括先用石油醚萃取，然后再用甲醇萃取，收集甲醇萃取液；

步骤2：采用hplc法测定甲醇萃取液中也黄芩苷的含量。

进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：

步骤s1：将半枝莲样品粉碎，过三号筛，取过筛后的粉末1g；

步骤s2：与1g的硅藻土混合，装于放有纤维滤膜的10mlase萃取池中，加硅藻土至与池口平行，用石油醚萃取；

步骤s3：将石油醚萃取液舍弃，加入甲醇溶液对药渣进行二次萃取；

步骤s4：收集萃取液，并加甲醇溶液定容至100ml，过滤，得甲醇萃取液。

进一步的，步骤s2所述的萃取，参数如下：萃取温度为80℃；萃取时间为5min；萃取次数为1次；冲洗体积为100％；吹扫时间为120s。

进一步的，步骤s3所述的萃取，参数如下：萃取温度为120℃；萃取时间为8min；萃取次数为3次；冲洗体积为60％；吹扫时间为60s。

进一步的，步骤2所述的hplc法的检测参数为：色谱柱为thermosyncronisc18；流动相为甲醇-醋酸-水；流速为0.3ml/min；检测波长为335nm；柱温为40℃；进样量为5μl。

进一步的，所述的色谱柱的规格为3mm×100mm，3μm。

进一步的，所述的流动相甲醇‐醋酸‐水的体积比为30:66:4。

本发明与传统方法相比，具有下述优势：

本发明与中国药典2015年版一部半枝莲药材项下的样品前处理程序比较，药典方法较繁琐、费时，仅样品提取就需要6‐7小时，花费石油醚与甲醇225ml；而本发明药材提取花费13分钟，石油醚与甲醇110ml。

本发明可准确、简便、快捷地对半枝莲中野黄芩苷进行含量测定。

附图说明

图1为提取温度的试验结果图；

图2为提取时间的试验结果图；

图3为循环次数的试验结果图；

图4为野黄芩苷线性图。

具体实施方法

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

1仪器与试药

ase350型快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)；u3000高效液相色谱仪(美国thermofisher公司)，配紫外检测器，四元梯度泵，自动进样器；xa205du型十万分之一电子天平(瑞士mettler-toledo公司)；elgapurelabclassicuvf净化系统。

野黄芩苷(批号：110824-201207，来源：中国食品药品检定研究院)；

甲醇为色谱纯；

石油醚(60～90℃)；

冰醋酸为分析纯；

超纯水(实验室自制)；

0.45μm微孔滤膜(美国，aglient公司)。

样品：半枝莲药材(产地湖南，批号1511024；产地湖北，批号150523；产地湖南，批号151001；产地四川，批号：16012017)，均购于梧州或玉林药材市场，经广西梧州食品药品检验所副主任中药师黄蘅鉴定为为唇形科植物半枝莲scutellariabarbatad.don的干燥全草。

2实验方法

2.1色谱条件

色谱柱：thermo-syncronisc18(3mm×100mm，3μm)；

流动相：甲醇-醋酸-水(30:66:4)；

流速：0.3ml/min；

检测波长：335nm；

柱温：40℃；

进样量：5μl。

2.2对照品溶液的制备

取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含80μg的溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备

分别精密称取不同批号的半枝莲粉末(过三号筛)约1g，与约1g硅藻土混合均匀，移入到预先放好纤维滤膜的ase10ml萃取池中再加入适量硅藻土填满萃池，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖，放入快速萃取仪中进行萃取。先用石油醚对样品进行除酯(80℃，5min，循环1次，冲洗体积100％，吹扫时间为120s)，以甲醇为提取溶剂(120℃，8min，循环3次，冲洗体积为60％；吹扫时间为60s)萃取结束后，把萃取液转移转移至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4系统适用性试验

精密量取“2.2”、“2.3”项下对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱。

在该色谱条件下，各成分均能有效分离，分离度＞1.5。

结果表明，其他成分测定无干扰。

2.5正交试验

在上述单因素试验中已选出了最优结果，为消除各因素之间的相互影响，采用l9(3³)正交试验对半枝莲中的野黄芩苷提取条件进行优化，以正交试验结果来确定与药典方法提取结果匹配的最优提取工艺条件。正交实验极差分析结果见表1。由表1可知，影响半枝莲中的野黄芩苷提取效果的各因素主次关系为：提取温度>提取时间>循环次数。结合各单因素试验结果，得出与药典方法提取结果相匹配的最优提取工艺组合为：甲醇作为提取溶剂，提取温度为120℃，提取8min，循环3次。

表1

2.5.1提取温度的选择

精密称取半枝莲样品1g，加入等量硅藻土混合，装于10ml萃取池，用硅藻土填满萃取池。以甲醇为提取溶剂，分别在80℃、100℃、120℃，5min，提取1次，再按“2.1”色谱条件进行测定分析。

结果：温度为120℃时，野黄芩苷的提取率最高，试验选择最优提取温度为120℃(详见图1)。

2.5.2提取时间的选择

精密称取半枝莲样品1g，加入等量硅藻土混合，装于10ml萃取池，用硅藻土填满萃取池。120℃下分别萃取5、8、10min，提取1次，再按“2.1”色谱条件进行测定分析。

结果：随着时间的增加提取量也在增加，在提取时间为8min之后，随着时间的增加野黄芩苷的提取量增加不大，所以为了节省时间提高工作效率，本次试验选择的最优提取时间定为8min(详见图2)。

2.5.3循环次数的选择

精密称取半枝莲样品1g，加入等量硅藻土混合，装于10ml萃取池，用硅藻土填满萃取池。在120℃下提取8min，循环提取3次，每次独立收集提取液，再按“2.1”色谱条件进行测定分析。第3次提取野黄芩苷的量是3次提取总量的10.3％，所以循环2次提取是不够完全的。

结果：本实验选择最优循环次数为3次(详见图3)。

2.6标准曲线的绘制

取野黄芩苷对照品溶液(0.06687mg/ml),分别精密吸取该溶液0.1μl、0.2μl、0.5μl、0.8μl、1μl进入hplc测定，并依照上述方法测定。结果详见表2。

以浓度(ng)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝11.6990x-29.9160，r²＝0.9996，在6.687～66.87ng围内呈良好的线性关系。详见图4。

表2

2.7重复性试验

取相同批号(16012107)的样品1g，共9份，精密称定，按ase法提取供试品溶液，进样量为1μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中野黄芩苷的含量见表，rsd为0.9％。结果详见表3。

表3

2.8精密度和稳定性试验

取野黄芩苷对照品溶液(0.06687mg/ml)，连续进样6次，记录峰面积，峰面积rsd为1.8％，表明仪器精密度良好。

取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0，1，3，6，12h依法测定。

结果野黄芩苷峰面积的rsd为0.8％，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.9样品含量测定

结果详见表4：

表4

3.结论

半枝莲中野黄芩苷的提取按药典方法操作耗时长且步骤繁琐，受客观因素影响较多导致重复性较差；采用快速溶剂萃取法提取野黄芩苷时间短，提取效率高，并且操作方便可自动化控制。

结果表明快速溶剂萃取法的提取结果与药典提取方法匹配度较高，且所得数据重现性好。

根据试验优化的最终提取条件：用石油醚对样品进行除酯(80℃，5min，循环1次，冲洗体积100％)后，以甲醇为提取溶剂，在120℃，8min，循环3次。

本发明为半枝莲中野黄芩苷的含量测定提供一种可选择的高效率提取方法。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。