本发明涉及一种辅助诊断重症继发性肺结核的蛋白标志物。
背景技术：
结核病目前仍然是全世界关注的致死性传染病之一。若发展为重症继发性肺结核，则住院时间长，住院费高，病死率增加，消耗大量的医疗资源。继发性肺结核患者病变进展、加重、死亡的机制较为复杂，涉及病原学、分子生物学、免疫调控、治疗用药、基础疾病、营养状况、社会经济等多种机制。尽管近年来，对结核病发病机制的研究取得很大进展，但其进一步加重的病理生理机制、影响其发生、发展及预后的因素或机制仍不清晰。目前缺乏早期预警继发性肺结核病变进展、加重的蛋白标志物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种辅助诊断重症继发性肺结核的蛋白标志物。
本发明提供了用于检测SOD1蛋白的产品、用于检测S100A9蛋白的产品、用于检测ORM2蛋白的产品和用于检测IL1F6蛋白的产品在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测SOD1蛋白的产品、用于检测S100A9蛋白的产品、用于检测ORM2蛋白的产品、用于检测IL1F6蛋白的产品和记载有诊断方法I的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
所述诊断方法I为：检测待测者外周血血浆中SOD1蛋白的浓度、S100A9蛋白的浓度、ORM2蛋白的浓度和IL1F6蛋白的浓度，然后按照如下标准进行诊断：
如果ORM2蛋白的浓度＞841.42mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1蛋白的浓度≤418.91mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1＞418.91mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6≤4.67ng/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6＞4.67ng/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1＞347.68mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者。
本发明还保护记载有所述诊断方法I的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于辅助诊断继发性肺结核的系统，包括用于检测SOD1蛋白的产品、用于检测S100A9蛋白的产品、用于检测ORM2蛋白的产品、用于检测IL1F6蛋白的产品和计算机可读载体；所述计算机可读载体中记载有如下程序，当该计算机可读载体被处理器执行时，实现以下步骤：
判读检测待测者外周血血浆中SOD1蛋白的浓度、S100A9蛋白的浓度、ORM2蛋白的浓度和IL1F6蛋白的浓度，再进行如下比较和输出结论：
如果ORM2蛋白的浓度＞841.42mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1蛋白的浓度≤418.91mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1＞418.91mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6≤4.67ng/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6＞4.67ng/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1＞347.68mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者。
本发明还保护用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒，包括用于检测SOD1蛋白的产品、用于检测S100A9蛋白的产品、用于检测ORM2蛋白的产品和用于检测IL1F6蛋白的产品。
所述试剂盒还包括记载有所述诊断方法I的载体。
本发明还保护一种辅助诊断继发性肺结核的方法，包括如下步骤：检测待测者外周血血浆中SOD1蛋白的浓度、S100A9蛋白的浓度、ORM2蛋白的浓度和IL1F6蛋白的浓度，然后按照如下标准进行诊断：
如果ORM2蛋白的浓度＞841.42mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1蛋白的浓度≤418.91mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1＞418.91mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6≤4.67ng/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6＞4.67ng/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1＞347.68mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者。
本发明还保护用于检测S100A9蛋白的产品在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测IL1F6蛋白含量的产品在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测ORM2蛋白含量的产品在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测SOD1蛋白含量的产品在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测S100A9蛋白的产品和记载有诊断方法II的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测IL1F6蛋白含量的产品和记载有诊断方法III的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测ORM2蛋白含量的产品和记载有诊断方法IV的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于检测SOD1蛋白含量的产品和记载有诊断方法V的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
所述诊断方法II为：检测待测者外周血血浆中S100A9蛋白的浓度，如果待测者外周血血浆中S100A9蛋白的浓度≤6.07mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；如果待测者外周血血浆中S100A9蛋白的浓度＞6.07mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者。
所述诊断方法III为：检测待测者外周血血浆中IL1F6蛋白的浓度，如果待测者外周血血浆中IL1F6蛋白的浓度≤84.79ng/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；如果待测者外周血血浆中IL1F6蛋白的浓度＞84.79ng/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者。
所述诊断方法IV为：检测待测者外周血血浆中ORM2蛋白的浓度，如果待测者外周血血浆中ORM2蛋白的浓度≤560.27mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；如果待测者外周血血浆中ORM2蛋白的浓度＞560.27mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者。
所述诊断方法V为：检测待测者外周血血浆中SOD1蛋白的浓度，如果待测者外周血血浆中SOD1蛋白的浓度≤306.13mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；如果待测者外周血血浆中SOD1蛋白的浓度＞306.13mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者。
本发明还保护记载有所述诊断方法II的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护记载有所述诊断方法III的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护记载有所述诊断方法IV的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护记载有所述诊断方法V的载体在制备用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒中的应用。
本发明还保护用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒甲。所述试剂盒甲包括用于检测S100A9蛋白的产品和记载有所述诊断方法II的载体。
本发明还保护用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒乙。所述试剂盒乙包括用于检测IL1F6蛋白含量的产品和记载有所述诊断方法III的载体。
本发明还保护用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒丙。所述试剂盒丙包括用于检测ORM2蛋白含量的产品和记载有所述诊断方法IV的载体。
本发明还保护用于辅助诊断继发性肺结核的试剂盒丁。所述试剂盒丁包括用于检测SOD1蛋白含量的产品和记载有所述诊断方法V的载体。
以上任一所述用于检测SOD1蛋白的产品具体可为用于检测SOD1蛋白浓度的产品。所述用于检测SOD1蛋白浓度的产品具体可为用于检测血浆中SOD1蛋白浓度的产品。所述用于检测血浆中SOD1蛋白浓度的产品具体可为用于检测外周血血浆中SOD1蛋白浓度的产品。
以上任一所述用于检测S100A9蛋白的产品具体可为用于检测S100A9蛋白浓度的产品。所述用于检测S100A9蛋白浓度的产品具体可为用于检测血浆中S100A9蛋白浓度的产品。所述用于检测血浆中S100A9蛋白浓度的产品具体可为用于检测外周血血浆中S100A9蛋白浓度的产品。
以上任一所述用于检测ORM2蛋白的产品具体可为用于检测ORM2蛋白浓度的产品。所述用于检测ORM2蛋白浓度的产品具体可为用于检测血浆中ORM2蛋白浓度的产品。所述用于检测血浆中ORM2蛋白浓度的产品具体可为用于检测外周血血浆中ORM2蛋白浓度的产品。
以上任一所述用于检测IL1F6蛋白的产品具体可为用于检测IL1F6蛋白浓度的产品。所述用于检测IL1F6蛋白浓度的产品具体可为用于检测血浆中IL1F6蛋白浓度的产品。所述用于检测血浆中IL1F6蛋白浓度的产品具体可为用于检测外周血血浆中IL1F6蛋白浓度的产品。
以上任一所述用于检测SOD1蛋白的产品为SOD1 Elisa试剂盒。具体可为USCN business生产的货号为SEB960Hu的Elisa试剂盒。
以上任一所述用于检测S100A9蛋白的产品为S100A9Elisa试剂盒。具体可为USCN business生产的货号为DY008的Elisa试剂盒。
以上任一所述用于检测ORM2蛋白的产品为ORM2Elisa试剂盒。具体可为USCN business生产的货号为SEB793Hu的Elisa试剂盒。
以上任一所述用于检测IL1F6蛋白的产品为IL1F6Elisa试剂盒。具体可为USCN business生产的货号为SEE843Hu的Elisa试剂盒。
以上任一所述SOD1蛋白的中文名称为超氧化物歧化酶1，英文名称为superoxide dismutase[Cu-Zn]，gi|4507149。
以上任一所述S100A9蛋白的中文名称为钙结合蛋白S100A9，英文名称为protein S100-A9，gi|4506773。
以上任一所述ORM2蛋白的中文名称为α-1-酸性糖蛋白前体-2，英文名称为alpha-1-acid glycoprotein 2 precursor，gi|4505529。
以上任一所述IL1F6蛋白的中文名称为白细胞介素1家族成员6，英文名称为interleukin-1 family member 6，gi|7657092。
以上任一所述重症继发性肺结核患者的临床诊断标准为：3个肺野及以上的浸润型肺结核、慢性纤维空洞型肺结核及毁损肺，同时合并低氧血症(具体参照文献：刘同伦：实用结核病学：沈阳：辽宁科学技术出版社M：1987：284-289)。
以上任一所述轻症肺结核患者的临床诊断标准为：病变在2个肺野以下，不伴有血气分析异常。
以上任一所述待测患者外周血血浆的采集方法具体可为：清晨空腹时采集10ml外周血静脉标本(装于EDTA抗凝管中)，4℃、2000rpm离心15min，分离上层血浆，-80℃保存备用。
本发明发现了四个辅助诊断重症继发性肺结核的蛋白标志物(S100A9、ORM2、IL1F6和SOD1)，通过研究发现四个蛋白标志物对可以用于监测继发性肺结核患者病变进展、加重的情况。本发明还建立了应用四个蛋白标志物辅助诊断重症继发性肺结核的模型。本发明为进一步阐明继发性肺结核进展、加重机制提供依据，为其病变进展、加重的预警和预测评估提供新方法和新指标，为重症继发性肺结核的合理救治奠定基础，为降低结核病的死亡率提供技术支撑。
附图说明
图1为训练集(模型组)数据建立的模型示意图。图中，STB代表重症继发性肺结核，MTB代表轻症继发性肺结核。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
肺结核的诊断标准：诊断标准参照2013年世界卫生组织编写的结核病定义(World Health Organization(WHO).Definitions and reporting framework for tuberculosis.2013；Geneva：WHO.)，所有肺结核患者均经临床症状、体征、痰抗酸杆菌涂片、痰结核分支杆菌培养、x线胸片、结核特异性T-SPOT.TB检测值阳性。
重症继发性肺结核的诊断标准：3个肺野及以上的浸润型肺结核、慢性纤维空洞型肺结核及毁损肺，同时合并低氧血症(具体参照文献：刘同伦：实用结核病学：沈阳：辽宁科学技术出版社M：1987：284-289)。
轻症继发性肺结核的诊断标准：病变在2个肺野以下，不伴有血气分析异常。
外周血血浆样本采集方法：清晨空腹时采集10ml外周血静脉标本(装于EDTA抗凝管中)，4℃、2000rpm离心15min，分离上层血浆，-80℃保存备用。
SOD1 Elisa试剂盒：USCN business，货号：SEB960Hu。
S100A9 Elisa试剂盒：USCN business，货号：DY008。
ORM2 Elisa试剂盒：USCN business，货号：SEB793Hu。
IL1F6 Elisa试剂盒：USCN business，货号：SEE843Hu。
实施例1、蛋白标志物的筛选
一、研究对象
收集首都医科大学附属北京胸科医院2015年03月-2015年12月已确诊为继发性肺结核患者的外周血血浆样本6例。其中，重症继发性肺结核3例，男性2例，女性1例，平均年龄51.33±16.66岁。轻症继发性肺结核3例，男性2例，女性1例，平均年龄52.67±22.82岁。知情同意协议和研究程序获得伦理委员会的批准，并且同意参与这项研究的所有患者及健康志愿者均签署知情同意书。
二、筛选蛋白标志物
取研究对象的外周血血浆样本，提取蛋白质，对重症继发性肺结核组和轻症继发性肺结核组进行差异表达蛋白的筛选，共筛选得到153个差异表达蛋白(其中82个上调蛋白，71个下调蛋白)。进一步对通过蛋白差异倍数、是否有商品化试剂盒和生物信息分析，在153个差异表达蛋白中筛选出8个候选蛋白标志物(其中6个上调蛋白，2个下调蛋白)。对8个候选蛋白标志物进行Western blot验证，去除掉2个表达趋势不符的蛋白。对其余6个蛋白进行进一步的验证和分析，最终筛选得到4个继发性肺结核进展的蛋白标志物(SOD1、S100A9、ORM2和IL1F6)。
SOD1(中文名称为超氧化物歧化酶1，英文名称为superoxide dismutase[Cu-Zn]，gi|4507149)。
S100A9(中文名称为钙结合蛋白S100A9，英文名称为protein S100-A9，gi|4506773)。
ORM2(中文名称为α-1-酸性糖蛋白前体-2，英文名称为alpha-1-acid glycoprotein 2precursor，gi|4505529)。
IL1F6(中文名称为白细胞介素1家族成员6，英文名称为interleukin-1family member6，gi|7657092)。
实施例2、诊断模型的建立及验证
一、研究对象的选择及分组
收集首都医科大学附属北京胸科医院2015年03月-2015年12月已确诊为继发性肺结核患者的外周血血浆样本143例，患者分为重症继发性肺结核组72例、轻症继发性肺结核组71例。知情同意协议和研究程序获得伦理委员会的批准，并且同意参与这项研究的所有患者及健康志愿者均签署知情同意书。
二、Elisa检测
取步骤一收集的外周血血浆样本，分别采用SOD1Elisa试剂盒、S100A9Elisa试剂盒、ORM2Elisa试剂盒和IL1F6Elisa试剂盒检测血浆中SOD1、S100A9、ORM2和IL1F6浓度(具体方法可参照试剂盒说明书)。
利用Elisa检测得到的数据进行模型的建立和验证。
三、模型的建立
利用决策树(CART分析)建立模型，决策树是通过递归分割(recursive partitioning)建立而成，递归分割是一种把数据分割成不同小的部分的迭代过程。建构决策树的归纳算法：1、将原始数据放入决策树的树根。2、将原始数据分成两组，一部分为训练集数据，另一部分为测试集。3、使用训练集数据来建立决策树，在每一个内部节点依据信息论(information theory)来评估选择哪一个属性继续做分割的依据，又称为节点分割(splitting node)。4、使用测试集数据来进行决策树修剪，修减到决策树的每个分类都只有一个节点，以提升预测能力与速度。也就是经过节点分割后，判断这些内部节点是否为树叶节点，如果不是，则以新内部节点为分枝的树根来建立新的次分枝。5、将第1至第4步骤不断递归，一直到所有内部节点都是树叶节点为止。当决策树完分类后，可将每个分枝的树叶节点萃取出知识规则。如果有以下情况发生，决策树将停止分割：1、该群数据的每一笔数据都已经归类到同一类别。2、该群数据已经没有办法再找到新的属性来进行节点分割。3、该群数据已经没有任何尚未处理的数据。
1、从143例样本数据中随机抽取30％作为测试集(验证组)，其余70％为训练集(模型组)。训练集(模型组)：MTB＝50例，STB＝51例；测试集(验证组)：MTB＝21例，STB＝21例。
2、使用训练集(模型组)数据建立用于鉴别重症继发性肺结核患者和轻症继发性肺结核患者的模型(模型如图1所示)。模型具体内容如下所示：
如果ORM2蛋白的浓度＞841.42mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1蛋白的浓度≤418.91mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度≤9.73mg/mL，并且SOD1＞418.91mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6≤4.67ng/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1≤347.68mg/mL，并且IL1F6＞4.67ng/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；
如果ORM2蛋白的浓度≤841.42mg/mL，并且S100A9蛋白的浓度＞9.73mg/mL，并且SOD1＞347.68mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者。
3、使用测试集(验证组)数据用于模型验证。分别计算训练集(模型组)和测试集(验证组)诊断结果的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值。
4、使用训练集(模型组)和测试集(验证组)数据采用如下判断标准单独进行诊断，计算诊断结果的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值。
标准I：如果S100A9蛋白的浓度≤6.07mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；如果S100A9蛋白的浓度＞6.07mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者。
标准II：如果IL1F6蛋白的浓度≤84.79ng/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；如果IL1F6蛋白的浓度＞84.79ng/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者。
标准III：如果ORM2蛋白的浓度≤560.27mg/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者；如果ORM2蛋白的浓度＞560.27mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者。
标准IV：如果SOD1蛋白的浓度≤306.13mg/mL，待测者为或候选为重症继发性肺结核患者；如果SOD1蛋白的浓度＞306.13g/mL，待测者为或候选为轻症继发性肺结核患者。
143例患者的具体Elisa检测结果和诊断结果见表2。敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值的统计结果见表3。
表2 143例患者的Elisa检测结果和诊断结果
表3敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值的统计结果
上述结果表明，由SOD1、S100A9、ORM2和IL1F6蛋白标志物建立的诊断模型诊断准确性较高，可以用于轻症继发性肺结核和重症继发性肺结核的辅助诊断，用于监测继发性肺结核患者病变进展、加重的情况。