本发明涉及植物石蜡切片技术领域，具体涉及一种石榴籽粒的石蜡切片方法。
背景技术：
石榴(punicagranatum)为千屈菜科(lythraceae)石榴属(punica)落叶灌木或小乔木，原产于伊朗和阿富汗等地区，至西汉张骞出使西域引入我国，已有2000多年的栽培历史。石榴果实是由革质化果皮包裹的圆形或椭圆形果实，果皮内部有5-7个心室，每个心室由几十到几百粒种子构成，种子是果实的食用部位，这与苹果、梨、草莓、桃、李、杏以及龙眼等都不同。石榴种皮由内外两层种皮构成，外种皮肥厚多汁，富含糖、有机酸、多酚等，是主要食用部位；内种皮富含木质素、纤维素、半纤维素等，是籽粒硬度的主要构成因素。籽粒硬度作为果实品质的重要因素，严重影响着石榴果实的食用性和商品性，已成为石榴生产和消费者关注的重点，也是石榴育种者关注的热点。目前对石榴种子的研究主要集中在分类、硬软籽粒形成关键基因的克隆等方面的研究，明确石榴籽粒结构特征可为石榴籽粒发育和调控研究奠定良好的基础。
石蜡切片是一种广泛使用的植物组织学方法。由于石蜡切片具有切片厚度易于控制、清晰度好等优点而被广泛用于植物组织的制片及细胞学研究中。石蜡切片整个过程虽然并不复杂，但要制出高质量的切片，每一个步骤的操作都很重要，且具有不同组织结构的植物以及植物不同部位的组织结构所需的处理不同，需要进行摸索和改进。目前，用于石蜡切片的植物材料包括胚珠、花芽、果肉和根茎等。而石榴内外种皮由于结构差异较大，外种皮肥厚多汁，内种皮富含木质素、纤维素、半纤维素等，革质坚硬，按照传统石蜡切片方法很难获得完好、清晰的显微切片，给石榴种皮结构观察带来一定的挑战。本发明将通过改进石蜡切片方法，建立一种适合于石榴种皮显微结构观察的石蜡切片方法，以明确石榴内外种皮的显微结构特征，从而为进一步的石榴籽粒发育和调控研究奠定基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种石榴籽粒的石蜡切片方法，以解决现有技术的不足。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种石榴籽粒的石蜡切片方法，包括如下步骤：
步骤1、取材与固定：选取新鲜、无损伤的石榴，取出完整、无破损的石榴籽粒；尽快投入faa固定液中固定，固定24h以上；
步骤2、脱水与透明：将固定后的石榴籽粒依次放入70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇进行梯度脱水，每梯度处理各2h，之后转入无水乙醇处理1.5h，再更换无水乙醇处理1.5h，脱水结束；将脱水后的石榴籽粒依次放入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合溶液2h、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合溶液2h，之后转入纯二甲苯处理1.5h，再更换纯二甲苯处理1.5h，透明结束；
步骤3、浸蜡与包埋：在高于石蜡熔点2℃条件下，将透明后的石榴籽粒置于体积比为1:1的二甲苯和石蜡混合液浸蜡4-5h，然后置于体积比为1:2的二甲苯和石蜡混合液浸蜡4-5h，之后用纯石蜡浸蜡4-5h，更换纯蜡继续浸蜡3-4d；从温箱中取出已熔的纯石蜡，缓缓倒入包埋用的纸盒中，稍微冷却后用温热的镊子夹取已浸蜡的石榴籽粒放于纸盒中，同时用温热的镊子赶走材料周围气泡；待纸盒表面石蜡稍微凝固时，平移纸盒放入冷水水面上，使其迅速凝固；
步骤4、切片与展片：将已包埋好的蜡块从纸盒中取出，切成小块，修成梯形，将蜡块切成5～10um蜡带，切好的蜡带于40℃蒸馏水中展片；将清洁的载玻片放到粘片剂中，数分钟后捞起，于37℃烘箱中烘干，用镊子夹取蜡带，放于上述处理好的载玻片上，载玻片置于预先加热的电热板上，蜡带受热伸展后放于37℃的温箱中过夜，获得干燥的切片；
步骤5、染色、透明、封片：将干燥的切片染色、透明；结束后封片。
进一步地，步骤1中faa固定液按90体积份的70％乙醇、5体积份的冰醋酸、5体积份的38％福尔马林进行配置。
进一步地，步骤4中调整蜡块与刀口之间的角度与位置，使刀片与蜡块间约成15度，摇转速度40～50r/min，将蜡块切成5～10um蜡带。
进一步地，步骤4中粘片剂按100ml蒸馏水、1g明胶和15ml甘油的比例进行配置。
进一步地，步骤5中染色、透明具体操作如下：将干燥的切片依次放入二甲苯30min、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液15min、无水乙醇2min、95％乙醇2min、85％乙醇2min、70％乙醇2min、50％乙醇2min，之后在37℃条件下，置于1％番红染液中48h；番红染色后的切片依次放入50％乙醇60s、70％乙醇60s、85％乙醇60s，之后置于0.5％固绿染液15s；固绿染色后的切片依次放入95％乙醇60s、无水乙醇30s、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液30s、二甲苯60s进行透明处理。
进一步地，步骤5中用中性树胶封片。
本发明的有益效果：
本发明找到了一种适宜石榴籽粒的石蜡切片方法，制作的切片组织结构完整、细胞界限清楚，切片干净，易于观察。
附图说明
图1：石榴种皮的显微结构；
pl栅栏层、vb维管束、ck木栓层、stl厚壁细胞层、pc薄壁细胞。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1
一种石榴籽粒的石蜡切片方法，包括如下步骤：
步骤1、取材与固定：选取新鲜、无损伤的石榴果实3～4个，置于冰盒，运回实验室。取出完整、无破损的石榴籽粒100粒，立即投入faa固定液中固定，固定时间在24h以上。其中，faa固定液按90体积份的70％乙醇、5体积份的冰醋酸、5体积份的38％福尔马林进行配置。
步骤2、脱水与透明：将固定后的石榴籽粒依次放入70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇进行梯度脱水，每梯度处理各2h，之后转入无水乙醇处理1.5h，再更换无水乙醇处理1.5h，脱水结束；将脱水后的石榴籽粒依次放入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合溶液2h、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合溶液2h，之后转入纯二甲苯处理1.5h，再更换纯二甲苯处理1.5h，透明结束。脱水是使组织进一步硬化，为下一步透明及浸蜡创造条件，脱水不彻底会使透明剂出现白色浑浊现象，透明时间过长又会使组织变脆变硬。本步骤确保了组织透明且结构完整，硬度适中，切片时组织不易碎。
步骤3、浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，二甲苯浸入组织在切片时起支持作用称为浸蜡，通常于恒温箱中进行。在高于石蜡熔点2℃条件下，将透明后的石榴籽粒置于体积比为1:1的二甲苯和石蜡混合液浸蜡4-5h，然后置于体积比为1:2的二甲苯和石蜡混合液浸蜡4-5h，之后用纯石蜡浸蜡4-5h，更换纯石蜡继续浸蜡3-4d；从温箱中取出已熔的纯石蜡，缓缓倒入包埋用的纸盒中，稍微冷却后用温热的镊子夹取已浸蜡的石榴籽粒放于纸盒中，同时用温热的镊子赶走材料周围气泡。待纸盒表面石蜡稍微凝固时，平移纸盒放入冷水水面上，使其迅速凝固。浸蜡时间直接影响切片效果。石榴外种皮肥厚多汁，内种皮富含木质素、纤维素、半纤维素等，革质坚硬，必须延长浸蜡时间，才能浸蜡完全。浸蜡不完全，存在空洞，无法切片。
步骤4、切片与展片：将已包埋好的蜡块从纸盒中取出，切成小块，修成梯形，调整蜡块与刀口之间的角度与位置，使刀片与蜡块间约成15度，摇转速度40～50r/min，将蜡块切成5～10um蜡带，切好的蜡带于40℃蒸馏水中展片；将清洁的载玻片放到粘片剂(按100ml蒸馏水、1g明胶和15ml甘油的比例进行配置)中，数分钟后捞起，于37℃烘箱中烘干，用镊子夹取蜡带，长约5cm，放于上述处理好的载玻片上，载玻片置于预先加热的电热板上，蜡带受热伸展后放于37℃的温箱中过夜，获得干燥的切片。
步骤5、染色、透明、封片：将干燥的切片依次放入二甲苯30min、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液15min、无水乙醇2min、95％乙醇2min、85％乙醇2min、70％乙醇2min、50％乙醇2min，之后在37℃条件下，置于1％番红染液(称取1g番红，溶于100ml50％的酒精中，过滤后使用)中48h；番红染色后的切片依次放入50％乙醇60s、70％乙醇60s、85％乙醇60s，之后置于0.5％固绿染液(称取0.5g固绿，溶于100ml95％的酒精中，过滤后使用)15s；固绿染色后的切片依次放入95％乙醇60s、无水乙醇30s、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液30s、二甲苯60s进行透明处理。结束后用中性树胶封片。
将制作的切片至于显微镜下观察并拍照，结果如图1所示，其组织结构完整，细胞界限清楚，切片干净。