透射式差动共焦CARS显微光谱测试方法及装置与流程

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种透射式差动共焦cars显微光谱探测方法及装置，可用于精确检测透明样品的微区拉曼光谱和几何形貌，并获得高空间分辨的层析图谱图像。

技术背景

1990年，共焦拉曼光谱显微技术的成功应用，极大的提高了探索微小物体具体组织成分及形貌的可能。它将共焦显微技术和拉曼光谱技术相结合，具备共焦显微术的高分辨层析成像特征，又兼有无伤检测和光谱分析能力，已成为一种重要的材料结构测量与分析的技术手段，广泛应用于物理、化学、生物医学、材料科学、石油化工、食品、药物、刑侦等领域。

传统的自发拉曼散射成像技术由于拉曼散射本身特性导致其发射信号极弱，即便用高强度的激光激发，要得到一副对比度好的光谱图像，依然需要很长的作用时间。这种长时间作用限制了拉曼显微技术在生物领域的应用。基于相干拉曼效应的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)过程能够很大程度上增强拉曼信号，从而实现快速检测。相干拉曼效应是通过受激激发的光将分子锁定在振动能级上，这种方法产生的振动信号的强度与激发光的强度成非线性关系，可以产生很强的信号，也称为相干非线性拉曼光谱。它具有很强的能量转换效率，曝光时间短，对样品的损害也比较小，同时它的散射具有一定的方向性，容易与杂散光分离。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的产生是一个三阶非线性光学过程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探测光。一般而言，为了减少光源的数量，简化过程，常用泵浦光代替探测光，它们之间的关系如图2所示，当泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的频率之差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，将激发出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的产生过程包含特定的拉曼活性分子的振动模式和导致分子从基态至激发态振动跃迁的入射光场的相互作用过程，它的能级示意图如图3所示。图3(a)表示拉曼共振和非共振单光子增强对cars过程的贡献，图3(b)表示拉曼共振和非共振双光子增强对cars过程的贡献；当wp和ws之间的频差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，激发出的信号得到共振增强，同时非共振部分也会由于电子跃迁响应得到增强，因此要得到较好的cars信号，需要尽可能的抑制非共振背景信号，常见的方法是偏振cars(p-cars)方法。

p-cars的原理如图4所示，光源1发出的频率为ws的斯托克斯光，起偏后经过四分之一波片和半波片后与光源2发出的频率为wp的泵浦光(探针光)汇合，经二向分光镜后由反射镜发射至水浸显微物镜，聚焦在样品上，激发出载有光谱特性的cars光后，透射进入信号采集系统；信号由一个油浸的显微物镜采集，经过一个偏振片过滤非共振背景，然后通过一个滤光片滤除其他谱段的干扰后，被一个雪崩光电二极管所采集，即获得特定频谱的光谱信号。

p-cars能够很大程度的抑制非共振信号和激发光的干扰，但是由于其采用的是两个单波长激光器，只能获得特定频谱的光谱信息，因此它的广泛使用受到了极大的限制。

传统cars显微术没有强调系统的定焦能力，导致实际光谱探测位置往往处于离焦位置。即便离焦位置也能激发出样品的拉曼光谱并被针孔后的光谱仪探测，但是强度并不能合理表征该点正确的光谱信号强度。在cars显微系统中，只有当系统精确定焦，才能获得最佳空间分辨力和最好的光谱探测能力。

此外，大多数光谱检测技术及装置是基于反射式结构，在检测透明材料时效果不佳。上述原因限制了cars显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在透明样品微区光谱测试与分析中的应用。基于上述情况，本发明提出将系统收集到的样品中散射的强于样品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光进行高精度探测，使其与光谱探测单元有机融合，进行空间位置信息和光谱信息的同步探测，以实现高空间分辨的、高光谱分辨的差动共焦cars图谱成像和探测。

本发明专利的核心思想是选用超连续谱脉冲激光器和单波长脉冲激光器作为激发光源，扩大激发光谱范围，提高光谱激发强度；将共焦探测光路分成两个部分，两个探测光路的光电探测器分别置于焦前焦后等距位置来实现差动探测，根据差动的原理，实现双极性绝对零点跟踪测量，精确定焦，实现高空间分辨；精确定焦后，进行光谱探测，获得最佳光谱分辨能力。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出一种可检测透明微小样品几何形貌和光谱信息的透射式差动共焦cars显微光谱测试方法及装置。

本发明是通过以下技术方案实现的，一种透射式差动共焦cars显微光谱测试方法：

a)在光谱激发单元(1)中，单波长脉冲激光器(2)产生单波长脉冲激光作为泵浦光和探测光，超连续谱激光器(3)超连续谱激光通过带通滤光片(4)选择特定波长范围的激光作为斯托克斯光；两束激光通过二向色镜(5)混合在一起，通过调整光路，使两束激光空间重合(泵浦光包络于斯托克斯光)、时间一致(两束激光到达二向色镜的光程一致)；在光谱激发单元(6)中，混合光束经第一反射镜(7)反射后经由固定在z向平移台(8)上的显微物镜(9)会聚在被测样品(11)上，激发出瑞利光和载有被测样品(11)光谱特性的cars光后被显微物镜(12)收集，光束中的cars光透过二向色镜(13)进入光谱探测单元(14)进行光谱探测，瑞利光反射进入差动共焦探测单元(20)进行几何测量；

b)在光谱探测单元(14)中，包含cars光的光束先经过带通滤光片(15)，滤除光束中的非cars干扰光，然后通过第一会聚镜(16)会聚进入光谱仪(19)，获得cars光谱信息；在差动共焦探测单元(20)中，另一束载有瑞利光的光束通过半反半透棱镜(21)分成两束，分别进行焦前、焦后探测，其中一束光通过第三会聚镜(22)后通过位于焦前的第二针孔(23)滤除杂散光后被第一光电探测器(24)探测，获得前焦信号(28)，另一束光通过第四会聚镜(25)后通过位于焦后的第三针孔(26)滤除杂散光后被第二光电探测器(27)探测，获得后焦信号(29)，由于第二针孔与第三针孔离焦量相同，因此对前焦信号和后焦信号做差，得到的差动共焦信号(30)中过零点位置与焦点位置精确对应，结合z向平移台(8)和x-y平移台(10)的位置，获得的被测样品的几何位置信息i(x,y,z)。

c)通过计算机(40)控制z向平移台(8)带动显微物镜(9)移动，使显微物镜(9)聚焦在被测样品(11)顶点处，重新获取cars光谱信号i(λ)，利用计算机将获得的几何位置信息i(x,y,z)和光谱信号i(λ)融合处理，获得被测样品的四维测量信息i(x,y,z,λ)，即实现高空间分辨的微区图谱层析成像。

特别的，在本发明方法中，通过匹配不同谱带的滤光片，选择不同谱段的斯托克斯光，以实现不同谱段的光谱探测，其中滤光片(4)与滤光片(15)的滤光谱带关于泵浦光中心波长对称。

特别的，在激光发射单元(1)和光谱激发单元(6)之间添加偏振片，可获得偏振光，进而改善激发的cars光谱的信噪比。

特别的，在本发明方法中，在激光发射单元(1)和光谱激发单元(6)之间添加光瞳滤波器(31)，可获得结构光束，压缩聚焦光斑尺寸，提高系统横向分辨率。

特别的，在本发明方法中，激发光产生的途径还包括单波长激光器(2)加光子晶体光纤(33)产生超连续谱激光后与单波长激光耦合的方式；

特别的，在本发明方法中，本发明方法探测cars光谱的方法还可以是将光谱探测单元(14)中的光谱仪(19)替换成光电点探测器(38)，采用偏振片(37)旋转实现光谱扫描探测的方式获得cars光谱。

特别的，本发明方法还包括反向激发、反向探测的光谱激发探测模式。

一种透射式差动共焦cars显微光谱测试装置，包括以下五个单元：激光发射单元(1)、光谱激发单元(6)、光谱探测单元(14)、差动共焦探测单元(20)、计算机(40)。激光发射单元(1)位于光谱激发单元(6)中第一反射镜(7)的入射方向，光谱探测单元(14)位于光谱激发单元(6)中二向色镜(13)的透射方向，差动共焦探测单元(20)位于二向色镜(13)的反射方向。计算机(40)用于控制光谱激发单元(6)中z向平移台(8)和x-y平移台(10)的移动、显微物镜(9)的切换、光谱仪采集的光谱数据和差动共焦探测数据的融合处理；

在本发明装置中，激光发射单元(1)包括单波长脉冲激光器(2)、超连续谱激光器(3)、带通滤光片(4)、二向色镜(5)；光谱激发单元(6)包括第一反射镜(7)、z向平移台(8)、显微物镜(9)、x-y平移台(10)、被测样品(11)、显微物镜(12)、二向色镜(13)；光谱探测单元(14)包括带通滤光片(15)、第一聚光镜(16)、第一针孔(17)、第二聚光镜(18)、光谱仪(19)；差动共焦探测单元(20)包括分光棱镜(21)、第三聚光镜(22)、第二针孔(23)、第一光电探测器(24)、第四聚光镜(25)、第三针孔(26)、第二光电探测器(27)；

在本发明装置中，cars光谱激发的光源选择模式包括单波长激光器(2)发出的光作为泵浦光和探测光时，连续谱激光器(3)发出的连续谱激光作为斯托克斯光；单波长激光器(2)发出的光作为斯托克斯光和探测光时，连续谱激光器(3)发出的连续谱激光作为泵浦光；

有益效果

本发明方法，对比已有技术具有以下显著优势：

1、本发明采用透射式显微结构，对透明样品光谱和几何结构的测量与分析更加准确，获得的光谱信号更强；

2、采用激光差动共焦系统轴向响应曲线的过零点位置与显微物镜焦点位置精确对应这一特性，精确捕获激发光斑焦点位置信息，实现准确定焦，进而实现高空间分辨的光谱探测。

3、本发明利用二向色分光装置对系统收集到的瑞利光和载有样品信息的cars光无损分离，其中瑞利光进入差动共焦探测单元，cars光进入光谱探测单元，实现光能的尽可能利用，并提高系统光谱探测灵敏度。

4、与传统共焦cars显微系统比较，本发明装置抗环境干扰能力更强，可显著抑制系统的非线性、样品反射率和表面倾斜等对测量结果的影响，有利于实现微细透明结构的多层分析、高精度、高分辨力的测量；

5、本发明具有三种测量模式，差动共焦显微单元实现三维形貌测量，光谱探测单元实现光谱测量，两者结合实现层析图谱测量。

附图说明

图1为摘要附图，即本发明基本实施图；

图2为cars光与泵浦光、斯托克斯光的关系图；

图3为cars光激发能级关系图；

图4为传统偏振探测显微光路图；

图5为光谱探测改进方法示意图；

图6为改进光谱探测的透射式差动共焦cars显微光谱探测方法示意图；

图7为透明样品层析测量示意图；

图8为加光瞳滤波器的透射式差动共焦cars显微光谱探测方法示意图；

图9为单激光器的透射式差动共焦cars显微光谱探测方法示意图；

图10为时域扫描的透射式差动共焦cars显微光谱探测方法示意图；

图11为反向激发、反向探测的透射式差动共焦cars显微光谱激发示意图；

图12为透射式差动共焦cars显微光谱实施装置图，即实施例用图；

图中，1-激光发射单元、2-单波长激光光源、3-超连续谱激光光源、4-带通滤光片、5-二向色镜、6-光谱激发单元、7-第一反射镜、8-z向平移台、9-显微物镜、10-x-y平移台、11-被测样品、12-显微物镜、13-二向色镜、14-光谱探测单元、15-带通滤光片、16-第一聚光镜、17-第一针孔、18-第二聚光镜、19-光谱仪、20-差动共焦探测单元、21-分光棱镜、22-第三聚光镜、23-第二针孔、24-第一光电探测器、25-第四聚光镜、26-第三针孔、27-第二光电探测器、28-前焦曲线、29-后焦曲线、30-差动共焦曲线、31-光瞳滤波器、32-偏振分光棱镜、33-光子晶体光纤、34-第二反射镜、35-光学延时器、36-第三反射镜、37-偏振片、38-光电点探测器、39-减法电路、40-计算机；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

图1中光谱探测单元(14)由带通滤光片(15)、第一聚光镜(16)、光谱仪(19)组成；若在此光谱探测单元(6)中添加针孔过滤杂散光，则如图5所示，光束经带通滤光片(15)滤除非cars光，然后通过第一聚光镜(16)后通过第一针孔(17)过滤环境干扰光后由第二聚光镜(18)会聚进入光谱仪(19)，由此光谱探测的信噪比得到大幅提高；

图6是结合改进光谱探测方法的透射式差动共焦cars显微测试方法示意图；选用一个单波长脉冲激光器(2)作为泵浦光源和探测光源，由它发出泵浦光(探测光)，然后选用一个频率与之一致的超连续谱脉冲激光器(3)作为斯托克斯光源，在经过带通滤光片(4)后得到要求波长范围内的连续谱激光，通过调节光学结构，使两束激光通过二向色镜(5)时间一致，空间重合；混合后的光束进入光谱激发单元(6)，经第一反射镜(7)反射透过显微物镜(9)会聚在被测样品(11)上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱信息的cars光；瑞利光和cars光被显微物镜(12)收集，其中cars光透过二向色镜(13)进入光谱探测单元(14)进行光谱探测，获得光谱信息，瑞利光被二向色镜(13)反射进入差动共焦探测单元(20)进行几何位置探测，获得几何位置信息。

如图7所示，是测量多层透明样品的差动共焦曲线示意图，图显示的是测量双层样品时的物镜定焦情况、焦斑大小变换及最终的差动共焦曲线(30)和光谱响应曲线图(31)；具体实现方式为，激发的瑞利光经二向色镜(13)反射进入差动共焦探测单元(20)，在差动共焦探测单元(20)中，光束通过分光棱镜(21)分成两束，分别进行焦前、焦后探测，其中一束光通过第三会聚镜(22)后通过位于焦前的第二针孔(23)滤除杂散光后被第一光电探测器(24)探测，获得前焦信号(28)，另一束光通过第四会聚镜(25)后通过位于焦后的第三针孔(26)滤除杂散光后被第二光电探测器(27)探测，获得后焦信号(29)，由于第二针孔与第三针孔离焦量相同，因此对前焦信号和后焦信号做差，得到的差动共焦信号(30)中过零点位置(聚焦光斑最小)与显微物镜(9)焦点位置精确对应；由此，可获得被测样品的几何位置信息并实现对样品测量面的精确定焦；精确定焦后，再结合光谱探测单元对cars光进行cars光谱探测，结合几何位置信息，可实现高空间分辨的光谱探测。

如图8所示，若在激光发射单元(1)和光谱激发单元(7)之间添加光瞳滤波器(31)，可产生结构光束，提高系统的空间分辨力，也可添加偏振片，产生偏振光束，提高激发光谱的信噪比。

如图9所示，本发明不仅可以采用双激光器进行cars光谱激发，也可采用单激光器进行超连续谱扩展后进行cars光谱激发。在激光发射单元(1)中，单波长脉冲激光器(2)发出单波长脉冲激光，经偏振分光棱镜(32)分光，一半光进入光子晶体光纤(33)进行超连续谱扩展，另一半光经过反射镜(34)进入光学延时器(35)进行时域调整；产生的超连续光与单波长激光通过二向色镜(5)混合(单波长激光包络于超连续谱激光)，通过调整光学延时器，使两束激光脉冲同步，由此实现空间重合、时间一致的cars光谱激发要求，通过高倍显微物镜(9)能够对被测样品(11)进行cars光谱激发；

将图9中光谱探测单元(14)中的光谱仪(19)替换成光电点探测器(38)，在偏振分光棱镜(32)和光子晶体光纤(33)之间添加偏振片(37)，即构成图10；通过旋转偏振片(37)，改变光束的偏振态，使光子晶体光纤(33)输出的光束实现光谱扫描输出，结合光学延时线(35)可以实现时域扫描cars光谱激发，进而通过光电点探测器(38)实现宽谱带的cars光谱探测。

如图11所示，本发明激发cars光谱的方式不仅可以采用同向激发、反向探测的方式，还可以采用反向激发、反向探测的方式。单波长激光器(2)发出的单波长激光通过二向色镜(5)反射通过第二显微物镜(12)会聚在被测样品(11)上，而超连续谱激光器(3)发出的连续谱激光通过反射镜(7)反射进入第一显微物镜(9)会聚在被测样品(11)上；两束光会聚在被测样品(11)上的位置相同，保证两束脉冲激光到达样品位置时序一致，激发出瑞利光和载有被测样品(11)光谱特性的cars光，分别进入光谱探测单元(14)和差动共焦探测单元(20)进行光谱探测和几何位置探测。

实施例

在本实施例中，采用波长为780nm的飞秒脉冲激光器作为泵浦光源和探测光元，采用重复频率与之一致的超连续谱皮秒脉冲激光器添加800～950nm的带通滤光片作为斯托克斯光源，在满足空间重合、时间一致的条件混合出射，通过光瞳滤波器获得结构光束后通过高倍显微物镜紧聚焦在样品上，此时满足相位匹配条件，激发出波长为780nm的瑞利光和波长范围在600～760nm的反斯托克斯光(cars)。

如图12所示，一种透射式差动共焦cars显微测试装置由以下五个单元组成：激光发射单元(1)、光谱激发单元(6)、光谱探测单元(14)、差动共焦探测单元(20)、计算机(40)组成；其中，激光发射单元(1)位于光谱激发单元(6)中的第一反射镜(7)入射方向，光谱探测单元(14)位于光谱激发单元(6)中的二向色镜(13)的透射方向，差动共焦探测单元位于二向色镜(13)的反射方向；计算机(40)负责光谱激发单元(6)中显微物镜的切换、z向平移台(8)与x-y平移台(10)的高精度移动，光谱探测单元(14)和差动共焦探测单元(20)获得的数据处理与融合。

其测试步骤如下：

a)在激光发射单元(1)中，单波长激光器(2)发出780nm的单波长脉冲激光，作为泵浦光和探测光λ0，超连续谱激光器(3)发出400～2100nm谱段超连续谱脉冲激光，经过带通滤光片(4)后得到范围为800～950nm的连续谱激光，作为斯托克斯光λs；两束激光通过二向色镜(5)混合出射，通过调整光路，使两束激光出射时空间一致(单波长激光包络于连续谱激光)；

b)混合后的激光经过光瞳滤波器(39)获得结构光束，进入光谱激发单元(6)，进行cars光谱激发；

c)在光谱激发单元(6)中，混合后的激光λ0+λs经第一反射镜(7)反射通过显微物镜(9)紧聚焦在被测样品(11)上，激发出瑞利光λ0和载有被测样品(11)光谱特性的cars光λas，由规格与显微物镜(9)一致的显微物镜(12)收集；其中，瑞利光λ0经二向色镜(13)反射进入差动共焦探测单元(20)进行几何位置探测，cars光λas经二向色镜(13)透射进入光谱探测单元(14)进行cars光谱探测。

d)在差动共焦探测单元(20)中，瑞利光λ0先经过一个半反半透分光棱镜(21)分光，一半光通过第三聚光镜(22)会聚通过位于焦前的针孔(23)，最终被第一光电探测器(24)所探测，得到前焦信号ia(v,u0+um)；另一半光通过第四聚光镜(25)会聚通过位于焦后的针孔(26)，最终被第二光电探测器(27)所探测，得到后焦信号ib(v,u0-um)。差动相减模块(39)是一个减法电路，能够将前焦信号与后焦信号做差，获得差动信号:

i(v,u)＝ia(v,uo+um)-ib(v,uo-um)

其中，i(v,u)为激光差动共焦响应；v为轴向归一化光学坐标，um为针孔轴向偏移量。差动共焦响应曲线(30)的“零点位置”与激发光束的聚焦光斑最小值点精确对应，通过响应曲线(30)的“零点位置”获得被测样品(11)的z向信息，结合连接x-y平移台(10)的位移传感器反馈的位置信息重构出被测样品(11)的表面三维形貌i(x,y,z)。

e)计算机(40)控制z向平移台(8)移动使激光精确聚焦在被测样品(11)上，激发出能正确表征被测样品光谱特性的cars光谱i(λ)，由光谱探测单元(14)采集；在光谱探测单元(14)中，光束先通过带通滤光片(15)(600～760nm)过滤掉非cars光，再通过第一针孔(17)过滤掉环境干扰光，由第二聚光镜(18)会聚进入光谱仪(19)进行cars光谱探测，获得cars光谱信息i(λ)，其中λ为被测样品(11)受激发光所激发出cars光的波长。

f)由计算机(40)融合位置信息i(x,y,z)和光谱信息i(λ)，完成被测样品(11)的三维重构及光谱信息融合i(x,y,z,λ)。

若对接收瑞利光的差动共焦探测单元(20)获得的差动共焦响应曲线(30)进行处理，通过其绝对零点精确捕获激发光斑的焦点位置i(x,y,z)，系统可以进行高空间分辨的三维尺度层析成像。

若对接收cars光的光谱探测单元(14)获得的光谱响应曲线i(λ)进行处理时，系统可以进行光谱探测。

若对接收cars光的光谱探测单元(14)获得的光谱信号i(λ)和接收瑞利光的差动共焦探测单元(18)获得的几何位置信息i(x,y,z)同时进行处理时，系统可以进行高空间分辨的微区图谱层析成像i(x,y,z,λ)，即实现被测样品(11)的几何位置信息和光谱信息的高空间分辨的“图谱合一”成像与探测。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上进行的改动都是本发明的保护范围。