本发明涉及一种基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素m1的检测方法，属于免疫分析领域。
背景技术：
：：卤化物钙钛矿材料具有出色的光伏性能和较高的能量转化率，在背光荧光粉领域具有巨大潜力。与有机无机杂化钙钛矿(ch3nh3pbx3)相比，无机钙钛矿(cspbx3)显示出优异的稳定性，在光电子学具有巨大潜在应用价值。钙钛矿发光性能优异，在生物成像、荧光免疫检测探针等都具有应用潜力，然而其水稳性能依然是技术瓶颈，水溶更是难以实现，大大限制了其在生物方面的应用。为实现水溶性能，有研究通过制备油溶性的钙钛矿纳米晶，随后用固体脂质纳米颗粒来包裹钙钛矿纳米晶实现水溶，然而其制备方法复杂，且有机溶剂使用量大，不利于大批量生产与环保要求([1]gomezl,deweerdc,huesojl,etal.color-stablewater-dispersedcesiumleadhalideperovskitenanocrystals[j].nanoscale,2017,9(2):631-636.)。在免疫检测中，荧光免疫检测快捷且操作简易，是一种优异的免疫检测方法。黄曲霉素m1是一种易接触人体的致毒物，且由于大多存在于牛奶等奶制品中，其暴露的对象包含婴幼儿，因此其检测十分必要。目前国内外检测黄曲霉素m1的方法有高效液相法、液质联用、荧光探针法等([2]wangy，etal.hplcdeterminationofaflatoxinm1inliquidmilkandmilkpowderusingsolidphaseextractionon0asishlb.foodcontrol，2012；28(1)：13l一134.[3]cavalierec，fogliap，etal.anatoxinm1determinationincheesebyliquidchromatography—tandemmassspectrometry.jchromatographya，2006；1135(2)：135一141.[4]tayebim,etal.determinationoftotalaflatoxinusingcysteamine-cappedcdsquantumdotsasafluorescenceprobe[j].colloid&polymerscience,2016,294(9):1-10.)。其中荧光探针法快捷便利，无需昂贵的仪器，是非常活跃的研究领域。目前，将钙钛矿应用于黄曲霉素m1的检测中仍未见报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素m1的检测方法。实现上述目的的技术方案如下：基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素m1的检测方法，具体步骤如下：步骤1，将油胺加入到csx和pbx2粉末中，以300～500rpm的转速球磨1～7h，其中球料质量比为15:1～30:1，所述的x为cl、br、i，cspbx3的摩尔量与油胺的体积比为10～40:1；步骤2，在球磨粉末中加入水溶性阴离子表面活性剂，加入tris缓冲液搅拌溶解，调节ph至7～8，得到水溶性钙钛矿溶液；步骤3，将黄曲霉素m1抗体溶液加入到水溶性钙钛矿溶液中，混匀后室温静置进行吸附，得到抗体和水溶性钙钛矿的混合溶液；步骤4，将待检测的黄曲霉素m1溶液与包被液混合，37℃下孵育进行包被，包被结束后，除去液体，清洗，甩干，加入4％牛奶稀释液，在37℃孵育，清洗，甩干；步骤5，将抗体和水溶性钙钛矿的混合溶液滴加到步骤4中包被的待检测的黄曲霉素m1中，检测吸光度，得到初始吸光度f0，之后37℃下孵育，孵育结束后，清洗，甩干，检测吸光度，得到最终吸光度f，根据黄曲霉素m1的浓度与f/f0的标准曲线关系，计算得到待检测的黄曲霉素m1的浓度。步骤2中，所述的阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠(sds)，钙钛矿纳米晶与水溶性阴离子表面活性剂的质量比为5:1～10:1。步骤3，所述的静置吸附时间为15～30min。步骤4，所述的包被孵育时间为1～2h。步骤5，所述的孵育时间为20～30min。与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：1)采用一步球磨法制备水溶性钙钛矿纳米晶，该方法简单，可批量放大生产，成本低，制得的钙钛矿在水中稳定；2)将水溶性钙钛矿纳米晶用于黄曲霉素m1的检测，检测灵敏度可达0.01ng/ml，达到实际应用的要求，拓宽了黄曲霉素m1荧光检测范围。本发明首次将钙钛矿应用于检测黄曲霉素m1的检测中，拓宽了钙钛矿的应用范围。附图说明图1为实施例1和实施例3制备的钙钛矿纳米晶的xrd图。图2为实施例1制备的钙钛矿纳米晶的tem图。图3为实施例1制备的钙钛矿纳米晶的pl图。图4为实施例1制备的钙钛矿纳米晶的紫外吸收图谱随水溶浓度的变化图。图5为实施例1制备的钙钛矿纳米晶与抗体偶联的tem图。图6为实施例1制备的钙钛矿纳米晶与抗体偶联不同ph下的荧光检测变化图。图7为实施例2钙钛矿纳米晶检测黄曲霉素m1的标准曲线。图8为实施例4制备的钙钛矿纳米晶水溶液照片。图9为实施例5制备的钙钛矿纳米晶的pl图。图10为实施例1和对比例1制备的钙钛矿纳米晶与抗体结合后静置后的图。图11为对比例2制得的钙钛矿纳米晶在水中的分散情况图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。本发明在csx、pbx2的原料中添加少量的表面活性剂，通过球磨的方法得到可在水中分散的发光纳米晶，通过表面进一步修饰阴离子表面活性剂使得表面带负电荷，与黄曲霉素m1的抗体相结合，通过荧光免疫检测方法可针对黄曲霉素m1进行定量检测。实施例1基于水溶性钙钛矿纳米晶的黄曲霉素m1的检测方法，具体包括如下步骤：1)将100μl油胺加入到2mmol的csbr与pbbr2粉末中，充入氩气进行保护，密封球磨罐，以400rpm的转速球磨2h，其中球料质量比为30:1；2)在80mg球磨粉末中加入10mg的sds粉末，加入2mltris缓冲液，搅拌溶解，调节ph至7.4，得到水溶性钙钛矿溶液；3)将步骤2)的溶液取8份75μl，分别加425μl纯水稀释，用0.1m的k2co3溶液对溶液ph进行调节，分别滴加1～8μl并用混匀器进行混匀；4)取10μl黄曲霉素m1抗体溶液分别加到步骤3)的混合溶液中，混匀并室温静置半小时进行吸附；5)配制黄曲霉素m1抗原溶液浓度为0.25ug/ml，包被液(na2co3、nahco3)每个孔滴加100ul，抗原溶液滴加100ul，在酶标仪中晃板多次混合均匀，37℃孵育2h进行包被，之后倒掉孔中溶液进行自动洗板，并摔干；在孔中加入牛奶稀释液(4％的浓度)，在37℃培养1h，之后进行自动洗板三次，留待备用；6)将100μl不同ph梯度的步骤4)溶液分别加入到孔板中，晃匀，并用酶标仪进行初始值测量；7)将步骤6)溶液在37℃下培养半小时，自动洗板三次，摔干，用酶标仪测量荧光最终值。本实施例制得的cspbbr3钙钛矿纳米晶其结晶性表征xrd见图1的1，其晶相的峰位和强度与钙钛矿的标准卡片相吻合，说明其良好的结晶性。其相貌tem图见图2，晶粒尺寸分布为50～100nm。其水溶液的pl发光谱图见图3，发光峰中心波长为522nm，半峰宽仅为18nm。其紫外吸收图谱随水溶浓度的变化见图4，在水中的溶解度可达3.4mg/ml。与抗体偶联的tem图见图5，从a到c依次为cspbbr3钙钛矿纳米晶、抗体以及偶联后的荧光探针。不同ph下荧光检测变化图见图6，当ph较大时，其检测效果好。实施例21)将100μl油胺加入到2mmol的csbr与pbbr2粉末中，充入氩气进行保护，密封球磨罐，以400rpm的转速球磨2h，其中球料质量比为30:1；2)在80mg球磨粉末中加入10mg的sds粉末，加入2mltris缓冲液，搅拌溶解，调节ph至7.4，得到水溶性钙钛矿溶液；3)将步骤2)的溶液取75μl，加425μl纯水稀释，用0.1m的k2co3溶液对溶液ph进行调节，滴加8μl并用混匀器进行混匀；4)取10μl黄曲霉素m1抗体溶液分别加到步骤3)的混合溶液中，混匀并室温静置半小时进行吸附；5)配制不同浓度的黄曲霉素m1抗原溶液，包被液(na2co3、nahco3)每个孔滴加100ul，抗原溶液滴加100ul，在酶标仪中晃板多次混合均匀，37℃孵育2h进行包被，之后倒掉孔中溶液进行自动洗板，并摔干；在孔中加入牛奶稀释液(4％的浓度)，在37℃培养1h，之后进行自动洗板三次，留待备用；6)将100μl步骤4)溶液加入到孔板中，晃匀，并用酶标仪进行初始值测量；7)将步骤6)溶液在37℃下培养半小时，自动洗板三次，摔干，用酶标仪测量荧光最终值。钙钛矿纳米晶检测黄曲霉素m1的标准曲线见图7。在0.02to10.1ng/ml的黄曲霉素m1浓度范围内呈现线性变化，其检测灵敏度可达0.01ng/ml，可满足实际应用的要求。实施例31)将50μl油胺加入到2mmol的csbr与pbbr2粉末中，充入氩气进行保护，密封球磨罐，以400rpm的转速球磨2h，其中球料质量比为30:1；2)在50mg球磨粉末中加入10mg的sds粉末，加入2mltris缓冲液，搅拌溶解，调节ph至7.4，得到水溶性钙钛矿溶液；3)将步骤2)的溶液取8份75μl，加425μl纯水稀释，用0.1m的k2co3溶液对溶液ph进行调节，用混匀器进行混匀；4)取10μl黄曲霉素m1抗体溶液分别加到步骤3)的混合溶液中，混匀并室温静置半小时进行吸附；5)配制黄曲霉素m1抗原溶液浓度为0.25ug/ml，包被液(na2co3、nahco3)每个孔滴加100ul，抗原溶液滴加100ul，在酶标仪中晃板多次混合均匀，37℃孵育2h进行包被，之后倒掉孔中溶液进行自动洗板，并摔干；在孔中加入牛奶稀释液(4％的浓度)，在37℃培养1h，之后进行自动洗板三次，留待备用；6)将步骤4)溶液分别加入100μl到孔板中，晃匀，并用酶标仪进行初始值测量；7)将步骤6)溶液在37℃下培养半小时，自动洗板三次，摔干，用酶标仪测量荧光最终值。本实施例制得的cspbbr3钙钛矿纳米晶其xrd见图1的2，其结晶性依然良好。实施例4本实施例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤1)中油胺体积改为200μl，其他条件保持一致。本实施例制得的钙钛矿纳米晶水溶液照片见图8，水溶性良好。实施例5本实施例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤1)中csbr与pbbr2粉末改为csi与pbi2，其他条件保持一致。本实施例制得的钙钛矿纳米晶其发光图谱见图9，发光性能依然良好。对比例1本对比例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤2)中tris改为pbs，其他条件保持一致。本对比例制得的cspbbr3钙钛矿纳米晶用于黄曲霉素m1的荧光免疫检测。其检测效果稍差，抗体与纳米晶结合后放置有沉淀，见图10。对比例2本对比例与实施例3基本相同，唯一不同的在于，将实施例1的步骤1)中油胺改为250μl，其他条件保持一致，本对比例制得的钙钛矿纳米晶在水中的溶解性变差，见图11，绝大部分钙钛矿纳米晶沉淀，不能在水中分散。当前第1页12当前第1页12