一种分离分析大体积环境水样中微量孔雀绿的方法与流程

本发明属于环境样品痕量目标物分离分析技术领域，特别涉及一种分离分析大体积环境水样中微量孔雀绿的方法。该方法将高内相乳液聚合物整体柱与高效液相色谱联用，适用于环境水样及其他复杂基体中痕量孔雀绿目标物的萃取、富集、分离和检测。

背景技术：

孔雀绿（mg），化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，化学式为c23h25c1n2,别名碱性孔雀(石)绿、碱性绿、盐基块绿、苯胺绿等，为翠绿色有光泽的结晶，属三苯甲烷类染料。mg常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂，因其能有效预防水产品真菌感染和杀死寄生虫，1933年起作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用，后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。从上世纪90年代开始，国内外学者陆续发现孔雀绿能引起鱼类的鳃和皮肤上皮细胞轻度炎症；使肾管腔有轻度扩张，肾小管壁细胞的胞核也扩大；具有致突变、致畸、致癌等危害。mg进入环境以后，经过水的稀释作用，多以痕量和超痕量存在，因此建立水体中mg的检测方法是很有必要。

目前，mg的检测方法主要有高效液相色谱法-紫外检测法，高效液相色谱-安培法、高效液相色谱法-质谱联用法、酶联免疫法毛细管电泳法等。高效液相色谱法紫外检测，mg的响应相对较低；利用mg能被硼氢化钾还原为隐色孔雀石绿(lmg)，lmg具有荧光响应的特点，采用高效液相色谱法-荧光检测法进行分析检测，有助于提高mg残留检测的灵敏度。

固相萃取（solidphaseextraction，spe）是一个由柱色谱分离过程、分离机理、固定相和溶剂的选择等组成的试样预处理技术，其利用固体吸附剂吸附液体样品中的目标物，使目标物与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，最终达到分离和富集目标物的目的。spe具有操作时间短、样品量小、不需萃取溶剂、适于分析挥发性与非挥发性物质、重现性好等优点．对环境化学、食品、医药卫生、临床化学、生物化学、法医学等领域中复杂目标物样品微量或痕量的分离、富集和分析做出了巨大的贡献。

高内相乳液（highinternalphaseemulsion(hipe)），是一种水包油(o/w)或油包水（w/o）两相体系，其中分散相的体积分率在74%以上，甚至达到99%。制备高内相乳液整体柱的过程中，可通过改变乳液材料的单体种类、单体种类、乳液材料的相比等精确控制孔的大小和分布，且高内相乳液整体柱具有高孔隙率、高比表面积、低密度、很好的物质输送能力以及重现性好的特点，在分离介质、吸收材料、生物组织工程、催化剂载体等领域显示出较好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于，克服现有技术中有机聚合物整体柱材料在种类和萃取效果上的很多不足，提供一种分离分析大体积环境水样中微量孔雀绿的方法。

具体步骤为：

(1)采用高内相乳液聚合技术合成具有亲水性的聚苯乙烯sty-二乙烯苯dvb-甲基丙烯酸缩水甘油酯gma高内相乳液聚合整体柱，即sty/dvb/gmapolyhipe整体柱。

(2)在300ml环境水样品中加入3ml甲酸使环境水样品呈酸性，再加入3ml浓度为0.04mol/l的硼氢化钾还原孔雀绿，所得混合液在蠕动泵或高压泵的作用下以2ml/min的流速通过步骤(1)制得的sty/dvb/gmapolyhipe整体柱，萃取并富集环境水样品中存在的痕量还原型孔雀绿（lmg）。

(3)采用体积比为1:4的pbs/乙腈混合溶液清洗sty/dvb/gmapolyhipe整体柱，除去吸附力小的干扰物质，再用体积比为1:1的乙醇/三氯甲烷混合溶液洗脱富集在sty/dvb/gmapolyhipe整体柱上的孔雀绿目标物，收集洗脱液放入进样瓶，用高效液相色谱-荧光光谱联用分析测定，即实现对大体积环境水样中微量孔雀绿的分离分析。

所述sty/dvb/gmapolyhipe整体柱的具体制备步骤为：将sty、dvb、gma和表面活性剂span80按照体积比为6:3:3:4依次加入到离心管中，运用涡旋振动器搅拌均匀，形成有机相；配制0.02g/ml的过二硫酸钾水溶液，该水溶液不仅作为材料的水相，也作为引发材料聚合的引发剂；将水相逐步滴加入有机相中，每次加入200μl，且每加入一次均用涡旋振荡器搅拌均匀，得到高内相乳液，其中水相体积占水相和有机相总体积的比为90~92%；取1.0ml制备好的高内相乳液，加入到2ml预填充有玻璃纤维丝且内表面粗糙的针管中，填充密实并封口；置于干燥箱中60℃下热聚合24小时，即制得sty/dvb/gmapolyhipe整体柱。

本发明方法至少具有以下优点：

1）本发明方法采用高内相乳液（hipe）法，制备了新型sty/dvb/gmapolyhipe整体柱，整体柱比表面积大，孔径较小，孔间通道数目多，形成巨大相互贯通的蜂窝结构。本发明方法操作简单、重复性好、灵敏度高，检测结果可靠，可应用于各种环境水样品中痕量mg的准确检测。

2）经过对单体比例的调控、相比的优化，使得乳液稳定性增加，乳液不断变粘稠，获得了吸附性强、流通性好、稳定性与重现性好的高内相乳液聚合物整体柱；对孔雀绿或还原型孔雀绿具有高的萃取和富集能力，可应用于复杂水体样品中痕量孔雀绿的选择性萃取、富集和分析；采用硼氢化钾还原样品中孔雀绿，使其能采用高效液相色谱-荧光光谱仪（hplc-fld）方法进行定性定量分析，实现了大体积环境水样中孔雀绿的高灵敏、超微量准确分析。

说明书附图

图1是本发明中sty/dvb/gmapolyhipe整体柱制备过程及萃取富集过程示意图。

图2是本发明实施例制得的sty/dvb/gmapolyhipe整体柱在放大倍数为1000倍下的扫描电子显微镜图。

图3是本发明实施例制得的sty/dvb/gmapolyhipe整体柱在放大倍数为5000倍下的扫描电子显微镜图。

图4是本发明实施例中sty/dvb/gmapolyhipe整体柱与hplc-fld联用分离分析孔雀绿色谱图。其中，a是标准隐色孔雀绿的hplc-fld色谱图，b是鱼塘水样品通过整体柱富集后的hplc-fld色谱图，c是鱼塘水样品未经整体柱富集的hplc-fld色谱图。通过定量分析可知，孔雀绿的线性方程为y=8887.278x-2357.19（其中y为峰面积；x为孔雀绿浓度，ng/ml；相对标准偏差r²为0.9992），线性范围为20~400ng/ml，检出限为3.0ng/ml），实际样品的检出限达14pg/ml。

具体实施方式

为更进一步阐释本发明为达到预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳的实施例，对依据本发明提出的一种分离分析大体积环境水样中微量孔雀绿的方法及其应用具体实施方式、方法、步骤、特征及其功效，详细说明如后。

实施例：

(1)sty/dvb/gmapolyhipe整体柱的制备

在10ml离心管中，分别加入功能单体苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、交联剂二乙烯基苯、表面活性剂span80，四种物质的体积比为6:3:3:4，用涡旋振荡器搅拌均匀，形成有机相；配制0.02g/ml的过二硫酸钾水溶液，该水溶液不仅作为材料的水相，也作为引发材料聚合的引发剂。将水相逐渐加入有机相中，每次加入0.2ml，加入后均用涡旋搅拌机搅拌均匀，直至加入的水相体积占水相和有机相总体积的比为92%，得到高内相乳液。取1.0ml制备好的高内相乳液，加入到2ml预填充有玻璃纤维丝且内表面粗糙的针管中，填充密实并封口；置于干燥箱中60℃下热聚合24小时，即制得sty/dvb/gmapolyhipe整体柱。反应过程简要示意图如图1所示。将所得sty/dvb/gmapolyhipe整体柱用水、乙醇轮流多次洗涤，除去所含的其他杂质，直至洗脱液上机测定无杂峰为止。所得sty/dvb/gmapolyhipe整体柱的表面显微结构如图2所示。

(2)sty/dvb/gmapolyhipe整体柱萃取富集孔雀绿

将sty/dvb/gmapolyhipe整体柱上端接上样品溶液，采用蠕动泵输送环境水样品，流速为2.0ml/min，上样体积达300ml。萃取完成后，先用体积比为1:4的pbs与乙腈的混合液清洗杂质，然后采用乙醇-三氯甲烷（体积比为1:1）洗脱富集在整体柱上的孔雀绿，收集洗脱液，采用hplc-fld进行检测。萃取及富集过程如图1所示。

应用实例1—本实施例制得的高内相乳液聚合物整体柱与hplc-fld联用分离分析池塘水中孔雀绿的含量

首先从桂林市郊某鱼塘里内取10l水，静止沉积大颗粒杂质，然后过0.45μm滤膜。取300ml水样，加入3ml甲酸使水样呈酸性，加入3ml0.04mol/l硼氢化钾，充分摇匀，使其还原。通过蠕动泵以2.0ml/min流速通过整体柱；萃取完成后，用pbs与乙腈的混合液（1:4，v/v）清洗整体柱，再用3ml乙醇-二氯甲烷（1:1,v/v）洗脱目标物，收集洗脱液；将洗脱液过0.22μm滤膜，用hplc-fld分析；结果表明，某鱼塘里水中孔雀绿的含量约3.0pg/ml。

应用实例2—本实施例制得的高内相乳液聚合物整体柱与hplc-fld联用分离分析河水中孔雀绿的含量

首先从桂林市区漓江内取河水10l，静止沉积大颗粒杂质，取上清液300ml，过0.45μm滤膜，加入3ml甲酸使水样呈酸性，加入3ml0.04mol/l硼氢化钾，充分摇匀，使其还原。通过蠕动泵以2.0ml/min流速通过整体柱；萃取完成后，用pbs与乙腈的混合液（1:4，v/v）清洗整体柱，再用3ml乙醇-二氯甲烷（1:1,v/v）洗脱目标物，收集洗脱液；将洗脱液过0.22μm滤膜，用hplc-fld分析，所得结果回收率高（见表3），但河水中未检测出孔雀绿的含量。

在上述实例中，是采用鱼塘水、漓江水等样品作为研究对象来证实本发明所制备的sty/dvb/gmapolyhipe高内相乳液聚合整体柱的高萃取富集能力。但以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术内容方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

表1sty/dvb/gmapolyhipe整体柱对孔雀绿和还原型孔雀绿的萃取率（n=3）

表2sty/dvb/gmapolyhipe整体柱-hplc-fld联用分离分析池塘水中孔雀绿的含量结果（n=3）

表3sty/dvb/gmapolyhipe整体柱-hplc-fld联用分离分析漓江水中孔雀绿的含量结果（n=3）