一种水溶性维生素E衍生物的高效液相检测方法与流程

本发明涉及色谱法检测维生素e含量技术领域，尤其涉及一种水溶性维生素e衍生物的高效液相检测方法。

背景技术：

rrr-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯（又称d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯，tpgs）是一种水溶性维生素e衍生物，同时是一种近年来受到广泛关注的、新型peg羧酸酯，由rrr-α-生育酚琥珀酸酯（ves）和聚乙二醇（peg1000）发生酯化反应生成，产物是单酯与双酯的混合物。tpgs既含有亲脂性的维生素e结构，又含有亲水性的peg结构，是一种典型的非离子型表面活性剂。tpgs同时兼具了生育酚与peg的性质与生理活性。1960年，tpgs被发现可以作为增溶剂使用，随后关于其毒性、安全性的报道相继出现。二十世纪80年代开始使用tpgs来治疗维生素e缺乏症，之后越来越多的研究开始关注tpgs的自身特征和应用，特别是作为吸收促进剂、增溶剂、脂溶性药物的转运载体等应用于药物制剂中，可延长药物在体内的半衰期，改善药物在体内的分布并保护药物不受酶和抗体的攻击。tpgs已是fda批准的安全药用辅料，可作为增溶剂、乳化剂、吸收促进剂和渗透促进剂应用于药物传递体系。2005年fda批准了一种治疗尿路上皮癌的tocosol紫杉醇乳剂，其中tpgs用来提高纳米颗粒的载药量、缩短给药时间、降低毒副作用、提高抗癌效率。目前，tpgs已被广泛地运用于食品、药品及化妆品领域。由于单酯与双酯的物理性质存在差异，所以急需找到能对tpgs定量分析的方法以控制产品质量。

现有文献中tpgs的分析方法可分为两类：一类是间接分析方法，即先将tpgs皂化水解为α-生育酚（ve），通过定量分析tpgs中α-生育酚的含量来评价tpgs；另一类是直接对tpgs进行定性定量分析。

美国药典中tpgs的分析方法为间接分析法。首先，在碱性条件下将tpgs水解为α-生育酚，然后使用气相色谱法（gc）以标准α-生育酚为内标物对tpgs中水解得到的α-生育酚进行定量分析。

另外，还有采用高效液相色谱法（hplc）间接定量分析tpgs的文献报道。shen等［shenmt，etal.influenceofmicellesolubilizationbytocopherylpolyethyleneglycolsuccinate(tpgs)onsolubilityenhancementandpercutaneouspenetrationofestradiol.j.ofcontrolledrelease.2003.88(3):p.355-368.］报道了以维生素e醋酸酯为内标定量分析tpgs皂化后生育酚含量的hplc方法，所采用的固定相为c8色谱柱，流动相为95/5(v/v)的甲醇/10mm磷酸水溶液，流速为1ml/min，紫外检测器的波长为284nm。wang等［wangjy，etal.lcseparationandquantificationoftocopherylpolyethyleneglycolsuccinateandtocopherylacidsuccinateintpgsreactionmixture.j.ofchromatographia.2009.70(3-4):p.551-555］将tpgs在碱性条件下皂化为α-生育酚后，以c18色谱柱为固定相，甲醇为流动相，采用hplc方法定量分析α-生育酚。

间接分析tpgs的分析方法步骤多，操作复杂，使用不方便。同时，碱性条件下，tpgs双酯也会水解为α-生育酚，无法由水解后α-生育酚的浓度推算出tpgs中单酯与双酯的具体含量，因此间接分析tpgs的分析方法不能区分tpgs单酯（mono-tpgs）与双酯（bis-tpgs），无法实现tpgs单双酯的定量分析。

bernard等［bernardbl，wuhw.tocopherylpolyethyleneglycolsuccinatearticlesandprocessforpreparingtpgsarticles.wo2005/042510.］报道了一种以intersilc8色谱柱（4.6mmｘ150mm，5μm）为固定相、乙腈/异丙醇（50/50(v/v)，a）与去离子水（b）为流动相、洗脱方式为梯度洗脱hplc方法定量分析tpgs。紫外检测器波长为280nm，梯度洗脱条件为：0-40min内，由60%a线性增加至100%a；100％a，等度洗脱10min；1min内，由100%a变为60%a。用此分析方法分析eastman公司的tpgs产品，得到了单双酯的含量数据，但未给出详细的定量过程以及对分析方法准确性的验证性结果，并且分析时间较长。

good等［goodrl,etal.directhigh-performanceliquidchromatographicanalysisofd-tocopherylacidsuccinateandderivatives.j.ofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis.2005,39(1-2),p.33-38.］建立了一种以维生素e醋酸醋为内标分析ves及其衍生物的hplc方法。色谱条件如下：色谱柱为反相c18柱（3.3cmｘ4.6mm，3μm），流动相为乙腈/水（90/10，v/v)，分析温度设定为25^oc。流速为1.3ml/min，紫外检测波长为205nm。此方法可实现ves与tpgs单酯的分离，但只对ves进行了定量分析，对tpgs单酯仅进行了定性分析，文中未提及tpgs双酯。

常银子等［常银子,etal.水溶性维生素e的合成工艺研究安徽大学学报(自然科学版)，2010,34(5),p.79-84.］报道了一种以ymc-carotenoidc30色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)为固定相、乙腈（a）与异丙醇（b）为流动相、洗脱方式为梯度洗脱hplc的双波段方法定量分析tpgs。紫外检测器波长为292nm（tpgs）及284nm(peg)，柱温35℃，流速1.5ml/min。梯度洗脱条件为：65%a、35%b，洗脱时间为10min；50%a、50%b，洗脱时间为10min；35%a、65%b，洗脱时间为10min。用此分析方法分析所合成的tpgs产品，得到了总体tpgs的含量数据，但未给出详细的定量过程以及对分析方法准确性的验证性结果，且未提及tpgs单双酯的测定，同时使用的色谱柱也较昂贵，限制了该方法的应用。

综合以上tpgs的间接与直接分析方法可知，尽管tpgs早在1950年就合成成功，但其定量分析问题一直没有得到解决。可能的原因如下：（1）tpgs单双酯均为具有一定分子量分布的聚合物，不同的原料来源与生产工艺可能会造成tpgs产品的分子量分布不同，分子量分布对定量分析结果的影响是未知的；（2）tpgs单双酯的分离较困难，市场上没有tpgs单酯与双酯的纯品出售；（3）聚合物的定量分析具有一定的难度。所以建立简单直接的定量分析方法对于确定tpgs的组成，完善tpgs的质量管理，方便其性能评价有重要意义。

技术实现要素：

为了解决现有技术中无法对ves和peg发生酯化反应后的各组分进行定量分析的问题，本发明的目的是提供一种水溶性维生素e衍生物的高效液相检测方法，该方法不仅能定量测定tpgs单酯、双酯的具体含量，也可以测出ves和peg酯化产物中杂质的含量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种水溶性维生素e衍生物的高效液相检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

s1，配制不同浓度的tpgs单酯、tpgs双酯、α-生育酚、α-生育酚琥珀酸酯标准溶液；

s2，配制样品溶液；

s3，将s1中的标准溶液、s2中的样品溶液依次注入液相色谱仪，其中流速为1.0ml/min，柱温为35℃，流动相为乙腈、异丙醇的混合液。

其中，所述s1和s2中配制溶液所用的溶剂为乙醇。

其中，所述s3中液相色谱仪采用的色谱柱为diamonsilplusc18色谱柱，检测器为紫外检测器，检测波长为284nm。

其中，所述s3中的流动相采用梯度洗脱，90/10(v/v)的乙腈/异丙醇洗脱10min，40/60(v/v)的乙腈/异丙醇洗脱16min，90/10(v/v)的乙腈/异丙醇洗脱10min。

采用上述的梯度洗脱方式，可以实现ves和peg酯化产物中所有组分全部分开，根据各自峰面积来计算对应的含量，实现真正意义上的定量检测；上述流动相的配比及各配比下的洗脱时间是技术人员经过长期反复的实验摸索出来的，配比不同或洗脱时间不同均会导致全组分无法完全分开。

与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明水溶性维生素e衍生物的高效液相检测方法是国内首个关于ves和peg酯化产物进行全成分检测的方法，克服了传统检测方法中只能进行定性检测，或只能检测部分成分，而不能进行全成分检测的缺陷，具有重要的工业应用价值和现实意义；本发明水溶性维生素e衍生物的高效液相检测方法不仅能够准确分析tpgs单酯与双酯的含量，还可以检测出tpgs产品中残留的ve及ves含量，便于直观地进行检测和控制产品质量；本发明水溶性维生素e衍生物的高效液相检测方法具有较高的灵敏度和精确度，检测限低，重现性好，回收率高；本发明水溶性维生素e衍生物的高效液相检测方法采用的高效液相色谱柱为常规的c18色谱柱，价格相对便宜，而且样品分析时间较短，大大降低了检测成本，使得本发明的检测方法具有广泛的应用前景。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：

图1为样品161201溶液高效液相色谱图；

图2为样品1705005溶液高效液相色谱图；

图3为tpgs单酯标准溶液的高效液相色谱图；

图4为tpgs双酯标准溶液的高效液相色谱图；

图5为tpgs单酯的标准曲线，横坐标为tpgs单酯浓度，纵坐标为tpgs单酯色谱峰的峰面积；

图6为tpgs双酯的标准曲线，横坐标为tpgs双酯浓度，纵坐标为tpgs双酯色谱峰的峰面积。

具体实施方式

一、检测设备

高效液相色谱仪（岛津spd-20a/lc/20ad）。

二、检测试剂

乙腈：德国merckhplc；

异丙醇：德国merckhplc；

标准品：tpgs单酯、tpgs双酯均通过模拟移动床（smb）色谱系统获得的纯品；α-生育酚、α-生育酚琥珀酸酯均为市面上购买的纯品。

三、检测方法

1.标准溶液和样品溶液的制备

（a）通过模拟移动床（smb）色谱系统分别获得tpgs单酯和双酯纯品，分别称量tpgs单酯和双酯纯品，用无水乙醇溶解，转移至容量瓶，并用无水乙醇定容，获得tpgs单酯和双酯标准溶液，储存于-20℃冰箱内，供3个月内使用；

（b）α-生育酚标准溶液的制备

称取α-生育酚对照品，用无水乙醇溶解，转移至容量瓶，并用无水乙醇定容，获得α-生育酚标准溶液。

（c）α-生育酚琥珀酸酯标准溶液的制备

称取α-生育酚琥珀酸酯对照品，用无水乙醇溶解，转移至容量瓶，并用无水乙醇定容，获得α-生育酚琥珀酸酯标准溶液。

（d）样品溶液的制备

称取样品，用无水乙醇溶解，转移至容量瓶，并用无水乙醇定容，获得样品溶液。

2、高效液相色谱检测条件

色谱柱：diamonsilplusc18色谱柱，250x4.6mm,5μm；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃；

检测器：spd-20a紫外检测器，检测波长：284nm；

进样量：20μl；

流动相：梯度洗脱，90/10(v/v)的乙腈/异丙醇洗脱10min，40/60(v/v)的乙腈/异丙醇洗脱16min，90/10(v/v)的乙腈/异丙醇洗脱10min。

一种水溶性维生素e的高效液相检测方法，包括以下步骤：

s1，走基线，待基线走稳后开始进样；

s2，将tpgs单酯、tpgs双酯标准溶液配制5个不同浓度，α-生育酚、α-生育酚琥珀酸酯标准溶液配制1个浓度，分别进样，以标准溶液浓度对峰面积做标准曲线，满足线性关系r≥0.9990，否则需调整浓度范围；

s3，将样品溶液注入液相色谱仪，根据对照品的保留时间定性样品中各组分对应的色谱峰，根据样品的峰面积，以外标法分别计算样品中tpgs单酯、tpgs双酯、α-生育酚、α-生育酚琥珀酸酯的量，计算公式如下：

y=a×ws×x/as

其中：

y为样品中各组分的测得量；

a为样品色谱图中各组分的峰面积；

ws为对照品的称样量；

x为各对照品的含量；

as为各对照品的峰面积。

实施例1

将本公司批号为161201的水溶性维生素e衍生物按照上述方法进行检测，结果如图1所示，通过计算，获得各组分的含量：tpgs单酯含量为78.69%，tpgs双酯含量为20.58%，α-生育酚的含量为0.15%、α-生育酚琥珀酸酯的含量为0.05%。

实施例2

将本公司批号为170505的水溶性维生素e衍生物按照上述方法进行检测，结果如图2所示，通过计算，获得各组分的含量：tpgs单酯含量为84.6%，tpgs双酯含量为15.8%，α-生育酚的含量为0.08%、α-生育酚琥珀酸酯的含量为0.09%。

实施例3

取同一样品配制不同的浓度，制备样品溶液，分别测得峰面积，考察样品浓度与峰面积的线性关系，结果见表1所示。

表1

通过表1可以看出，tpgs单酯、tpgs双酯在153mg/25ml～251mg/25ml浓度范围内其浓度和峰面积呈现线性关系。

实施例4

取同一样品溶液，每天进样6次，连续进样三天，分别测得峰面积，结果见表2所示。

表2

通过表2可知，本发明的检测方法在测量同一样品时，rsd≤0.3%，重复性好。

实施例5

取同一批号的样品，制备6份样品溶液，分别测得峰面积，结果如表3所示。

表3

从表3中可以看出，本发明的检测方法重现性好。

实施例6

取已知含量样品及对照品，配成供试品溶液三份，分别进样，记录色谱图，按峰面积计算单双酯的量并与理论量进行比较，计算回收率，结果如表4所示。

表4

如表4所示，测得回收率均大于99.5%，表明本发明的检测方法回收率高，准确度高。

上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示方法的所作的任何等同变更或修饰，均纳入本专利包括的范围。