一种空白生物样品的制备方法与流程

本发明涉及生物样品制备工艺领域，具体地涉及一种从生物样品中去除内源性维生素并保有原生物特性的空白生物样品的制备方法。

本发明可以快速、高效地去除对待测物检测造成干扰的内源性待测物，且保有生物样品本身的基质环境，为定量分析过程中建立标准曲线提供一种不含待测物且生物特性与待测样本接近的空白生物样品。

背景技术：

维生素类化合物，包含脂溶性维生素如维生素a、d、e、k，以及水溶性如维生素b族何维生素c。尽管不同的维生素的化学结构和生物活性各不相同，但是它们均在人体的新陈代谢过程中发挥着至关重要的作用。如维生素a，又名视黄醇，是具有人体维持正常视觉功能不可缺少的营养素，维生素d，是人体骨骼发育生长以及钙磷代谢中的重要组成，维生素e则是人体有利的抗氧化剂，能够清除自由基，防止细胞膜发生脂质过氧化，改善血液循环。因此，在临床检测及科研领域，对各种维生素含量的监测以及其含量与疾病发生发展的关联一直备受关注。尤其是脂溶性维生素，由于其在人体内比水溶性维生素储存时间长、变异小，所以检测这类物质的水平更能反映一段时间内人体的营养状况以及对疾病的筛查。

对于人体内源性维生素的检测，目前主要应用质谱法或色谱法时，必然面临建立标准曲线的问题。当待测样本为血清，检验要求建立标准曲线也应该使用血清或类似基质，而内源性含量很高的维生素本身对此类检测方法就会造成很大的干扰，不能在需要覆盖的检测浓度范围内得到准确的测定结果。因此，生物样品基质不能直接作为建立标准曲线的对象，必须对其进行预处理去除内源性物质维生素，而同时也要尽量减少处理过程对于生物样品基质的破坏，以保证处理得到的空白生物样品仍与待测生物样品有类似的生物特性。

因此，对于应用色谱法、质谱法检测生物样品中的维生素类化合物，亟需开发一种能够快速有效地去除内源性维生素的制备方法，同时保有生物样品本身的生物理化特性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够快速有效地从生物样品中去除内源性维生素并保有原生物特性的空白生物样品制备方法，及其制备的空白生物样品和用制备的空白生物样品进行分析的仪器分析方法。

本发明的第一方面，提供一种空白生物样品的制备方法，包括步骤：

(1)提供一种水解试剂；

(2)用所述的水解试剂对生物样品进行水解，从而使生物样品中的内源性维生素由结合态维生素转化为游离态，从而得到预处理生物样品；

(3)在所述的预处理生物样品中加入维生素吸附剂对样品中的维生素进行结合，从而得到含有吸附剂-维生素复合物的固液混合物；

(4)对固液混合物中的吸附剂-维生素复合物进行分离，得到所述的空白生物样品，其中，所述的空白生物样品中不含有内源性维生素。

在另一优选例中，所述的空白生物样品可作为与待测样本生物样品类似的基质，用于临床定量检测维生素类待测物。

在另一优选例中，所述的不含有内源性维生素指样品作为仪器检测的空白样品时，样品中维生素含量低于该仪器的检测限。

在另一优选例中，所述的生物样品为血清或血浆。

在另一优选例中，所述的生物样品为人血清或人血浆。

在另一优选例中，所述的水解试剂选自下组：酸性物质、碱性物质。

在另一优选例中，所述的酸性物质选自下组：甲酸、盐酸、乙酸，或其组合。

在另一优选例中，所述的碱性物质选自下组：氨水、氢氧化钠，或其组合。

在另一优选例中，所述的水解试剂占生物样品体积的0.1～5％；

在另一优选例中，所述的水解试剂占生物样品体积的为0.5％～1％。

在另一优选例中，所述的维生素吸附剂为具有纳米孔径物质；优选地，所述的维生素吸附剂选自下组：活性炭、硅胶、碳分子筛、沸石、树脂，或其组合。

在另一优选例中，所述的吸附材料为活性炭。

在另一优选例中，所述的维生素吸附剂占预处理生物样品的重量比例为1％～10％；优选地，所述的维生素吸附剂占预处理生物样品的重量比例为4％～8％。

本发明的第二方面，提供一种空白生物样品，所述的空白生物样品通过第一方面所述的制备方法制备。

在另一优选例中，所述的空白生物样品为血清或血浆。

在另一优选例中，所述的空白生物样品为人血清或血浆。

在另一优选例中，所述对空白生物样品中不含有维生素。

本发明的第三方面，提供一种仪器分析方法，所述的方法包括步骤：用第一方面所述的方法制备得到空白生物样品；和用所述制备得到的空白生物样品进行分析。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1生物样品(以血清为例)中去除内源性维生素的制备工艺示意图。

图2不经处理和传统吸附处理的血清中维生素信号峰面积。

图3氨水水解、甲酸水解和盐酸水解的血清中维生素信号峰面积。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，得到了一种高效快速地处理生物样品，得到不含维生素的空白生物样品的制备工艺。本发明的制备工艺采用酸性或碱性条件先将生物样品中的结合态维生素转化为游离态维生素，再进行常规的维生素去除步骤，得到不含维生素(特别是内源性维生素)的空白生物样品。基于上述发现，发明人完成了本发明。

空白生物样品的制备

现有的质谱或色谱分析方法中，标准曲线的建立常常受到空白样品中内源性维生素的干扰。由于生物样品中的维生素不仅以游离形式存在，还有部分以内源性形式存在，因此，现有的处理方法不能完全去除内源性维生素。对此，本发明提供了一种从生物样品中去除内源性待测物而保留原生物样品生物特性的工艺，可以用于生物样品中维生素类化合物的去除。此方法基本流程如下：

a)生物样品中维生素类化合物的水解释放；

b)利用吸附材料吸附游离出的维生素类化合物；

c)将吸附材料与吸附后生物样品离心分离，获得空白生物样品。

具体地，所述的方法包括步骤：

(1)提供一种水解试剂；

(2)用所述的水解试剂对生物样品进行水解，从而使生物样本中的内源性维生素由结合态维生素转化为游离态，从而得到预处理生物样品；

(3)在所述的预处理生物样品中加入维生素吸附剂对样品中的维生素进行结合，从而得到含有吸附剂-维生素复合物的固液混合物；

(4)对固液混合物中的吸附剂-维生素复合物进行分离，得到所述的空白生物样品，其中，所述的空白生物样品中不含有内源性维生素。

本发明的方法可以用于常规仪器检测方法中常用的空白生物样品的制备，在优选的实施例中，所述的生物样品为血清或血浆，如人血清或人血浆。

在本发明的方法中，所述的水解试剂应当选择能够使内源性维生素充分释放，同时不会破坏生物样品本身的生化特性的试剂，例如提供适宜的酸性或碱性条件的试剂。在本发明的优选实施方式中，所述的水解试剂可以是选自下组的酸性物质：甲酸、乙酸、盐酸，或其组合。或者选自下组的碱性物质：氨水、氢氧化钠，或其组合。

所述的水解试剂用量应当控制在能够使内源性维生素充分释放，同时不会破坏生物样品本身的生化特性的范围内。在本发明的优选实施方式中，所述的水解试剂占生物样品体积的0.1～5％；更优选地为0.5％～1％。

所述的维生素吸附剂没有特别的限制，可以是本领域常用的具有纳米孔径物质；优选地，所述的维生素吸附剂选自下组：活性炭、硅胶、碳分子筛、沸石、树脂，或其组合，更优选地为活性炭。

所述的维生素吸附剂的用量应当控制在适于分离同时能够完全去除样品中维生素的范围内。该用量可以根据样品本身的性质进行调整，一个优选实施方式中，所述吸附剂占预处理生物样品的重量比例为1％～10％；优选地，所述的维生素吸附剂占预处理血清的重量比例为4％～8％。

本发明应用于去除生物样品中的内源性维生素类化合物有以下几个优点：首先，本发明采用了酸性或碱性条件先对维生素结合蛋白进行水解，使维生素类物质全部处于游离状态，彻底排除了维生素类化合物在生物样品中的结合存在形式。此外，通过水解试剂占所需处理的血清的比例经过优化，使水解过程对血清的破坏尽量降低。

其次，在吸附去除步骤，吸附材料的用量和所使用的孔径大小经过优化，可以减少吸附过程对于生物样品的损失，提高制备效率。

最后，在离心除去吸附材料的过程中，离心转速经过优化，以不破坏血清基质的情况下，使用较高的转速，提高每次离心去除的活性炭量，可以减少离心的次数，在2～3次离心以后，即可去除肉眼可见的吸附材料。

一种优选的方法中，所述的制备方法包括步骤：

(1)取一定体积的需处理的血清，加入占其体积0.1％～1％的酸性或碱性物质作为维生素结合蛋白的水解试剂，根据所用水解试剂酸碱度的不同，所需的体积也略有不同。水解试剂需要与血清均匀混合，并37℃孵育10分钟，得到预处理的血清，内源性维生素以游离形式存在。

(2)在(1)获得的预处理血清中加入占其体积1％～10％的活性炭物质，根据活性炭孔径的不同，所需用量略有差别。活性炭需要与血清充分混合接触，并37℃孵育1小时，得到去除了所有游离维生素的固液混合血清。

(3)从(2)获得的固液混合血清通过高速离心，可去除固体活性炭，离心转速为10000～15000转/分钟，该离心速度下需要在一次离心后将上清取出再次离心，此步骤重复2～3次，可见上层肉眼可见的活性炭逐渐去除干净。

本发明的主要优点

(1)本发明的制备工艺考虑到维生素在人生物中的不同存在形式，包括游离型和蛋白结合型。首先采用水解试剂使与蛋白质结合的维生素发生分离，使全部的维生素游离释放出来，再有吸附材料吸附去除，比仅用吸附材料吸附的工艺更能有效地去除全部存在形式的维生素。

(2)本发明的制备工艺，通过质谱检测，去除生物样品中的维生素类化合物的效率很高，且对于生物样品中的蛋白分布等生物特性没有明显的破坏。

(3)本发明的制备工艺步骤少，操作简单，所用试剂廉价易得，因此，非常值得推广应用。

应用

本发明的制备工艺可用于生物样品如血清或血浆中的内源性维生素类化合物的去除，是一种快速、有效地制备空白生物样品的生产工艺，可以为定量检测生物样品中维生素类化合物建立标准曲线，提供合适的空白生物样品。为维生素这类化合物在临床应用中的准确定量检测提供优势的方法学数据依托，为确定该化合物在体内含量变化与生理功能、疾病的关系提供了有力支持。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1不含维生素类化合物的空白人血清样本的制备工艺

(1)取10ml需处理的血清，加入占其体积0.5％的甲酸作为维生素结合蛋白的水解试剂。水解试剂需要与血清均匀混合，并37℃孵育10分钟，得到预处理的血清，内源性维生素全部以游离形式存在。

(2)在(1)获得的预处理血清中加入占其体积5％的活性炭。活性炭需要与血清充分混合接触，并37℃孵育1小时，得到去除了所有游离维生素的固液混合血清。

(3)从(2)获得的固液混合血清通过高速离心，可去除固体活性炭，离心转速为15000转/分钟，该离心速度下需要在一次离心后将上清取出再次离心，此步骤重复2次，可见上层肉眼可见的活性炭逐渐去除干净。

实验结果

图2和图3显示不同方法处理后血清中维生素信号峰面积，表1显示图2和图3不同方法处理后血清中维生素信号峰面积测定值，并以不经处理的血清中维生素信号峰面积为基准值a，其它处理方法处理后血清中维生素信号峰面积为b，换算成去除效率c，c＝(a-b)/a。

图2，3和表1结果所示，常规方法吸附处理几乎不能除去维生素，碱和酸处理后能够有效除去血清中内源性维生素。

表1不同方法处理后血清维生素的信号峰面积和除去效率

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。