本发明涉及医学检验技术领域，特别涉及一种组合试剂及其应用及含有该组合试剂的试剂盒。
背景技术：
碱性磷酸酶(alp)属磷酸单酯水解酶，是一组特异的磷酸酯酶。该酶广泛分布于人体组织和体液，以骨、肝、乳腺、小肠、肾中含量较高，正常人血清中碱性磷酸酶主要由骨细胞产生，小部分来自肝，经肝胆系统进行排泄。所以当alp产生过多或排泄受阻时，均可使血中alp发生变化，alp测定主要是用于诊断肝胆和骨骼系统疾病，是反映肝外胆道梗阻、肝内占位性病变和佝偻病的重要指标。
碱性磷酸酶偏高可分为生理性升高和病理性升高，生理性升高即儿童骨骼发育期、孕妇和骨折愈合期，骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，测定结果偏高；病里性升高常见于(1)骨骼疾病：如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等；(2)肝胆疾病如肝外胆道阻塞、肝癌、肝硬化、胆汁淤积性肝炎等；(3)其他疾病：如甲状旁腺机能亢进。
目前，碱性磷酸酶测定试剂盒的检测方法主要是以4-硝基苯磷酸钠(4-npp)为基质的动力学法，该方法为国际临床化学协会推荐方法，其原理是以4-硝基苯磷酸钠为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)为磷酸酰基的受体，在碱性环境下(ph10左右)，alp催化4-npp水解产生黄色的对硝基酚，对硝基苯酚的生成速率与血清中碱性磷酸酶活性成正比，根据405nm处吸光度增高速率从而计算alp活性单位。
生化试剂开瓶后的衰变现象是检验工作中的常见问题，试剂的衰变可导致检测结果出现趋势性变化，当衰变程度超过试剂厂家设定的范围或期限时则视为失效，因此试剂开瓶稳定性成为影响试剂效期和检测结果日间变异的重要因素。对于中小规模的医院来说，由于其样本量较少，需要较长时间才用完一瓶试剂，因此对试剂的开瓶稳定性要求更高。然而，现目前传统碱性磷酸酶测定试剂开瓶稳定性几乎都不理想，质控品一般能稳定13天左右，样本稳定6天左右，不能满足临床检测需求。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种组合试剂及其应用及含有该组合试剂的试剂盒。本发明提供的试剂组合物达到改善试剂开瓶稳定性目的，且准确度高、重复性好、线性范围宽、抗干扰能力强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测碱性磷酸酶的组合试剂，包括组分a和组分b；
所述组分a包括酸碱缓冲对、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、镁离子；
所述组分b包括4-硝基苯磷酸钠。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的所述组分a中所述酸碱缓冲对为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲对或碳酸钾-碳酸氢钾缓冲对。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的所述组分a中还包括水。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的所述组分a还包括锌离子、n-β-羟基乙基乙二胺三乙酸、防腐剂中的一种或两者以上的混合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的所述组分a的ph值为9.0～11.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的所述组分b还包括水。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的所述组分b还包括防腐剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量份计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～10份
水90～99.5份
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量份计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～10份
防腐剂0.05～1.0份
水89～99.45份
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量份计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～10份
防腐剂0.05～1.0份
水89～99.45份
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量份计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～5份
防腐剂0.05～0.5份
水94.5～99.45份
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量份计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～5份
防腐剂0.05～0.5份
水94.5～99.45份
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组分a与所述组分b的质量比为4:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组分a中的水的质量份为70.7～98.69份；所述组分b中的水的质量份为90～99.5份。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量百分含量计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～10％
水90～99.5％
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量百分含量计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～10％
防腐剂0.05～1.0％
水89～99.45％
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量百分含量计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：
4-npp0.5～5％
防腐剂0.05～0.5％
水94.5～99.45％
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量百分含量计，包括如下组分：
所述组分a包括：
所述组分b包括：4-npp0.5～10％
防腐剂0.05～1.0％
水89～99.45％
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合试剂的以质量百分含量计，包括如下组分：
所述组分b包括：4-npp0.5～5％
防腐剂0.05～0.5％
水94.5～99.45％
所述组分a与所述组分b的质量比为2～5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述酸碱试剂可以为hcl或h2so4。
在本发明的一些具体实施方案中，所述锌离子为可溶性锌盐，具体可以为硫酸锌、氯化锌中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述镁离子为可溶性镁盐，具体可以为氯化镁、硫酸镁、硝酸镁中的一种或多种。
本发明还提供了所述组合试剂在制备碱性磷酸酶的检测工具中的应用。
本发明还提供了一种检测碱性磷酸酶的试剂盒包括所述组合试剂。
在本发明的一些具体实施方案中，待测样本与本发明提供的组合试剂的质量比为1：(40-60)。
本发明提供了一种检测碱性磷酸酶的组合试剂，包括组分a和组分b；所述组分a包括酸碱缓冲对、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、镁离子；所述组分b包括4-硝基苯磷酸钠。
本发明中，amp是指2-氨基-2-甲基-1-丙醇，hedta是指n-β-羟基乙基乙二胺三乙酸，4-npp是指4-硝基苯磷酸钠。开瓶稳定性试验表明：传统试剂：开瓶稳定性，质控品能稳定13天，样本稳定6天；本发明试剂盒中的试剂：开瓶稳定性，质控品能稳定23天，样本稳定15天。其他性能指标与现售试剂一致，准确性高，精密度好，线性范围宽，抗干扰能力强，长期稳定性能稳定1年。
准确度试验表明，本发明提供给的试剂盒的测定结果与靶值偏差符合《碱性磷酸酶测定试剂盒(npp底物-amp缓冲液法)行业标准》要求，说明本发明试剂准确性好。
重复性试验结果表明，本发明提供的试剂盒中试剂的变异系数cv为＜5％，符合《碱性磷酸酶测定试剂盒(npp底物-amp缓冲液法)行业标准》要求，且小于传统试剂变异系数，说明本发明试剂盒重复性好。
线性范围检测结果表明，线性高限均能做到1000u/l，相对偏差小于10％，符合《碱性磷酸酶测定试剂盒(npp底物-amp缓冲液法)行业标准》要求，且线性高限大于标准要求750u/l，说明本发明试剂盒线性范围宽，适用范围广。
试剂干扰试验表明：vc1.0g/l、血红蛋白5g/l、乳糜tg24mmol/l、胆红素800μmol/l对试剂测定均无干扰，说明本发明试剂盒抗干扰能力强。
具体实施方式
本发明公开了一种组合试剂及其应用及含有该组合试剂的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种组合试剂及其应用及含有该组合试剂的试剂盒中所用试剂及原料均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为9.0；按体积比，组分a：组分b＝2:1。
实施例2：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为11.0；按体积比，组分a：组分b＝3:1。
实施例3：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为9.5；按体积比，组分a：组分b＝4:1。
实施例4：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为10.5；按体积比，组分a：组分b＝5:1。
实施例5：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为10.0，按体积比，组分a：组分b＝4:1。
实施例6：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为10.0；按体积比，组分a：组分b＝4:1。
实施例7：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为10.0；按体积比，组分a：组分b＝2:1。
实施例8：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为10.0；按体积比，组分a：组分b＝5:1。
对比例1：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为10.0；按体积比，组分a：组分b＝4:1。
对比例2：碱性磷酸酶测定试剂盒试剂配制
其中，组分a的ph为10.0；按体积比，组分a：组分b＝4:1。
实施例11：碱性磷酸酶测定试剂盒检测方法
1.仪器：具有波长为405nm的全自动生化分析仪或半自动生化分析仪。
2.参数设置及操作
方法：速率法主波长：405nm副波长：505nm
反应温度：37℃反应时间：10min
样本测定具体操作方法为：样本先与试剂组分a37℃温育5分钟，再加入组分b试剂37℃温育1分钟后，测定初始吸光度，然后准确测定平均每分钟吸光度变化率(δa/min)。
其中，按体积比，组分a：组分b＝2～5:1，(组分a+组分b):样本＝40～60:1。
3.计算公式
式中：
δau/min―样本吸光度变化率；δac/min―校准品吸光度变化率；cc――校准品浓度。
操作步骤：
1)按照试剂参数在仪器上进行设定，将试剂放入仪器，选择两点校准，点击开始按钮；
2)质控品及样本测定：将质控品或样本放于仪器样本架上，在仪器工作界面编辑样本测试项目及测试数，点击开始按钮。
实施例12：碱性磷酸酶测定试剂盒开瓶稳定性实验
1.取生化质控品水平1和2，按照规定体积加纯化水复溶后分装保存于-20℃，用于试剂开瓶稳定性观察。
2.取10例临床样本，小体积分装保存于-20℃，用于试剂开瓶稳定性观察。
3.取实施例1至5提供的碱性磷酸酶测定试剂盒按照上述方法进行校准后，测定质控品及10例临床样本，试剂开口放于仪器上，测定质控品及临床样本，以偏差10％为控制线，观察试剂开瓶稳定性。
实施例1至8提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据见表1～表8。
表1实施例1提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
表2实施例2提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
表3实施例3提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
表4实施例4提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
表5实施例5提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
表6实施例6提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
表7实施例7提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
表8实施例8提供的试剂盒测定质控品的开瓶数据
实施例1至8提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据见表9～表16。
表9实施例1提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
表10实施例2提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
表11实施例3提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
表12实施例4提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
表13实施例5提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
表14实施例6提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
表15实施例7提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
表16实施例8提供的试剂盒测定临床样本的开瓶数据
碱性磷酸酶测定试剂盒进行上述开瓶稳定性试验，结果与实施例1～8制备的碱性磷酸酶测定试剂盒结果相近，无显著差异(p＞0.05)，质控品能稳定23天，临床样本稳定15天。
对比例1试剂盒检测质控品结果见表17：
表17对比例1试剂盒检测质控品结果
对比例1试剂盒检测临床样本结果见表18。
表18对比例1试剂盒检测临床样本结果
对比例2提供的试剂盒检测质控品结果见表19：
表19对比例2提供的试剂盒检测质控品结果
对比例2提供的试剂盒检测临床样本结果见表20：
表20对比例2提供的试剂盒检测临床样本结果
传统试剂盒检测质控品结果见表21：
传统试剂盒检测临床样本结果见表22：
结论：本发明碱性磷酸酶测定试剂盒开瓶稳定性均优于传统试剂，质控品能稳定23天，临床样本稳定15天；传统试剂开瓶稳定性质控稳定13天，样本只能稳定6天。
实施例13：实施例5碱性磷酸酶测定试剂盒其他性能评价
1.准确度：测定碱性磷酸酶质控品，重复测定3次，计算测定值与靶值偏差。见表23：
表23准确度评价结果
结论：由以上结果看出，测定结果与靶值偏差＜10％，符合《碱性磷酸酶测定试剂盒(npp底物-amp缓冲液法)行业标准》要求，说明本发明试剂准确性好。
2.重复性实验：以常规临床样本作为待测样品，用传统试剂及本发明实施例5制得的试剂盒中试剂重复测定10次，计算变异系数cv％。见表24：
表24重复性评价结果
结论：由以上结果可见，本发明实施例5提供的试剂盒中试剂的变异系数cv为0.74％，0.29％，＜5％，符合《碱性磷酸酶测定试剂盒(npp底物-amp缓冲液法)行业标准》要求，且小于传统试剂变异系数，说明本发明试剂盒重复性好。
3.线性范围检测：取碱性磷酸酶浓度接近1000u/l血清高值，稀释成5个不同的浓度(xi)，用本发明实施例5提供的试剂盒中的试剂按照检测方法每个浓度测定3次，计算平均值(yi)。以xi为自变量，以yi为因变量求出线性回归方程，计算线性回归相关系数r；将xi代入线性回归方程，计算yi的估算值及yi与估算值的偏差。见表25：
表25线性范围检测结果
结论：线性相关系数r为1.00，大于0.99；25-100u/l范围内，绝对偏差为1.07u/l，小于10u/l，100-1000u/l范围内，相对偏差小于10％，符合《碱性磷酸酶测定试剂盒(npp底物-amp缓冲液法)行业标准》要求，且线性高限大于标准要求750u/l，说明本发明试剂盒线性范围宽，适用范围广。
4.试剂干扰实验：用基础血清配制vc干扰浓度(g/l)：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0；血红蛋白(g/l)：1、2、3、4、5；乳糜(tgmmol/l)：1000、2000、4000、5000、6000；胆红素(μmol/l)：100、200、400、600、800一系列分析样本，用本发明实施例5提供的试剂盒同时测定不含干扰物质的基础血清和以上一系列分析样本，计算分析样本与基础血清的相对偏差，以10％为干扰控制线，考察试剂盒抗干扰能力。见表26：
表26试剂干扰试验结果
结论：以上结果可见vc1.0g/l、血红蛋白5g/l、乳糜tg24mmol/l、胆红素800μmol/l对试剂测定均无干扰，说明本发明试剂盒抗干扰能力强。
用实施例14的方法对实施例1～4、实施例6～8提供的试剂盒中的试剂进行上述性能评价，结果：
1.准确度，实施例1～4、实施例6～8试剂re/％均<5％，实验结果良好；
2.重复性，实施例1～4、实施例6～8试剂分别为0.81％，0.72％，0.83％，0.78％，0.79％，0.8％，0.81％，均<5％，实验结果均良好；
3.线性，实施例1～4、实施例6～8试剂线性高限均能做到1000u/l，实验结果良好；
4.干扰，实施例1～4、实施例6～8试剂，vc1.0g/l、血红蛋白5g/l、乳糜tg24mmol/l、胆红素800μmol/l对试剂测定均无干扰，说明试剂抗干扰能力强。
上述实施例1～4、实施例6～8的试验结果与实施例5制备的试剂盒中试剂的相应试验结果相近，无显著差异(p＞0.05)。表明：本发明提供的试剂盒的准确度、重复性、线性、抗干扰能力强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。