一种测定肝素类药物重均分子量和含量的方法与流程

本发明属于天然药物化学和质量控制领域，涉及一种测定肝素类药物重均分子量和含量的方法。

背景技术：

肝素(heparin)是一种由葡萄糖胺(glcn)和糖醛酸((d-葡萄糖醛酸(glca)或l-艾杜糖醛酸(idoa))为二糖重复单元组成的线性多糖硫酸脂，肝素分子量范围一般在3-30kda，平均分子量15kda。它作为一种抗凝血、抗血栓生成的药物在临床上已经使用了70多年，迄今为止还没有一种能够完全代替肝素的抗凝血和抗血栓生成药物。肝素还具有如抗炎、抗过敏、降血脂及抗动脉粥样硬化、扩张冠脉、缓解支气管痉挛、降低痰液的粘稠性、促进组织呼吸、抑制病毒活性、抗肿瘤转移以及诱导干扰素的产生等许多新的用途与功效。经研究发现，肝素抗凝血机理是通过催化抗凝血因子iii(atiii)、肝素辅助因子ii等与多个凝血因子形成共价复合物以消除凝血酶活性来实现的。将肝素通过化学法、物理法或酶解法进一步降解可得到低分子肝素。低分子肝素具有可皮下注射、出血可能性低、安全系数高等优点，所以目前低分子肝素是占主导地位的肝素类药物。

伟素(舒洛地特)是另一种重要的肝素类药物，是经过高度纯化的生物制品，由80％快速移动肝素部分和20％硫酸皮肤素两种成分构成，临床实验已证明了伟素的安全性和有效性。该药己被证明对脑血管疾病，心血管疾病，周围动脉疾病，静脉炎后综合征和糖尿病肾病导致的蛋白尿有治疗作用。

肝素类药物的重均分子量和含量是研制糖药物过程中重要测定参数。目前，中国药典中，高效液相凝胶渗透色谱法(gelpermeationchromatography,gpc)是测定分子量的常规做法，其是按照排阻色谱的原理，不同分子量的多糖按照其大小顺序先后流出色谱柱，通过一系列不同分子量标准多糖与保留时间的相关性测得的校正曲线并计算相应的待测多糖的相对分子量。但该常规方法必须要有相应的多糖标准品而有一定的局限性。

此外，多糖和寡糖含量的测定常用方法为硫酸咔唑法，该方法首先以浓度及单糖标准品的显色做标准曲线，再在标准曲线上读出待测样品的含量。但是酸性糖的单糖并没有标准品出售，若以葡萄糖醛酸为标准品，其与酸性糖的结构及显色效率存在差异，不能对酸性糖进行精确定量。

近年来出现的尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(size-exclusionchromatography/multi-anglelaserlightscattering，sec-mals)测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量在业界引起了广泛的关注。18角度激光光散射仪(mals)工作原理是：激光束通过溶液会产生光散射，散射光强度与样品分子量及溶液浓度成正比，不同散射角度的光强及分子尺寸有关，因此在样品池周围不同位置设立多个检测探头(分子量的测量精度与角度数目的平方根成正比)同时接收不同角度的散射光强度信号。依照光散射方程k*c/r(θ)＝1/mwp(θ)+2a2c作zimm图，即可得到大分子的重均绝对分子量mw，均方旋转半径rg及第二维利系数a2。mals和尺寸排阻色谱(sec)联用，不必依赖泵的流速、校正曲线及其他错误的假设，即可直接求的分子量及分子量分布等数据。mals利用色谱柱分离出的样品在不同角度的光散射量，由示差折光(ri)检测器得到洗脱液浓度及dn/dc值计算得到质量，综合两者即可计算出各个切片的分子量。该方法不需标准品校准，克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的相对分子量测定的误差。已有研究者采用这一方法测定了壳聚糖、透明质酸的平均分子量(monicafee,neilerrington,korneliajumel,etal.correlationofsec/mallswithultracentrifμgeandviscometricdataforchitosans.eurbiophysj(2003)32:457～464；sanyahokputsa,korneliajumel,catherinealexander,etal.comparisonofmolecularmassdeterminationofhyaluronicacidusingsec/mallsandsedimentationequilibrium.eurbiophysj(2003)32:450～456)，还有研究者采用该方法对天然中性多糖进行定量，并预测该方法将成为多糖定量的一种常规技术(kit-leongcheong,dingtaowu,jingzhao,etal.arapidandaccuratemethodforthequantitativeestimationofnaturalpolysaccharidesandtheirfractionsusinghighperformancesizeexclusionchromatographycoupledwithmulti-anglelaserlightscatteringandrefractiveindexdetector.journalofchromatographya(2015)1400:98～106)。目前欧洲药典已经采用此方法作为羟乙基淀粉重均分子量及分子量分布的测定方法(europeanpharmacopoeia8.0,p3307-3308,starcheshydroxyethyl)。

综上，sec-mals可以成功测定中性多糖重均分子量及含量。

技术实现要素：

但是，发明人发现，使用sec-mals测定肝素类药物样品时，样品峰后有未知峰，且计算得到肝素类药物的含量不合理。为此，本发明提供了获得一种准确且高效的检测肝素类药物重均分子量和含量的方法，包含以下步骤：

(1)测定肝素类药物样品中金属离子的重量百分含量a；

(2)使用sec-mals测定重均分子量mw1和含量x；

(3)使用以下公式进行计算，分别得到重均分子量和含量：

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到肝素类药物的重均分子量(da)；a为肝素类药物中金属离子的含量；

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量；y为进样的质量；a为肝素类药物中金属离子的含量。

利用本发明提供的测定方法，可以精确测定肝素类药物的重均分子量和含量，成功解决了肝素类药物重均分子量测定偏差大、含量定量不准的问题。本发明为肝素类药物的质量控制提供了理论和实践的基础。

附图说明

图1示出了h型肝素(heparinh，2a)、肝素钠(heparinsodium，2b)、依诺肝素钠(enoxaparinsolium，2c)和那屈肝素钙(nadroparincalcium，2d)的示差图(虚线)、na离子sec-icp-ms图(实线)和ca离子sec-icp-ms图(实线)，具体见图中标注。

具体实施方式

定义

除非另外说明，否则所有的百分数、比例、比率或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术人员所熟知的熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本文所用的术语“dn/dc”指折光指数增量。可使用本领域常用的方法进行测定(刘莉莉等.医用透明质酸钠凝胶的绝对分子量及其分布的测定方法[j]药物分析杂志2013，33(8)，1435-1438)；也可从本领域公开的相关技术文献中查询获得。

本文所用的术语“sec-mals”指尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(size-exclusionchromatography/multi-anglelaserlightscattering)，近年来被广泛应用于测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量，具体测定方法可采用本领域公知的方法(monicafee,neilerrington,korneliajumel,etal.correlationofsec/mallswithultracentrifμgeandviscometricdataforchitosans.eurbiophysj(2003)32:457～464；sanyahokputsa,korneliajumel,catherinealexander,etal.comparisonofmolecularmassdeterminationofhyaluronicacidusingsec/mallsandsedimentationequilibrium.eurbiophysj(2003)32:450～456；kit-leongcheong,dingtaowu,jingzhao,etal.arapidandaccuratemethodforthequantitativeestimationofnaturalpolysaccharidesandtheirfractionsusinghighperformancesizeexclusionchromatographycoupledwithmulti-anglelaserlightscatteringandrefractiveindexdetector.journalofchromatographya(2015)1400:98～106)。

如本文所用，术语“icp-ms”指电感耦合等离子体质谱法(inductivelycoupledplasmamassspectrometry)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点，具体测定方法可采用本领域公知的方法，例如在冯先进，屈太原，电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)最新应用进展(中国无机化学分析.(2011)1:46～52)中所记载的方法。

如本文所用，术语“icp-oes”指电感耦合等离子体发射光谱法(inductivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometer)是本领域用于测定金属离子含量的常用方法。

技术问题的发现

如前所述，在使用现有的sec-mals测定一些肝素类药物样品时，样品峰后有未知峰，且计算得到肝素类药物的含量或纯度不合理，目前也没有针对这一现象的文献和专利解释。通常发生这种现象时，认为是样品在柱子上发生吸附造成含量降低，但是发明人发现，这种情况在使用柱子多次分离后也未得到解决。

本发明的发明人通过研究发现，未知峰归属于肝素类药物结构中的金属离子，因此，肝素类药物的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响，进行校正，即sec-mals测定的重均分子量和含量除以肝素类药物中糖链部分所占的质量分数(1-金属离子含量)得肝素类药物的重均分子量和含量，即采用以下计算公式1、公式2进行校正：

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到重均分子量(da)；a为肝素类药物中金属离子的含量；

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；y为进样的质量(μg)；a为肝素类药物中金属离子的含量。

利用本发明提供的测定方法，可以精确测定肝素类药物的重均分子量和含量，成功解决了肝素类药物重均分子量测定偏差大、含量定量不准的问题。

肝素类药物

肝素是一类结构异常复杂的糖胺聚糖，由糖醛酸和葡萄糖胺以1→4键连接起来的重复二糖单位组成的混合物，是预防手术后血栓形成和治疗急性静脉血栓的首选药物。肝素类似物包括硫酸皮肤素、硫酸软骨素、多硫酸软骨素等糖胺聚胺类药物，这些药物在抗凝血、调血脂和抗肿瘤等方面有很好的应用前景。

分子量不同会影响糖胺聚糖类药物的生物活性，由于受标样缺乏的限制，国内外药典中均未对其分子量测定作出规定。

如前所述，本申请的发明人在测定肝素类药物的分子量时发现测定中的问题是由于金属离子的含量不同所造成的。因此，适用于本申请的方法进行测量的肝素类药物主要是分子中含有以葡萄糖胺和糖醛酸或艾杜糖醛酸为二糖重复单元组成的线性多糖硫酸脂类药物。

在本发明的一些实施方案中，肝素类药物为肝素的可溶性盐，选自肝素的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。在本发明的另一些实施方案中，所述肝素类药物为肝素的钠盐或钙盐。

更具体而言，所述肝素类药物包括但不限于帕肝素钠、舍托肝素钠、亭扎肝素钠、瑞肝素钠、达肝素钠、贝米肝素钠、肝素钠、依诺肝素钠、那屈肝素钙、肝素h、伟素钠，等等。

特别地，肝素类药物的分子量通常为3至18kda之间，肝素的分子量约为15kda，而低分子量的肝素类药物的分子量在4000至8000da之间。。

肝素类药物中金属离子含量的测定

在本发明的一些实施方案中，所述肝素类药物中金属离子含量的测定方法选自：icp-ms、icp-oes、原子吸收或离子色谱法。这些测定方法可以按照本领域的常规操作进行。

电感耦合等离子体质谱法(inductivelycoupledplasmamassspectrometry,icp-ms)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点(冯先进，屈太原.电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)最新应用进展.中国无机化学分析.(2011)1:46～52)。发明人首次尝试将sec与icp-ms联用，成功确认了sec-mals测定肝素类药物样品峰后的未知峰为金属离子，同时能够获得金属离子的种类及含量的相关数据。发明人由此发现了肝素类药物样品进入sec柱分析时发生解离，sec-mals方法得到是解离后不含金属离子的酸性糖的重均分子量和含量，因此肝素类药物的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响，进行校正。

sec-mals方法测定分子量和含量

在本发明中，sec-mals方法用于测定肝素类药物的分子量和含量。在采用sec-mals方法进行解析时，肝素类药物的样品进入sec柱分析时发生解离，由此可知，sec-mals方法得到的是解离后不含金属离子的肝素的重均分子量和含量，因此酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响。

在本发明采用的sec-mals方法中，可以使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可为0.05-0.2ml/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自nh4ac、nacl或na2so4，盐溶液的浓度为0.05-0.2mol/l。

在本发明的另一优选实施方案中，sec-mals测定采用20％甲醇+80％80mmol/lnh4ac作为流动相；其流速为0.1ml/min。

所述色谱柱为能够良好分离2000-30000da多糖的色谱柱；优选包括但不限于如下色谱柱：advancebiosec2.7μm4.6×150mm柱(agilent)；shodexohpaksb-803hq7.8×300mm(shodex)；watersacquityuplc@behsec3.5um7.8×300mm柱；watersacquityuplc@behsec1.7um4.6×150mm柱；tskg3000pwxl7.8×300mm(tosoh)。

在本发明的另一优选实施方案中，所述的测定方法还包括测定肝素类药物的折光指数增量(dn/dc)的步骤。

在本发明的另一优选实施方案中，所述的肝素类药物的折光指数增量(dn/dc)的测定包含以下步骤：

(1)使用与sec-mals测定相同的流动相溶解肝素类药物样品，并将样品稀释，得到0.1mg/ml-2mg/ml浓度区间内的5-6个浓度点的系列溶液；

(2)用示差折光检测器(例如wyatt，optilabt-rex(wtrex-08)分别依次进样流动相、步骤2中制备的样品溶液，并采集信号；

(3)由astra软件计算得到dn/dc。

在本发明的一个实施方案中，肝素类药物的重均分子量和含量测定方法如下：

步骤1：采用icp-ms、icp-oes、原子吸收或离子色谱测定肝素类药物中金属离子的重量百分含量a。

步骤2：测定肝素类药物的dn/dc：

(1)称定恒重的样品，加入流动相溶解，配置成0.1-5mg/ml优选0.2-2mg/ml的系列溶液，该系列溶液的浓度可以是例如0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml；使用醇+盐的溶液作为流动相；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自nh4ac、nacl或na2so4，盐溶液的浓度为0.05-0.2mol/l。

(2)用示差折光检测器(例如wyatt，optilabt-rex(wtrex-08)分别依次进样流动相、所述配制的系列溶液，并采集信号，

(3)由astra软件计算得到dn/dc。

步骤3：sec-mals测定肝素类药物分子量和含量

(1)根据预估待测肝素类药物分子量的范围，选择适合的色谱柱；

(2)配制肝素类药物的梯度溶液，其浓度范围为2-500mg/ml，分3-10个梯度；例如约2、10、50、100、300mg/ml(浓度＝重量/体积)的溶液。

(3)使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可能为0.05-0.2ml/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自nh4ac、nacl或na2so4，盐溶液的浓度为0.05-0.2mol/l，检测器采用十八角激光检测器和示差折光检测器；

(4)使用zimm图用外推法计算得到肝素类药物重均分子量mw1；

(5)使用图谱处理软件计算得到的样品中肝素类药物的质量x；

(6)使用以下公式进行计算，分别得到肝素类药物的重均分子量和含量：

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到的重均分子量(da)；a为肝素类药物中金属离子的含量；

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量；y为进样的质量；a为肝素类药物中金属离子的含量。

sec-mals法测定重均分子量和含量的具体操作条件可以根据常规的实验方案进行。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)对肝素可溶性盐样品sec-mals分析中的未知峰进行解释。

(2)可以精确测定肝素类药物可溶性盐重均分子量和含量，重复性好。

(3)重均分子量和含量可在一次分析中得到，操作简单。

(4)提高了测量肝素类药物可溶性盐的准确性，有助于更准确地研究多糖的分子结构。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例部分所使用的仪器包括：

lc：agilent1260液相色谱仪

十八角度激光检测器：wyattdawnheleosii

示差折光检测器：wyattoptilabt-rex

icp-ms：agilent7900icp-ms

离子色谱：瑞士万通

icp-oes：美国perkin-elmer公司optima7000dv电感耦合等离子发射光谱仪

火焰原子吸收：北京瑞利wfx-120b型火焰原子吸收光谱仪

实施例1sec与icp-ms揭示酸性糖在尺寸排阻色谱的分离机理，并测定肝素、低分子量肝素的重均分子量和含量

样品：肝素钠(heparinsodium)、依诺肝素钠(enoxaparinsolium)、那屈肝素钙(nadroparincalcium)和氢型肝素(heparinh)，将样品配制成溶液。

步骤1：sec-icp-ms测定金属离子出峰位置及含量

(1)使用色谱柱watersacquityuplc@behsec1.7um4.6×150mm柱，80mmol/lnh4ac为流动相，流速0.1ml/min。

(2)将sec与icp-ms联用：将样品溶于水中，浓度0.02mg/ml，进样20ul，采集²³na,⁴³ca,⁴⁴ca的信号。分别配置的浓度为0.1ppm,0.5ppm,1.0ppm,5.0ppm和10.0ppm的na和ca离子标准溶液，并以外标法计算样品中金属离子的含量。a值如表1所示。步骤2：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱watersacquityuplc@behsec1.7um4.6×150mm柱，80mmol/lnh4ac为流动相，流速0.1ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。

实验结果见附图1和表1。

从图1可知，肝素钠和氢型肝素示差图一致，但在示差的倒峰处(因流动性和样品溶剂的影响，在盐峰位置示差图可呈现正峰、倒峰)，氢型肝素无na信号，肝素钠、依诺肝素钠和那屈肝素钙均有na或ca信号，说明氢型肝素不含na，肝素钠、依诺肝素钠和那屈肝素钙在sec柱上发生解离，金属离子延后出峰，这说明sec-mals方法得到是解离后不含金属离子的糖部分的重均分子量和含量，提示为了准确计算出肝素类物质可溶性盐的重均分子量和含量，采用sec-mals方法时，必须考虑肝素类物质可溶性盐中的金属离子进行校正，具体计算见公式1、

公式2。

以上公式(1)中：mw1为sec-mals法直接得到肝素类物质的重均分子量(da)；a为金属离子的含量。

以上公式(2)中：x为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；y为进样的质量(μg)；a为金属离子的含量。

表1：肝素h、肝素钠、依诺肝素钠和那屈肝素钙的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用公式校正；a为na％；b为ca％

从表1可知，肝素钠和氢型肝素的mw1相近，进一步说明sec-mals法直接测得为糖部分的重均分子量；通过icp测定金属离子含量得到a值后，采用上述公式校正，发现二者的差异明显增加；氢型肝素的x/y％接近100％，而肝素钠校正后含量近于100％，进一步表明sec-mals法直接测得为糖部分的含量；同法计算依诺肝素钠和那屈肝素钙的重均分子量和含量。综上，经过校正后，sec-mals可以准确计算出肝素盐和低分子量肝素盐的重均分子量和含量。

实施例2sec-mals测定达肝素钠、伟素钠的重均分子量和含量

样品：达肝素钠(dalteparinsodium)、伟素钠(sulodexide)

步骤1：离子色谱测定金属离子的比例

na离子标准溶液配置为25、10、12.5、6.25、3.125ppm。样品浓度为2mg/ml。离子色谱条件：预柱：metrosepc4guard/4.0；分离柱：metrosepc5-150/4.0；流动相：5mm硝酸的超纯水溶液；流速：0.9ml/min；进样量20ul。以外标法进行金属离子含量的测定。a值如表2所示。

步骤2：测定dn/dc

(1)称定恒重的样品20mg至10ml容量瓶中，加入流动相溶解，振摇，即得母液。分别取母液0.2、0.4、0.8、1.2、1.8ml，用流动相稀释至2ml，得0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml的一系列溶液。

(2)用示差折光检测器(wyatt，optilabt-rex(wtrex-08)分别依次手动进样流动相、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml样品溶液，并采集信号，dn/dc由astra软件计算得到dn/dc如表2中所示。

步骤3：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱tskg3000pwxl7.8×300mm(tosoh)，

300mmol/lnano3为流动相，流速0.2ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验结果如表2所示。

表2达肝素钠和伟素钠的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用实施例1中的公式校正；a为na％从表2可以看出，经过校正，sec-mals可以准确计算出达肝素钠和伟素钠的重均分子量和含量。

实施例3sec-mals测定达肝素钠、贝米肝素钠的重均分子量和含量

样品：达肝素钠(dalteparinsodium)、贝米肝素钠(bemiparinsodium)

步骤1：离子色谱测定金属离子的比例

na离子标准溶液配置为25、10、12.5、6.25、3.125ppm。样品浓度为2mg/ml。离子色谱条件：预柱：metrosepc4guard/4.0；分离柱：metrosepc5-150/4.0；流动相：5mm硝酸的超纯水溶液；流速：0.9ml/min；进样量20ul。以外标法进行金属离子含量的测定，a值如表3所示。

步骤2：测定dn/dc

同实施例2步骤2。dn/dc如表3中列出。

步骤3：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱xbrigesehsecsec3.5um7.8×300mm柱(waters)，300mmol/lna2so4为流动相，流速0.5ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验结果如表3所示。

表3达肝素钠的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用实施例1中的公式校正；a为na％

从表3可以看出，经过校正，sec-mals可以准确计算出达肝素钠和贝米肝素钠的重均分子量和含量。

实施例4sec-mals测定亭扎肝素钠、瑞肝素钠的重均分子量和含量

样品：亭扎肝素钠(tinzaparinsodium)、瑞肝素钠(reviparinsodium)

步骤1：火焰原子吸收法测定金属离子含量：

采集na330.2nm的谱线，配制1mg/l、10mg/l、50mg/l、75mg/l和100mg/l的na标准溶液；样品溶液浓度配制为200mg/l。na离子标准溶液配置为25、10、12.5、6.25、3.125ppm。样品浓度为2mg/ml。a值如表4所示。

步骤2：测定dn/dc

同实施例2步骤2。dn/dc如表4所示。

步骤3：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱shodexohpaksb-803hq7.8×300mm(shodex)，10％甲醇+150mmol/lnacl为流动相，流速0.15ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验结果如表4所示。

表4达肝素钠的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用实施例1中的公式校正；a为na％

从表4可以看出，经过校正，sec-mals可以准确计算出亭扎肝素钠、瑞肝素钠的重均分子量和含量。

实施例5sec-mals测定帕肝素钠、舍托肝素钠的重均分子量和含量

样品：帕肝素钠(parnaparinsodium)、舍托肝素钠(certoparinsodium)

步骤1：icp-oes测定金属离子含量：

采集na的分析谱线，配制1mg/l、5mg/l、10mg/l的na标准溶液；样品溶液浓度配制为20mg/l。a值如表5所示。

步骤2：测定dn/dc

同实施例2步骤2。dn/dc如表5所示。

步骤3：sec-mals测定重均分子量和含量

(1)使用色谱柱advancebiosec2.7μm4.6×150mm柱(agilent)，20％甲醇+150mmol/lnacl为流动相，流速0.1ml/min。

(2)将sec与mals联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中y值为200ug。实验的结果如表5所示。

表5达肝素钠的金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量

y值为200ug；*:采用实施例1中的公式校正；a为na％

从表5可以看出，经过校正，sec-mals可以准确计算出帕肝素钠、舍托肝素钠的重均分子量和含量。