本发明涉及检测试剂制备领域，具体涉及prup3蛋白在制备蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒中的应用。
背景技术：
食物过敏诊断的金标准是双盲安慰剂对照食物激发试验，但该检查需要在专科医生指导下进行，对医院设备和操作人员素质要求较高，具有耗时间、成本高和发生严重过敏反应风险的特点，因此临床上并不常规使用。目前，临床上诊断食物过敏主要基于进食敏感食物后发生急性过敏反应的病史和皮肤试验/血清特异性ige(specificige,sige)检测。皮肤试验，因受操作者技术和所用试剂影响，特异性和敏感性受限，且存在发生过敏反应的风险，使其在临床中的应用大大受限。血清sige检测操作简便、安全，已广泛应用于临床，包括放射性变应原吸附试验、酶联免疫吸附试验和cap变应原检测系统(capsystem)，其中capsystem是目前公认的检测血清sige抗体的金标准。但是，该方法检测的sige是血清中游离的抗体，只有当此抗体与嗜碱性粒细胞和(或)肥大细胞结合，同时遇到过敏原形成“抗原桥”才能发挥生物学效应，即血清sige含量并不能反映此抗体在体内的真实致病作用。因此，sige阳性只能反映机体处于致敏状态，并不能有效评估过敏反应发生的风险。此外，血清sige检测易受到交叉反应的干扰，特异性亦受到影响。
近年来，组分检测在食物过敏中的应用越来越受到关注。由于它不使用常规的变应原粗提物，而是纯的引起致敏的变应原蛋白，因此提高了过敏原检测的特异性。在国外，花生过敏发病率较高，组分检测在该病中的研究较多。研究发现arah2是花生主要致敏蛋白，对该组分致敏提示其进食花生易发生过敏症状。虽然组分检测在花生过敏诊断中非常有价值，但是对其它食物变应原组分的研究数据目前尚有限。
蒿花粉是我国北方地区夏秋季最重要的致敏花粉。除具有典型季节性鼻炎和/或哮喘症状之外，部分蒿花粉症患者进食蔬菜、水果后会发生食物过敏反应。蒿花粉相关食物过敏中，桃是引起过敏反应最常见的食物。由于蒿花粉与食物变应原之间的交叉反应，很多蒿花粉症患者体内可以出现相关食物sige阳性，即食物致敏状态，但进食相关食物无临床过敏症状。检测血清食物sige，并不能有效区分食物致敏和真正过敏的患者。此外，本发明的发明人在前期研究发现磷脂转移蛋白(lipidtransferprotein，ltp)是参与蒿花粉相关食物过敏反应的交叉变应原。由于artv3(蒿花粉ltp)与桃主要致敏组分prup3蛋白(桃ltp)存在交叉反应，检测prup3sige阳性对于评估蒿花粉症患者发生桃过敏反应的意义将有所降低。因此，对于临床医生来说，迫切需要一种既安全又准确可靠的体外检测试剂及方法，来帮助预测哪些蒿花粉症患者会发生蒿花粉相关的食物过敏反应。
嗜碱性粒细胞和肥大细胞是参与i型超敏反应的重要效应细胞，其表面表达高亲和力的ige的fc段受体(fcεri)。过敏原与处于致敏状态的嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的ige结合，通过桥联作用激活嗜碱性粒细胞和肥大细胞，细胞脱颗粒并释放组胺、白三烯等炎症介质，从而引起过敏症状。近年来，人们利用流式细胞术(flowcytometry,fcm)来检测嗜碱性粒细胞膜表面活化标志物的变化，即嗜碱性粒细胞活化试验(basophilactivationtest,bat)，目前尚无关于bat在蒿花粉相关食物过敏中的研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供prup3蛋白在制备蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒中的应用，制备的试剂盒可用于区分交叉反应导致的桃致敏和桃过敏患者。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
prup3蛋白在制备蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒中的应用。
如上所述的蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒，包括桃主要致敏蛋白prup3蛋白。
如上所述的蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒，所述prup3蛋白的工作浓度为10～50ng/ml。
如上所述的蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒，还包括刺激缓冲液、刺激质控、抗cd63-fitc和抗ccr3-pe的预混试剂、红细胞裂解液。
如上所述的蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒，优选地，所述刺激缓冲液中含白介素-3，所述白介素-3的工作浓度为3～6ng/ml，所述缓冲液为pbs缓冲液；
所述刺激质控中含工作浓度为0.5～12.5ug/ml抗高亲和性ige受体的单克隆抗体，作为阳性对照；
所述抗cd63-fitc和抗ccr3-pe的预混试剂中抗cd63-fitc的浓度为0.1～1.0mg/ml，所述抗ccr3-pe的浓度为5～30μg/ml；
所述红细胞裂解液中含nh4cl100～150mmol/l，tris10～30mmol/l，ph7.0～7.4。
如上所述的蒿花粉相关桃过敏检测试剂盒，优选地，所述prup3蛋白的工作浓度为25ng/ml，所述白介素-3的工作浓度为4.5ng/ml；
所述刺激质控中含工作浓度为2.5μg/ml的抗高亲和性ige受体的单克隆抗体；
所述抗cd63-fitc的浓度为0.5mg/ml，所述抗ccr3-pe的浓度为10μg/ml；
所述nh4cl为139.6mmol/l，所述tris为16.96mmol/l，ph7.2。
本发明的有益效果在于：
本发明中采用prup3蛋白制备的试剂盒，联合嗜碱性粒细胞活化试验(bat)用于预测蒿花粉相关桃过敏反应，其预测效果优于目前临床最常用的体外检测方法，即桃及其组分sige的检测效果，其可有效区分交叉反应导致的桃致敏和桃过敏患者。采用prup3蛋白制备的试剂盒进行的检测是用于预测蒿花粉相关桃过敏反应发生的最佳体外检测方法，具有最佳的灵敏度和特异度。
附图说明
图1为实施例2中fcs/ssc直方图上细胞分群。
图2为选择嗜碱性粒细胞ccr3pos/ssclow。
图3为实施例2中以prup3作为刺激物时蒿花粉相关桃过敏组的嗜碱性粒细胞活化的结果。
图4为实施例2中以prup3作为刺激物时桃致敏组的嗜碱性粒细胞活化的结果。
图5为实施例2中以prup3作为刺激物时正常对照组的嗜碱性粒细胞活化的结果。
图6为实施例2中的roc曲线。
具体实施方式
本发明以桃主要致敏蛋白prup3作为活化嗜碱性粒细胞的刺激物，证实prup3蛋白联合bat可以区分交叉反应导致的桃致敏和桃过敏患者，在预测蒿花粉相关桃过敏反应中的特异性和敏感性优于桃sige和组分检测。
目前bat临床研究中常用的两个特异性标志物是cd63和cd203c。其中，cd63又称为溶酶体相关膜糖蛋白3(lamp-3)，是一个四跨膜超家族蛋白(transmembrane4superfamily，tm4sf)，可表达于多种细胞表面，如单核细胞、血小板和嗜碱性粒细胞。当嗜碱性粒细胞处于静息状态时，cd63只表达于胞内颗粒中，很少表达于膜表面；而在激活状态时，嗜碱性粒细胞脱颗粒发生易位，cd63与细胞膜融合并高表达于细胞膜表面，成为活化的嗜碱性粒细胞的特异性标志物。本发明检测的是嗜碱性粒细胞表面cd63表达水平，计算cd63阳性的嗜碱性粒细胞的百分比作为嗜碱性粒细胞活化率。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
实施例1
采集受试者的肝素抗凝血，取50ul患者全血样本依次加入100ul刺激缓冲液、50ul相应的刺激物，混匀后，加入20ul荧光抗体试剂(抗cd63-fitc和抗ccr3-pe预混试剂)，轻柔混合，37℃水浴孵育15分钟。后加入2ml预热(18-28℃)的红细胞裂解液，轻柔混合，在18-28℃条件下避光孵育5-10分钟。离心力300g，离心5分钟，丢弃上清，重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集50000-100000个白细胞，在前向角散射(fcs)/侧向角散射(ssc)直方图上白细胞分成三群(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)，在侧向角散射低值(ssclow)区域找到全部嗜碱性粒细胞ccr3pos群，收集嗜碱性粒细胞数量>300个。计算cd63阳性细胞在获得的嗜碱性粒细胞中的百分比，即为嗜碱性粒细胞活化率。
对每种变应原来说，确定嗜碱性粒细胞活化的最佳浓度是非常重要的。因此，本发明中选择了刺激物为桃变应原(即桃总蛋白)10倍稀释比的五个浓度梯度(1ng/ml-10μg/ml)体外刺激嗜碱性粒细胞。以桃总蛋白作为刺激物时，嗜碱性粒细胞活化比例呈浓度依赖增长关系，当变应原浓度增至100ng/ml时进入平台期。因此本发明中，桃变应原体外活化嗜碱性粒细胞的最佳浓度为100ng/ml。本发明的发明人选择了刺激物为prup3蛋白5倍稀释比的三个浓度梯度(1ng/ml-25ng/ml)体外刺激嗜碱性粒细胞，确定最佳浓度为25ng/ml。
本发明的发明人比较了桃过敏、桃致敏和正常对照3组患者嗜碱性粒细胞在prup3蛋白刺激下的活化水平。研究表明，用prup3蛋白(25ng/ml)体外刺激嗜碱性粒细胞，桃过敏患者嗜碱性粒细胞活化程度明显高于桃致敏患者和健康对照(p<0.01)。本发明的发明人经大量实验确定以prup3作为刺激物，嗜碱性粒细胞活化率≧15％作为预测蒿花粉相关桃过敏反应发生的cutoff值。同目前临床最常用的体外检测方法即桃及其组分prup3sige的检测结果比较，以prup3作为刺激物的bat来预测桃过敏反应发生具有最高的准确度，是目前最佳的体外检测方法。
此外，bat可以用不到0.1ml的外周血检测150-2000个嗜碱性粒细胞在变应原作用下的活化情况，因此临床检测所需标本量少，检测时间短。同时，bat极为近似地在体外模拟了i型超敏反应的发病过程，即在过敏原激发下嗜碱性粒细胞发生活化、脱颗粒，并采用流式细胞术，定量分析活化的嗜碱性粒细胞数量，对预测过敏性疾病的发生有重要价值。
实施例2
对于实施例1中建立的prup3蛋白联合bat预测蒿花粉相关桃过敏反应的检测，在本实施例中进行具体检测，选择蒿花粉相关桃过敏(n＝28)、桃致敏(n＝23)和正常对照(n＝8)3组患者，采集肝素抗凝血待用。入组标准如下：蒿花粉相关桃过敏患者：蒿花粉症症状，同时有明确进食桃2小时内出现全身皮肤风团样皮疹、口腔黏膜水肿、呼吸困难、恶心、腹痛，甚至过敏性休克的病史，桃sige≥3.5kua/l和/或桃变应原皮肤点刺试验风团直径≥3mm；桃致敏患者：蒿花粉症症状，同时桃sige阳性，但进食桃无临床过敏症状；正常对照：无过敏性疾病病史。采用的bat变应原刺激物：桃总蛋白(提取方法如下)；纯化的桃主要致敏蛋白prup3(可购自美国alpco公司)。每个反应体系中，以刺激缓冲液(含白介素-3)作为阴性对照，以抗高亲和性ige受体的单克隆抗体(anti-fcεri，购自美国alpco公司)作为阳性对照。
prup3联合bat预测蒿花粉相关桃过敏反应的检测，具体步骤如下：
(1)采集肝素抗凝血，混匀血样。在每个患者的样本管中加入100ul刺激缓冲液和50μl患者全血样本，做4个平行样用于步骤(2)。
(2)每个患者的待测管中分别加入50μl相应的刺激物：刺激缓冲液(阴性对照)、anti-fcεri(阳性对照)、prup3(工作浓度25ng/ml)、桃变应原(即桃总蛋白100ng/ml)，轻柔混合。其中，桃变应原作为对比例。
(3)上述加有刺激物的管中分别加入20ul荧光抗体试剂(抗cd63-fitc和抗ccr3-pe预混试剂)轻柔混合，盖上管盖，37℃水浴孵育15分钟。
(4)每管中加入2ml预热(18-28℃)的红细胞裂解液，轻柔混合，在18-28℃条件下避光孵育5-10分钟。
(5)离心力300g，离心5分钟，丢弃上清。
(6)600-800μlpbs缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测，收集到数据采用flomax软件分析。
其中，桃总蛋白采用如下提取方法获得：
1.配置蛋白提取液：10mmol/lpbs(ph7)中依次加入2％聚乙烯聚吡咯烷酮、2mmol/l乙二胺四乙酸二钠、10mmol/l乙二基二硫代氨基甲酸酯。
2.取新鲜的桃皮，按4：1(wt/vol)加入上述蛋白提取液中，温度4℃持续搅拌30分钟。离心力15000g，温度4℃离心30分钟。
3.离心后的上清液经过0.2μm滤膜过滤。
4.过滤后的桃蛋白变应原浸液采用pbs透析24h。
5.bradford法检测其蛋白浓度为325μg/ml；
刺激缓冲液：含白介素-3，工作浓度为4.5ng/ml；
桃变应原(100ng/ml)：采用pbs溶液；
prup3(25ng/ml)：采用pbs溶液；
荧光抗体试剂：抗cd63-fitc和抗ccr3-pe预混试剂中抗cd63-fitc的浓度为0.5mg/ml，抗ccr3-pe的浓度为10ug/ml，溶液为pbs，ph7.4；
红细胞裂解液：含nh4cl139.6mmol/l，tris16.96mmol/l，ph7.2；
检测结果如下：以蒿花粉相关桃过敏组为例，①收集50000-100000个白细胞，在前向角散射(fcs)/侧向角散射(ssc)直方图上白细胞分成三群(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)，如图1所示。
②设置门1(r1)，在侧向角散射低值(ssclow)区域找到全部嗜碱性粒细胞ccr3pos群，结果如图2所示，收集的嗜碱性粒细胞数量>300个。
③计算cd63阳性细胞(fitc高亮荧光；q2)在r1设置中获得的嗜碱性粒细胞中的百分比，图3所示的是以prup3作为刺激物时嗜碱性粒细胞活化率。
以桃致敏组为例，步骤同上述①-③，结果如图4所示，该组以prup3作为刺激物时嗜碱性粒细胞活化率(<15％)。
以健康组为例，步骤同上述①-③，如图5所示，为健康组即正常对照组以prup3作为刺激物时嗜碱性粒细胞活化率(<15％)。
对比例：
采用immunocap方法(目前公认sige检测的金标准)对上述3组患者桃及其主要致敏蛋白prup3sige水平进行检测(可采用phadia,thermofisherscientific试剂进行)，sige≥0.35kua/l为阳性。桃sige、prup3sige分别指三组患者桃和prup3sige检测水平，bat-桃、bat-prup3分别指以桃总蛋白和prup3作为刺激物嗜碱性粒细胞活化率，结果见表1。表1中数据以中位数(范围)表示，结果表明分别采用上述四种检测方法，桃过敏患者的检测结果均高于桃致敏患者(p<0.01)，说明以prup3作为刺激物的bat检测结果可以区分桃致敏患者和桃过敏患者。
表1bat可区分蒿花粉相关桃过敏和桃致敏
进一步采用roc曲线分析上述四种过敏原检测方法(桃sige、prup3sige、bat-桃和bat-prup3)在蒿花粉相关桃过敏诊断中作用。曲线下面积(auc)表明该检测方法在预测桃过敏反应中的价值大小。结果表明，以桃主要致敏蛋白prup3作为刺激物的bat曲线下面积最大(见图6)。采用spss17.0(spssi，chicago，il，usa)进行统计学分析，确定prup3在25ng/ml浓度下的最佳cutoff值，以此指标预测桃过敏反应发生，其敏感度为95％，特异度95％，阳性预计值和阴性预计值均为92％；以100ng/ml桃总蛋白作为刺激物的bat灵敏度高，但特异度偏低；桃和prup3sige诊断的特异度最低，仅为67％(结果具体见表2)。因此，以prup3作为刺激物的bat来预测桃过敏反应发生具有最高的准确度，是目前最佳的体外检测方法。
表2桃、prup3sige和bat在预测蒿花粉相关桃过敏反应中的价值
以上实验结果显示，以prup3蛋白体外刺激嗜碱性粒细胞，桃过敏患者嗜碱性粒细胞活化程度明显高于桃致敏患者和健康对照(p<0.01)。采用roc曲线比较桃及其主要致敏蛋白prup3sige检测、bat在蒿花粉相关桃过敏诊断中作用，roc曲线如图6所示，以桃主要致敏蛋白prup3作为刺激物的bat曲线下面积最大。确定prup3蛋白在25ng/ml浓度下的最佳cutoff值，以此指标预测桃过敏反应发生，其灵敏度和特异度均显著高于目前临床最常用的体外检测方法，即桃及其组分prup3sige检测。因此，prup3蛋白联合bat是目前预测蒿花粉相关桃过敏反应的最佳体外检测方法。