一种双功能化核酸适体介导的A549肿瘤细胞检测方法与流程

本发明涉及光学检测领域，具体涉及通过检测荧光信号变化来测试或分析肿瘤细胞。

背景技术：

传统的肿瘤细胞检测方法主要包括免疫组化法、流式细胞术、荧光原位杂交、聚合酶链式反应和二代测序方法等，这些方法不同程度地解决了肿瘤细胞检测的相关问题，但目前仍缺乏一种适用于临床实验室的简便、快速、高灵敏、高特异的检测方法。流式细胞术是一种经典的细胞计数方法，它在流体系统中，通过测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收实现细胞的快速定量及分选。然而该方法需要昂贵的设备，对操作及结果分析的人员专业性要求极高而限制其在临床推广。近年来备受关注的用于循环肿瘤细胞检测的平台，是目前唯一获得美国食品药品监督管理局批准用于临床的循环肿瘤细胞检测平台。该平台利用抗体标记磁珠对细胞进行富集，并将细胞固定后用荧光染料和荧光抗体标记细胞后进行细胞鉴定。该技术能较好的保护细胞形态结构，利于观察肿瘤细胞形态，为肿瘤细胞检测提供了新思路，却仍存在标志物种类局限、假阴性率高和设备精密昂贵等不足。因此，为适应临床诊断治疗，尤其是个体化医疗的需求，发展一种简便、快速、高度灵敏且特异的肿瘤细胞检测新方法是生物传感研究领域一项亟待解决的课题，也是近年来研究热点之一。

考虑到稀有肿瘤细胞低丰度、短寿命及异质性的特点，荧光检测技术因具有高度灵敏度、简便、可实时监测等特点而在肿瘤细胞检测上受到广泛关注。其中，荧光染料能够很好地与蛋白质、核酸和纳米材料结合而实现了体内外多种生物标志物的检测。现已发展出来的肿瘤细胞荧光检测方法主要通过捕获分子将肿瘤细胞固定在检测界面上，再采用特异的荧光分子进行肿瘤细胞的检测。如常用的抗体捕获肿瘤细胞的方法，首先，需要将抗体固定在界面上，再将样本与抗体孵育过夜并洗脱非靶向细胞，再通过荧光染料染色进行镜下观察。利用这些方法，肿瘤细胞可以被特异地识别，但是此类方法耗时较长，需要通过多次洗脱将非目标细胞去除，步骤繁复，试剂昂贵而不易保存，不适于实现肿瘤细胞的快速检测。

核酸适体是通过指数富集的配体系统进化技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能与靶标特异性相互作用的寡核苷酸，目前已筛选出能与蛋白质、活细胞、金属、细菌和小分子等特异性结合的核酸适体。核酸适体具有高亲和力、高特异性、体积小、易于合成、性质稳定、结构易控制等优点。在肿瘤细胞研究中，多种细胞系如非小细胞肺癌、肝癌、胶质瘤、肺腺癌、结肠癌等的核酸适体均已被筛选出来。近年来，采用核酸适体建立了许多肿瘤细胞的检测方法，这些方法的作用原理大概可以分为三类。最早使用核酸适体建立的方法多在适体上标记单/双荧光基团或一些新的发光材料形成探针结构，核酸适体与肿瘤细胞特异性结合时发生构象的转变从而使荧光信号得以释放，此类方法操作简单且荧光标记技术成熟，但是此类方法信号与靶标多呈一对一关系，这使其灵敏度欠佳。许多纳米材料因具有较强的生物相容性、尺寸小且颜色和发光等性能可调控等特点而被引入到肿瘤细胞检测。肿瘤细胞存在时，适体与靶标结合而引起纳米材料存在形式的改变，从而采集到不同的信号进行肿瘤细胞分析。如研究者将与mcf-7细胞适体两端分别互补的核酸标记在金纳米粒子上，mcf-7细胞存在时，适体与靶细胞结合而不与金纳米粒子上的寡核苷酸互补，从而金纳米粒子从聚集状态转变为分散状态，溶液也相应由紫色转变成红色。此类方法提供了肿瘤细胞检测的新思路，但存在纳米材料制备困难，价格昂贵等不足。聚合酶链式反应通过指数级别扩增进行信号放大而给生物分子检测带里程碑式的改变，并伴随发展了其他信号放大方式实现核酸的微量检测。基于适体的核酸性质，一些研究者尝试将这些信号放大方法用于肿瘤细胞检测以期实现肿瘤细胞的高敏检测。他们设计与适体互补的序列在被置换下来后进行相应扩增，此类方法一定程度上提升了方法的灵敏度，但因置换下来的序列多分散存在于上清而难以集中，使得真正进行的信号放大反应受到一定限制。

催化发夹自组装反应由dna纳米结构发展而来，反应由精心设计的两个茎环状核酸和一条链状核酸实现，利用茎环结构上的成核区能被序列互补的裸露核酸通过碱基互补配对原则及拓扑反应动力学作用改变结构，从而完成核酸之间的自组装与去组装过程。该反应因具备快速而高效的信号放大性能而受到广泛关注。在生物分子检测中，通常由目标核酸分子充当链状核酸启动信号放大反应进行的角色，因此，该反应主要在核酸分子检测过程中得以应用及发展。适体由于核酸本质、体积小、特异性识别靶标等性质而实现了多种生物分子的均相检测而免去了繁复的操作。为能快速实现肿瘤细胞的均相检测，本发明引入核酸适体进行靶细胞的特异性识别。前述现有的基于核酸适体的肿瘤细胞检测方法仍然存在操作繁复，制备困难，价格昂贵，灵敏度欠佳等缺点。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法，该方法具备灵敏度高、反应快速、操作简便等特点。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)用te缓冲液分别将双功能化适体和抑制链溶解并稀释至2μmoll^-1和4μmoll^-1，然后将两者等体积比例混合，于95℃反应5min，缓慢降至室温，得到适体—抑制链复合物；其中，

所述的双功能化适体的核酸序列为：

5'-tgaggtagtaggttgtgtggttgcagttgatcctttggataccctgg-3'(seqidno.1)；

所述的抑制链序列为：

5'-tcaactgcaaccacacaacct-3'(seqidno.2)；

(2)取待测细胞悬液，加入步骤(1)所得到的适体-抑制链复合物10μl，用结合缓冲液定溶至1ml，置于杂交仪中，37℃中速杂交1h后，离心，弃去上清，沉淀物用15μl无菌pbs缓冲液重悬，得细胞悬液；其中，所述结合缓冲液ph为7.5，由tris-hcl、nacl、mgcl2和去离子水组成，其中所述tris-hcl、nacl、mgcl2的终浓度依次为：10mmoll^-1、500mmoll^-1、1mmoll^-1；

(3)取步骤(2)所得到的细胞悬液，加入浓度为5μmoll^-1的h1-f2μl、浓度为5μmoll^-1的h22μl和tnak缓冲液1μl，置于pcr仪在等温模式下37℃温育45min，得到发夹催化自组装反应液；其中，所述tnak缓冲液ph为7.5，由tris-hcl、nacl、kcl和去离子水组成，其中，

所述的tris-hcl、nacl、kcl的终浓度依次为：10mmoll^-1、125mmoll^-1、20mmoll^-1；

所述的h1-f的序列为：

5'-fam-aaccacacaacctactacctcaagaagaaggtgttgaggtagtaggtt-bhq1-3'(seqidno.3)；

所述的h2的序列为：

5'-tacctcaacaccttcttcttgaggtagtaggttagaagaaggtgtttaagta-3'(seqidno.4)；

(4)将步骤(3)所得到的发夹催化自组装反应液用depc水稀释至60μl，上荧光分光光度计，采集波长为515nm的荧光强度；

(5)先配制出a549肿瘤细胞浓度为10个每ml～10⁵个每ml的一系列标准细胞液，再重复上述步骤(3)和(4)，然后以荧光强度为纵坐标，以标准细胞液的细胞浓度为横坐标，在直角坐标系绘制出荧光强度与细胞浓度对应关系的曲线并进行线性回归，得到标准品曲线方程；

(6)将步骤(4)所得到是荧光强度代入步骤(5)所建立的标准品曲线方程，得到待测细胞悬液中a549肿瘤细胞的浓度。

上述方法中，所述的双功能化适体的核酸序列中，前22个碱基为触发由h1-f和h2所组成的发夹结构的核酸序列，后25个碱基为特异性识别a549肿瘤细胞上粘蛋白1(muc-1)的核酸序列。

本发明所述方法的检测原理如下所述：首先，设计发夹催化自组装反应体系中的两发夹结构及触发序列，可高效且特异地进行信号放大，再将该触发序列整合至特异性识别靶细胞a549表面粘蛋白1的适体上，并设计抑制链有效抑制该双功能化适体触发非特异发夹催化自组装反应，并保证适体识别有效性。检测时，首先通过核酸适体特异性识别肿瘤细胞并暴露出触发序列，进而启动发夹催化自组装反应进行信号放大，从而采集荧光信号可分析获得受检细胞数量(参见图1)。

本发明的有益效果为：

(1)本方法能有效地区分肿瘤细胞与正常细胞，并能够对多种临床标本中不同数量肿瘤细胞产生的信号与缓冲液中结果相近，且检测限达到10个细胞/ml。

(2)本方法中，荧光基团随着发夹催化自组装反应的进行，快速释放信号，可对肿瘤细胞数量进行准确定量。

(3)本方法将肿瘤细胞检测转化成了核酸检测，简便地实现均相检测临床血液体液标本中的稀有肿瘤细胞，减少了复杂的分离和洗脱操作，易于实现肿瘤细胞现场检测。

(4)本方法能很好地从正常细胞及常见干扰细胞中区分肿瘤细胞，并能应用于多种临床标本，该方法有望在肿瘤液体活检、个体化医疗等领域实现稀有肿瘤细胞的快速筛查，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明所述方法的原理图。

图2为本发明所述方法的定量检测效果分析图，其中，a图为不同发夹催化自组装体系反应产物的电泳图，b图为不同发夹催化自组装体系反应产物的荧光光谱图。

图3为不同数量的靶细胞的荧光光谱图。

图4为信噪比统计分析的柱状图。

图5为信号强度与反应时间的关系曲线。

图6为不同温度下信噪比统计分析的柱状图。

图7为细胞悬液中细胞浓度荧光强度的关系曲线。

图8为标准曲线的线性拟合曲线。

图9特异性效果统计分析的柱状图。

图10为本发明所述方法临床效果统计分析的柱状图。

具体实施方式

实施例1(双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法)

1.材料与方法

1.1材料

非小细胞肺癌a549细胞系，购于中国科学院细胞库。

发夹h1-f，按seqidno.3所示序列，由上海生物工程有限公司合成，用te缓冲液溶解并稀释至5μmoll^-1。

发夹h2，按seqidno.4所示序列，由上海生物工程有限公司合成，用te缓冲液溶解并稀释至5μmoll^-1。

双功能化核酸适体(apts2.2)，按seqidno.1所示序列，由上海生物工程有限公司合成，用te缓冲液溶解并稀释至2μmoll^-1。

抑制链(inh)，按seqidno.2所示序列，由上海生物工程有限公司合成，用te缓冲液溶解并稀释至4μmoll^-1。

depc水购于上海生工程有限公司。

rpmi1640培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(pbs)、胰酶和青霉素-链霉素均购自赛默飞。

化学试剂nacl、kcl、nh4cl、khco3和edtana2均购于sigma公司。

te缓冲液购于biosharp公司。

tnak缓冲液作为杂交缓冲液：ph为7.5，由tris-hcl、nacl、kcl和去离子水组成，其中所述tris-hcl、nacl、kcl的终浓度依次为：10mmoll^-1、125mmoll^-1、20mmoll^-1。

靶细胞与适体的结合液：ph为7.5，由tris-hcl、nacl、mgcl2和去离子水组成，其中所述tris-hcl、nacl、mgcl2的终浓度依次为：10mmoll^-1、500mmoll^-1、1mmoll^-1。

红细胞裂解液：ph为7.2～7.4，由nh4cl、khco3、edtana2和去离子水组成，其中nh4cl、khco3、edtana2的终浓度依次为1.5moll^-1、100mmoll^-1、1mmoll^-1。

1.2检测仪器

荧光/磷光/分光光度计ls55为英国perkinelmer公司产品。

2.制备方法

(1)用te缓冲液分别将双功能化核酸适体和抑制链溶解并稀释到2μmoll^-1和4μmoll^-1，将两者等体积比例混合后于95℃反应5min后缓慢降至室温，获得浓度为1μmoll^-1的适体-抑制链复合物；

(2)取待测细胞悬液，加入10μl步骤(1)中所述的适体-抑制链复合物，加入结合缓冲液定溶为1ml，然后将反应混合液置于杂交仪中，37℃中速杂交1h后，置于离心机中，1000rpm离心15min，弃上清，并用15μl无菌pbs缓冲液重悬沉淀物，获得细胞悬液；

(3)取步骤(2)所制得的细胞悬液15μl，加入浓度为5μmoll^-1的h1-f2μl、浓度为5μmoll^-1的h22μl、tnak缓冲液1μl，置于pcr仪在等温模式下37℃温育45min，得到发夹催化自组装反应液；

(4)将步骤(3)所制得的发夹催化自组装反应液用depc水稀释至60μl，上荧光分光光度计ls55，采集波长为515nm的荧光强度。

(5)取非小细胞肺癌a549细胞系进行培养，当细胞处于对数生长期时，用胰酶将其消化下来，1000rpm离心3min收集细胞，并将其用无菌pbs缓冲液重悬后进行细胞计数，获得10、10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵个/毫升的标准细胞液品，再重复上述步骤(3)和(4)，然后以荧光强度为纵坐标，以标准细胞液的细胞浓度为横坐标，在直角坐标系绘制出荧光强度与细胞浓度对应关系的曲线并进行线性回归，得到标准品曲线方程。f＝74.47+7.399log10c(f为荧光强度，c为a549肿瘤细胞的浓度，相关系数为0.9791)，该方程所对应的标准品曲线如图8所示；

(6)将步骤(4)所得到是荧光强度代入步骤(5)所建立的标准品曲线方程，得到待测细胞悬液中a549肿瘤细胞的浓度。

实施例2(定量检测效果的验证)

一、发夹催化自组装反应分析及验证

1、实验方法

为验证该a549肿瘤细胞检测方法的有效性，首先，我们对发夹催化自组装反应进行了分析与评估。分别设置对照组只含500nmh1、只含500nmh2、500nmh1+500nmh2，及加入了不同浓度触发序列(10nmoll^-1和1μmoll^-1)的实验组，在相同条件下(37℃，60min)进行反应。最后，产物通过12％聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分析，并观察该反应的荧光响应情况。

2、分析及结论

如图2a所示，是不同发夹催化自组装体系反应产物的电泳图：

泳道1为单独的发夹结构h1；

泳道2为单独的发架结构h2；

泳道3为两发夹结构h1、h2的混合物；

泳道4为两发夹结构h1、h2加10nmoll^-1触发序列；

泳道5为两发夹结构h1、h2加1μmoll^-1触发序列。

体系中只有单独的发夹催化自组装反应底物h1和h2时，相应的泳道中只有一条独立清晰的条带(图2a-泳道1、2)，说明体系中所用的两种反应底物形成的二级结构良好，不存在其他干扰结构。发夹催化自组装两反应底物h1和h2共存时，泳道中存在两条独立清晰条带，分别对应h1和h2所在位置，而不存在其他条带(图2a-泳道3)，这表明该方法中所用的发夹催化自组装底物无明显的非特异反应，进一步证明了所设计的发夹h1和h2适合用于该反应。在体系中加入触发序列时，泳道中新增一条分子量更大的亮带；且随着触发序列浓度增加，条带亮度增加，当触发序列浓度为1μmoll^-1时，泳道中两发夹结构对应位置的条带肉眼已看不到(图2a-泳道4、5)，这说明了所涉及的发夹催化自组装反应能够顺利进行，且该反应高效快速，可实现信号的快速放大。

如图2b所示，是不同发夹催化自组装体系反应产物的荧光光谱图，从下至上依次对应图2a中1、3、4、5泳道：

紫色曲线a为单独的h1-f；

曲线b为h1-f、h2共存体系；

曲线c为h1-f、h2加10nmoll^-1触发序列；

曲线d为h1-f、h2加100nmoll^-1触发序列。

该体系的荧光响应情况与图2a中结果一致。反应体系中只存在h1-f或者h1-f、h2共存时，只采集到极弱的荧光背景信号(图2b-曲线a和b)。当体系中加入触发序列时，荧光信号大幅增强，且随着触发序列浓度增加而增强(图2b-曲线c和d)。这一结果同样说明：所设计的核酸序列二级结构形成良好，反应高效快速，且特异性高，并能有效通过荧光信号输出进行数据分析。

二、肿瘤细胞检测效果验证

1、实验方法

在获得反应优良的发夹催化自组装反应基础上，我们进一步验证了该a549肿瘤细胞检测方法的可行性。一方面，我们设计对照组及含不同浓度a549肿瘤细胞(10³、5×10⁴、10⁵个/ml)的实验组，按照实施例1步骤(1)～(4)操作，将反应体系置于37℃反应45min，而后检测不同反应产物的荧光信号；另一方面，我们对这几组实验进行了间隔2.5min，共45min的实时荧光监测。

2、分析及结论

如图3所示，为双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法中加入不同数量的靶细胞a549所采集的荧光光谱图，从下至上：

曲线a为未加入细胞的空白对照；

曲线b为加入10³个/ml靶细胞；

曲线c为加入5×10⁴个/ml靶细胞；

曲线d为加入10⁵个/ml靶细胞。

从采集的荧光光谱图中可以明显看出，荧光信号随着细胞数量的增加呈现增长趋势，且明显区分于空白对照；其荧光动态分析图亦表明信号在在一定时间内呈现逐步增长并趋于稳定的趋势。该结果可以初步证实该双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法可用于肿瘤细胞的检测。

实施例3(效果比较)

本发明发展的双功能化核酸适体既能特异性识别靶细胞，又能特异性触发发夹催化自组装信号放大反应，从而实现a549细胞快速、灵敏的检测。对此，我们设计了实验观察双功能化核酸适体与传统核酸适体对a549细胞检测效果差异。其中，所用传统核酸适体即为通过指数富集的配体系统进化技术筛选出来的能与肿瘤细胞表面粘蛋白1特异性结合的寡核苷酸序列，具体序列为：

5'-gcagttgatcctttggataccctgg-3'(seqidno.5)

实验中，分别将双功能化核酸适体与传统核酸适体加入检测体系，两组中分别对同一数量的a549细胞(0个和10⁵个)进行检测。测得荧光信号并分析两种适体条件下的信噪比，如图4所示，传统核酸适体组的信噪比为2.350，而双功能化核酸适体组的信噪比明显得到提升，可达到5.353。这一结果证实了双功能化核酸适体确实可在特异性识别a549肿瘤细胞的基础上触发信号放大反应。

实施例4(反应条件的优化)

本发明涉及的重要反应条件主要包括反应温度和反应时间。对此，我们均设计了系列反应条件观察该检测方法的检测效果，以摸索最适条件达到最佳反应性能。

温度可以改变反应底物的结构、反应速率等，进而对反应的灵敏度和特异性均带来影响。因此，我们首先探究了不同反应温度对反应结果的影响。如图5可见，设置空白对照(未加入靶细胞)和实验组(加入10⁵个靶细胞)，将反应分别放置在4℃、25℃、37℃、42℃和55℃五种环境，反应结束后进行荧光信号的采集，并计算不同反应温度下的信噪比，分别为2.44、3.44、4.17、2.70、1.20，因此该检测方法的最佳反应温度选定为37℃。

同理，为了考察不同反应时间对检测方法的影响，我们设置了空白对照(未加入靶细胞)和实验组(加入10⁵个靶细胞)，以15min为间隔至75min采集不同点的荧光信号值，统计结果发现：空白组的信号值从15min至75min无明显的变化，而实验组的荧光信号值在0～45min内逐渐上升，并在45min后趋于稳定(图6)。因此，该方法的最佳反应时间选定为45min。

实施例5(灵敏度分析)

为评估该双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法的性能，使用该方法对系列不同浓度的a549细胞数量进行检测，最佳反应条件下，在a549细胞的对数生长期，消化并制备细胞悬液，计数细胞并进行梯度稀释，以获得10、10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵(个/毫升)的细胞悬液，以该检测方法对这些不同浓度的细胞悬液(3组平行试验)进行分析。

从所采集的光谱图中可以看出，随着细胞数量的增加，荧光光谱图逐渐上升(图7)。将其荧光信号进行统计分析可以得到图8：在a549细胞数量10～10³个细胞/ml范围内，荧光信号与肿瘤细胞数量成正比；通过线性拟合可得到数学模型，其线性方程为f＝74.47+7.399log10c(f为荧光强度，c为a549细胞的浓度)，相关系数为0.9791；根据空白信号加上3倍标准差所对应的信号值估计检出限，计算得到为10个细胞/ml。

实施例6(特异性分析)

从正常细胞和白细胞中区分出肿瘤细胞对于了解肿瘤组织及体液中游离肿瘤细胞具有重要意义。为探究双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法的检测特异性，人支气管上皮细胞16hbe细胞系和白细胞作为对照细胞进行分析。结果如图9所示，对10⁵个白细胞、16hbe细胞、a549细胞进行检测，该检测方法对白细胞和16hbe细胞仅检测出与空白组接近的荧光信号值，而对a549细胞检测出明显增强的荧光信号。在10⁵个a549细胞中分别掺入等量的白细胞和16hbe细胞时，该方法检测出的信号与单独a549细胞信号接近。这结果表明，所制备的双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法能够有效区分肿瘤细胞与白细胞、16hbe细胞，且能有效避免这两种细胞对其检测的干扰，具备良好的特异性。

实施例7(临床性能评价)

为评估该双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法的临床应用价值，我们将不同数量级的肿瘤细胞(200、10⁴、10⁵个细胞/ml)掺入到血清、尿液、脑脊液和胸腹水四种体液标本中，用建立的方法对这些标本中的肿瘤细胞数量进行检测，并将结果与pbs细胞悬液中同数量级的肿瘤细胞检测结果进行比对。结果显示，该检测方法在这四种体液标本中对不同数量肿瘤细胞分别检测出不同信号，且所得信号均与pbs缓冲液中的结果接近(图10)。这一结果证明了该双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法能够区分多种体液标本中肿瘤细胞数量，且对这些标本中肿瘤细胞的分析结果与pbs中肿瘤细胞检测结果接近，其在临床标本的检测肿瘤细胞数量具有一定潜力。

序列表

<110>南方医科大学南方医院

<120>一种双功能化核酸适体介导的a549肿瘤细胞检测方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgaggtagtaggttgtgtggttgcagttgatcctttggataccctgg47

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcaactgcaaccacacaacct21

<210>3

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaccacacaacctactacctcaagaagaaggtgttgaggtagtaggtt48

<210>4

<211>52

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tacctcaacaccttcttcttgaggtagtaggttagaagaaggtgtttaagta52

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gcagttgatcctttggataccctgg25