一种检测肺栓塞的方法与流程

本发明涉及生物医药的技术领域，具体而言，涉及一种检测肺栓塞的方法。

背景技术：

肺栓塞(pulmonaryembolism，pe)发病率在心血管疾病中占第三位，由于pe临床表现缺乏特异性，约80％的pte漏诊、误诊，导致了pe成为了高致残率和死亡率的人类重大健康问题。

研究显示，明确及早期诊断并适当治疗可使pe死亡率可降至2％～8％。目前pte的确诊主要依靠ct肺动脉造影发现肺动脉血栓充盈缺损。然而，在接受ctpa检查的可疑病人中，最后仅有5％～10％的患者为真正的pe患者。另外，ctpa检查费用昂贵且不能随时进行检测，延误了对急性肺栓塞的诊断，并且诊出率低说明了临床资源并未能得到合理利用。ctpa为一种侵入性的带有辐射的检查手段。研究表明，在接受ctpa的患者中，有1.5％～2.0％的患者发生了恶性肿瘤，并且在接受检查的可疑pe患者中，ctpa相关肾病的发病率更是高达12％。为了减少不必要的侵入性检查，充分合理分配临床资源，目前临床上主要以d-二聚体作为辅助检查手段，排除pe。d-二聚体是交联纤维蛋白在纤溶系统作用下产生的可溶性降解产物，在血栓栓塞时因血栓纤维蛋白溶解，使其血中浓度升高。国内外研究公认d-二聚体检测的重要意义是阴性结果(<500μg/l)可排除pe的诊断，减少了患者的医疗费用，避免了因进行ctpa检查而引起的潜在并发症。尽管d-二聚体灵敏性较高，但是机体很多疾病(如心血管疾病、手术、肿瘤、感染与组织坏死等)都会导致d-二聚体升高，因此其特异性并不高，检测结果阳性时，还需进一步行ctpa检查。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种检测肺栓塞的方法，检测样品血浆中血小板微粒的含量；

所述血小板微粒大于716.90/μl时，被检测对象判断为肺栓塞。

在某些实施方式中，利用标准流式法检测样品血浆中血小板微粒的表达水平。

在某些实施方式中，所述标准流式法中采用流式标准微球用于定位设门，根据标准微球的大小鉴别样品血浆中血小板微粒的大小。

在某些实施方式中，所述血小板微粒定义为落入标准微球划定区域的pe-cd41a及fitc-annexinv双阳性微粒。

在某些实施方式中，检测样品血浆中血小板微粒的含量后，还包括对检测到的血小板微粒水平进行统计分析的过程。

在某些实施方式中，还包括采用二分类logistic逐步回归的方法建立回归模型的过程，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在某些实施方式中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对血小板计数建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在某些实施方式中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对血小板分布宽度建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在某些实施方式中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对p-选择素建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在某些实施方式中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对d-二聚体建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

本发明提供的一种检测肺栓塞的方法相对于现有技术而言，有益效果是：

pe的发生发展主要源于凝血系统的失衡，研究表明血小板微粒(plateletmicorparticles,pmps)与机体凝血系统的平衡紧密相关。pmps占循环血液中细胞微粒的70％-90％。当血管壁受到损伤后，内皮细胞脱落导致内皮组分暴露，其中胶原、层素、微纤维及血管性血友病因子(yonwillebrandfactor，vwf)引起血小板粘附、聚集和活化反应，产生血栓烷a2和内皮素，使血管呈持续收缩反应，在血栓止血中具有重要作用。凝血酶和胶原激活血小板，其表达出的血小板激活因子活性源自pmps，而其他激活途径下血小板释放的血小板激活因子也大部分与pmps相关，所以血小板微粒具有很强的促凝活性。

经发明人研究证实，pmps的形成与血小板活化后的蛋白质磷酸化和细胞支架蛋白结构的重排有关。血小板激活因子是一种很强的血小板活化剂，可诱导血小板聚集。当血中血小板激活因子浓度达到相当高的时候，引发血栓形成，这直接说明pmps在血管血栓止血反应中的作用。研究还发现pmps蛋白膜上的ps形成一个阴离子磷脂表面，可以增强tf的组装与催化活性，导致血小板膜释放出更多的凝血酶，进而使凝血反应进一步加剧，这种正反馈机制最终引起血小板数量减少和血液高凝状态。可见，pmps具有促凝、调节内皮功能及炎症反应等生物学特性，参与肺血栓栓塞症血液高凝状态及血栓形成，能够成为诊断肺血栓栓塞症新的生物标志物和治疗靶点，同时还可作为监测抗凝疗效的新指标。

由此可见，本发明采用的流式细胞术在日常临床检验中广泛应用，技术成熟，操作简便，成本较ctpa低廉，且仅需少量外周血即可，另外血小板微粒的流式检测法已经标准化，易于开展。

可以理解的是，进一步的，建立回归模型后，只需将所得pmps及其它指标的数据放到模型中计算，即可得出样本的分类。有利于快速对急性肺栓赛病人进行初步诊断，尤其是急诊病人，争取最佳治疗时机。

综上所述，本发明提供的一种检测肺栓塞的方法结构及操作方法其具有上述诸多的优点及价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。

附图说明

应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为流式fitc和ssc电压的设置图示，p1、p2、p3、p4分别为不同大小的标准微粒；其中，p1＝0.50μm，p2＝0.24μm，p3＝0.20μm，p4＝0.16μm。

图2为ssc分辨率和mp区边界评估的ssc-h直方图；其中，p5、p6、p7、p8、p9分别表示p1-p4对应的微球单峰。

图3为双散射的mp设门细胞象限图；其中，p10为0.50μm微粒的散射图，p11为0.24μm及0.20μm微粒的散射图。

图4为pe及fitc双阳性的0.50μm微粒矩形图。

图5为pe及fitc双阳性0.24μm及0.20μm微粒矩形图。

具体实施方式

在下文中，将结合附图更全面地描述本公开的各种实施例。本公开可具有各种实施例，并且可在其中做出调整和改变。因此，将参照在附图中示出的特定实施例更详细地描述本公开。然而，应理解：不存在将本公开的各种实施例限于在此公开的特定实施例的意图，而是应将本公开理解为涵盖落入本公开的各种实施例的精神和范围内的所有调整、等同物和/或可选方案。结合附图的描述，同样的附图标号标示同样的元件。

在下文中，可在本公开的各种实施例中使用的术语“包括”或“可包括”指示所公开的功能、操作或元件的存在，并且不限制一个或更多个功能、操作或元件的增加。

在本公开的各种实施例中，表述“或”或“a或/和b中的至少一个”包括同时列出的文字的任何组合或所有组合。例如，表述“a或b”或“a或/和b中的至少一个”可包括a、可包括b或可包括a和b二者。

在本公开的各种实施例中使用的表述(诸如“第一”、“第二”等)可修饰在各种实施例中的各种组成元件，不过可不限制相应组成元件。例如，以上表述并不限制所述元件的顺序和/或重要性。以上表述仅用于将一个元件与其它元件区别开的目的。例如，第一用户装置和第二用户装置指示不同用户装置，尽管二者都是用户装置。例如，在不脱离本公开的各种实施例的范围的情况下，第一元件可被称为第二元件，同样地，第二元件也可被称为第一元件。

应注意到：如果描述将一个组成元件“连接”到另一组成元件，则可将第一组成元件直接连接到第二组成元件，并且可在第一组成元件和第二组成元件之间“连接”第三组成元件。相反地，当将一个组成元件“直接连接”到另一组成元件时，可理解为在第一组成元件和第二组成元件之间不存在第三组成元件。

在本公开的各种实施例中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的并且并非意在限制本公开的各种实施例。如在此所使用，单数形式意在也包括复数形式，除非上下文清楚地另有指示。除非另有限定，否则在这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本公开的各种实施例所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。所述术语(诸如在一般使用的词典中限定的术语)将被解释为具有与在相关技术领域中的语境含义相同的含义并且将不被解释为具有理想化的含义或过于正式的含义，除非在本公开的各种实施例中被清楚地限定。

在本发明某些实施例中，一种检测肺栓塞的方法，检测样品血浆中血小板微粒的含量；

所述血小板微粒大于716.90/μl时，被检测对象判断为肺栓塞。

上述，pe的发生发展主要源于凝血系统的失衡，研究表明血小板微粒(plateletmicorparticles,pmps)与机体凝血系统的平衡紧密相关。pmps占循环血液中细胞微粒的70％-90％。当血管壁受到损伤后，内皮细胞脱落导致内皮组分暴露，其中胶原、层素、微纤维及血管性血友病因子(yonwillebrandfactor，vwf)引起血小板粘附、聚集和活化反应，产生血栓烷a2和内皮素，使血管呈持续收缩反应，在血栓止血中具有重要作用。凝血酶和胶原激活血小板，其表达出的血小板激活因子活性源自pmps，而其他激活途径下血小板释放的血小板激活因子也大部分与pmps相关，所以血小板微粒具有很强的促凝活性。

经发明人研究证实，pmps的形成与血小板活化后的蛋白质磷酸化和细胞支架蛋白结构的重排有关。血小板激活因子是一种很强的血小板活化剂，可诱导血小板聚集。当血中血小板激活因子浓度达到相当高的时候，引发血栓形成，这直接说明pmps在血管血栓止血反应中的作用。研究还发现pmps蛋白膜上的ps形成一个阴离子磷脂表面，可以增强tf的组装与催化活性，导致血小板膜释放出更多的凝血酶，进而使凝血反应进一步加剧，这种正反馈机制最终引起血小板数量减少和血液高凝状态。可见，pmps具有促凝、调节内皮功能及炎症反应等生物学特性，参与肺血栓栓塞症血液高凝状态及血栓形成，能够成为诊断肺血栓栓塞症新的生物标志物和治疗靶点，同时还可作为监测抗凝疗效的新指标。

由此可见，本发明采用的流式细胞术在日常临床检验中广泛应用，技术成熟，操作简便，成本较ctpa低廉，且仅需少量外周血即可，另外血小板微粒的流式检测法已经标准化，易于开展。

在本发明某些实施例中，利用标准流式法检测样品血浆中血小板微粒的表达水平。

在本发明某些实施例中，所述标准流式法中采用流式标准微球用于定位设门，根据标准微球的大小鉴别样品血浆中血小板微粒的大小。

在本发明某些实施例中，所述血小板微粒定义为落入标准微球划定区域的pe-cd41a及fitc-annexinv双阳性微粒。

在本发明某些实施例中，检测样品血浆中血小板微粒的含量后，还包括对检测到的血小板微粒水平进行统计分析的过程。

上述，可以理解的是，进一步的，建立回归模型后，只需将所得pmps及其它指标的数据放到模型中计算，即可得出样本的分类。有利于快速对急性肺栓赛病人进行初步诊断，尤其是急诊病人，争取最佳治疗时机。

在本发明某些实施例中，还包括采用二分类logistic逐步回归的方法建立回归模型的过程，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在本发明某些实施例中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对血小板计数建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在本发明某些实施例中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对血小板分布宽度建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在本发明某些实施例中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对p-选择素建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

在本发明某些实施例中，采用所述二分类logistic逐步回归的方法对d-二聚体建立回归模型，以提高血小板微粒对肺栓塞的分辨诊断效率。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的试验均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例

试验材料如下：

标准微球(megamixplussscbeads)：法国biocytex公司。

流式抗体：美国bd公司。

绝对计数管：美国bd公司。

流式细胞仪：美国bd公司。

elisa试剂盒：美国r&d公司。

二分类逐步logistic回归分析:比利时玛丽亚凯尔克medcalc软件，版本11.4.2.0。

1、pmps流式抗体标记

pmps流式抗体标记的方法是：采用标准流式法进行标记。

具体步骤是：采集研究对象外周静脉血2ml，在2500g离心力下离心血液15min，分离血浆，再次离心分离后的血浆15min，得到贫血小板血浆(pfp)样本。

将10x的annexinvbindingbuffer稀释为1x的工作液，如：1ml的buffer+9ml的蒸馏水；

fitcannexinv与1x的bindingbuffer1:2稀释，如：10μlannexinv+20μlbindingbuffer；

同样的方法稀释cd41a抗体及同型对照抗体；

加30ul的血浆，每一份血浆中分别加入30μlfitcannexinv稀释液和30μl稀释后的抗体(总体积为90μl)，混匀后转移至绝对计数管中，室温避光孵育30min；加入210μl的1xannexinvbindingbuffer。孵育后的样本(无需混匀)，准备上机。

2、流式法检测pfp样本中的pmps

(1)标准微球的准备：旋涡震荡混匀至少10秒后，吸取500μl的标准微球试剂到流式管。标准微球试剂包含了4中直径的微球：0.16μm、0.2μm、0.24μm以及0.5μm。

(2)流式细胞仪参数设置：所有的参数均选择信号高度(“xxx-h”)。

a.分析时间：1到2分钟；

b.分析速度：低速，10-15μl/min；

c.ssc：电压600v；

d.fsc：电压800v；

e.fitc：电压580v；

f.获取所有参数的对数值；

g.选择per-cp参数用于计数微粒。

对于megamixplusssc微球的获取方案，设立：

a.一个细胞象限图fitc-hxssc-h(彩色点阵图)和4个矩形区p1到p4(参见图1)；

b.一个直方图ssc-hx经boolean门(p1或p2或p3或p4)调控的计数(参见图2)；

c.一个细胞象限图fsc-hxssc-h和一个矩形区(参见图3，4和5)；

(3)fitc和ssc电压的设置(参见图1)；

继续获取megamixplusssc微球；在fitc上选择一个阈值，阈值＝200a.u，用于消除荧光污染物(仪器的背景)；

(4)ssc分辨率和mp区边界评估(参见图2)；

a.在ssc-hx计数直方图上设门于0.16μm、0.2μm、0.24μm以及0.5μm的微球单峰(设门p1或p2或p3或p4)，确认可分辨出4个独立的峰。

b.为了确定标准化“mp门”，根据公式1计算ssc范围的边界，并将0.5μm的ssc-h结束点作为最高边界。公式1低ssc-h水平＝md0.16+(0.3x(md0.20-md0.16))。

(5)双散射的mp设门(图3)

根据ssc-h(log)范围确定门区域边界后，可在双散射图上建立相应区域，用于后续pmps的分析。

(6)ssc阈值的设置

再度运行megamixplusssc微球，转换阈值为ssc。ssc阈值为公式1计算得到的a.u值。整个pmps分析都限制在该阈值内具有ssc数值的物质，因此排除了所有0.16μm的微球。

3、pmps表达的分析和诊断效率的评估。

(1)pmps的计数公式：((p9events+p14events)/p11events)*(totalbeadscounts/290μl)。

(2)统计学分析：利用graphpadprism5.0软件对所得的pmps表达数据进行统计学分析，比较pe患者与正常对照组间差异。

(3)pte患者的血浆pmps水平高于正常人水平(中位数：764.00/μlvs440.40/μl)。对pmps进行受试者工作特征曲线分析，得到曲线下面积为0.855，诊断临界值为716.90/μl，在此临界值上的灵敏度和特异度分别为58.82％及95.92％。阳性似然比为14.41，阴性似然比为0.43。阳性预测值为93.75％，阴性预测值为69.12％，youden's指数为54.74％。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

发明人声明，本发明通过上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程。并且即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。