本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种表面等离激元共振传感器、制备方法及定量检测方法。
背景技术：
mirna是单链的小分子rna，长度为20-24个碱基，控制着包括细胞凋亡、繁殖、器官发生、发育、肿瘤发生及造血等。自从1993年首次发现后，目前mirbase数据库共发布了9539种mirna，其中mirna155和mirna21等在肿瘤发生时具有高表达，mirna被认为是肿瘤发生的信号标志物，关于mirna155和mirna21的超灵敏度检测研究，对肿瘤等疾病的诊断具有重要意义。表面等离激元共振传感器(sprbiosensor，或称表面等离激元共振生物传感器)具有实时监测、免标记、检测周期短、稳定性好等优点，可以实现蛋白质和dna的免标记检测，但是，由于金膜作为spr芯片对生物探针分子的固定量有限等因素，严重制约了spr技术对mirna等小分子的超灵敏度检测。
目前主要的检测mirna的技术方法主要是：rna印迹法、聚合酶链式反应(pcr)、微阵列芯片等，现有技术存在的主要问题是：(1)需要荧光分子标记，程序繁琐，(2)检测周期长，(3)检测灵敏度低。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种表面等离激元共振传感器、制备方法及定量检测方法，旨在解决现有技术中mirna检测方式灵敏度低、周期长、程序繁琐等问题。
本发明的技术方案如下：
一种基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，包括步骤：
a、将二维锑烯纳米材料溶于水中，得到浓度为0.01-10mg/ml的锑烯水溶液；
b、将表面等离激元共振传感器芯片浸泡在锑烯水溶液中，浸泡时间为0.01-48小时；
c、将步骤b处理后的表面等离激元共振传感器芯片浸泡在碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液中，浸泡时间为0.01-24小时，得到基于锑烯的表面等离激元共振传感器。
所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，所述步骤a之前还包括：
预先对块状锑烯纳米材料进行球磨和超声剥离，再进行真空干燥得到二维锑烯纳米材料。
所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，所述步骤b中，浸泡完成后，使用去离子水除去没有吸附的锑烯水溶液。
所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，所述步骤c中，浸泡完成后，然后使用去离子水除去没有吸附的单链dna修饰的金纳米棒溶液。
所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，所述碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液的制备方法如下：
将二硫键修饰的单链dna分子水溶液加入到金纳米棒溶液中，静置过夜，然后加入磷酸缓冲溶液，静置一段时间后，真空离心浓缩，去除未连结的单链dna分子。
所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，最终将浓缩后的溶液分散在磷酸缓冲盐溶液中。
所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，所述芯片材料制备方法如下：在玻璃或者石英表面镀制金膜。
所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其中，所述金膜厚度为30-60纳米。
一种基于锑烯的表面等离激元共振传感器，其中，采用如上任一项所述的制备方法制成。
一种mirna的定量检测方法，其中，包括步骤：
在多个样品池中，准备如上所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器；
配置不同浓度的目标mirna，并将放入相应样品池中；
利用表面等离激元共振生物传感器测试表面等离激元共振光谱曲线，确定共振峰位的变化，并根据所述变化对目标mirna进行定量检测。
有益效果：本发明通过在表面等离激元共振传感器芯片表面组装锑烯，采用金纳米棒的信号放大作用，能够超灵敏的检测mirna，通过分析表面等离激元共振传感器光谱曲线的共振峰的变化，定量检测mirna的浓度，具有超低的检测极限，最低检测极限为10-17m。结果表明，本发明可以解决目前降低mirna检测极限困难的问题。本发明检测方法简单、经济、高效、稳定，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明二维锑烯纳米材料的原子力显微镜图片(afm)。
图2为本发明不同浓度(10-17-10-11m)的mirna溶液对应的spr光谱曲线图。
图3为本发明不同浓度(10-17-10-11m)的mirna溶液检测结果图。
具体实施方式
本发明提供一种表面等离激元共振传感器、制备方法及定量检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供的一种基于锑烯的表面等离激元共振传感器的制备方法，其包括步骤：
s1、将二维锑烯纳米材料溶于水中，得到浓度为0.01-10mg/ml的锑烯水溶液；
s2、将表面等离激元共振传感器芯片浸泡在锑烯水溶液中，浸泡时间为0.01-48小时；
s3、将步骤s2处理后的表面等离激元共振传感器芯片浸泡在碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液中，浸泡时间为0.01-24小时，得到基于锑烯的表面等离激元共振传感器。
本发明中，锑烯纳米材料作为二维纳米材料，具有化学稳定性高、亲水、极性高等优点，锑烯纳米材料与单链dna具有较强的相互作用，结合力远远大于双链dna。
本发明将二维材料锑烯作为spr芯片的敏感层，使用spr技术对mirna进行灵敏检测，具有超低的检测极限，能够检测到浓度为10-17mmirna浓度变化。
本发明将锑烯组装在spr芯片表面，基于金纳米棒的信号放大作用，利用ssdna作为探针分子，当分析溶液中存在目标分子mirna时，spr光谱曲线左移，实现超低检测极限的检测mirna。
具体地，所述步骤s1之前还包括：
预先对块状锑烯纳米材料进行球磨和超声剥离，再进行真空干燥得到二维锑烯纳米材料。
具体可使用球磨机对块状锑烯纳米材料进行球磨得到粉状锑烯纳米材料，球磨后利用探针超声法对粉状锑烯纳米材料进行超声剥离。然后通过离心获得片状单层或少层锑烯溶液，通过真空干燥获得二维锑烯纳米材料粉末。
在所述步骤s1中，将二维锑烯纳米材料溶于水中，得到锑烯水溶液；即将超声剥离后的二维锑烯纳米材料溶于水中，得到分散性良好的锑烯水溶液。其浓度优选为0.01-10mg/ml，例如可以为1mg/ml。
在所述步骤s2中，将表面等离激元共振传感器芯片浸泡在锑烯水溶液中，浸泡时间为0.01-48小时。例如，可将表面等离激元共振传感器芯片放入spr样品池，再将锑烯水溶液通入spr样品池，从而进行浸泡处理。在浸泡完成后，使用去离子水除去没有吸附的锑烯水溶液，即去除多余的锑烯水溶液。
在所述步骤s3中，将表面等离激元共振传感器芯片浸泡在碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液中。具体地，将碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液通入到装有表面等离激元共振传感器芯片的spr样品池，从而进行浸泡处理。在浸泡完成后，使用去离子水除去没有吸附的单链dna修饰的金纳米棒溶液，即去除多余的单链dna修饰的金纳米棒溶液。
上述步骤s2和步骤s3中，所使用的去离子水优选为经过除氧处理。
进一步，所述碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液的制备方法如下：
将二硫键修饰的单链dna分子水溶液加入到金纳米棒溶液中，静置过夜，然后加入磷酸缓冲溶液，静置一段时间后，真空离心浓缩，去除未连结的单链dna分子。碱基互补的单链dna连结金纳米棒，与锑烯具有较强相互作用，大量吸附在锑烯表面。
真空离心浓缩的次数可以是多次，例如三次，从而得到浓缩后的溶液(即浓缩液)，以去除未连结的单链dna分子。
最终将浓缩后的溶液分散在磷酸缓冲盐溶液中，进行保存。
优选的，所述芯片材料制备方法如下：在玻璃或者石英表面镀制金膜。本发明利用锑烯吸附在金膜表面，单链dna与锑烯具有很强的相互作用，连结金纳米棒的单链dna大量吸附在锑烯表面。传感过程就是利用mirna与单链dna通过碱基互补形成了双链，使原本吸附在锑烯表面的金纳米棒和单链dna脱离锑烯表面，减小碱基互补的单链dna连结金纳米棒在锑烯表面的数量。
优选的，所述金膜厚度为30-60纳米，例如，所述金膜厚度为45纳米。
本发明还提供一种基于锑烯的表面等离激元共振传感器，采用如上所述的制备方法制成。
本发明还提供一种mirna的定量检测方法，其包括步骤：
在多个样品池中，准备如上所述的基于锑烯的表面等离激元共振传感器；
配置不同浓度的目标mirna，并将放入相应样品池中；
利用表面等离激元共振生物传感器测试表面等离激元共振光谱曲线，确定共振峰位的变化，并根据所述变化对目标mirna进行定量检测。例如，按照目标mirna浓度由低到高的顺序，将目标mirna依次通入装有表面等离激元共振传感器的样品池中，并浸泡0.01-24小时，例如5小时；从而利用表面等离激元共振生物传感器测试表面等离激元共振光谱曲线，确定共振峰位的变化。
本发明使用锑烯与碱基互补的探针ssdna的相互作用，应用表面等离激元共振技术，检测不同浓度的mirna，通过spr光谱曲线共振角的线性变化，实现对mirna的超灵敏度检测。
本发明充分利用锑烯二维纳米材料与探针ssdna较强的相互作用，当mirna与探针杂化形成双链后，使spr光谱曲线移动减小，实现定量检测mirna。根据本发明的传感器，通过使用金纳米棒与探针ssdna连结，增大目标mirna的灵敏度和降低检测极限。
一个具体的实例如下：
1)准备二维锑烯纳米材料
使用球磨机对块状锑烯材料进行球磨，利用探针超声法对其进行超声剥离，然后通过离心获得片状单层或少层锑烯溶液，通过真空干燥获得锑烯纳米材料粉末，配置成不同浓度的锑烯溶液，锑烯测试图参见图1，锑烯原子力显微镜表征图。
2)碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液制备
将250μl、40μm的二硫键修饰的单链dna分子水溶液加入到3ml、6nm的金纳米棒溶液中，静置过夜，然后加入3ml磷酸缓冲溶液，静置2h后，真空离心浓缩至0.9ml，真空离心浓缩三次，去除未连结的单链dna分子，最终将浓缩液分散在磷酸缓冲盐溶液中。
3)锑烯水溶液在spr芯片金膜表面的组装
将1mg/ml的锑烯水溶液通入spr样品池，经过5小时浸泡，然后通入除氧的去离子水，去除没有吸附在芯片表面的多余的锑烯。
4)金纳米棒与单链dna在锑烯表面的吸附
将高浓度(10-11-10-3m，如10-5m)的碱基互补的单链dna修饰的金纳米棒溶液通入spr样品池，经过0.5小时浸泡，然后使用除氧的去离子水除去没有吸附的金纳米棒和单链dna。
5)检测不同浓度的碱基匹配的mirna分子
将浓度为10-17-10-11m的mirna溶液按照低浓度到高浓度分别通入spr样品池，分别测试spr光谱曲线和动力学曲线，不同浓度对应的spr光谱曲线参见图2，分析spr光谱曲线共振角度变化情况，参见图3，实现不同浓度mirna分子的超灵敏度检测。
本发明方法检测mirna分子方法简单，灵敏度高，可操作性强。作为一种新型的mirna分子生物传感器，表现出了极高的灵敏度和极低的检测极限，其最低检测极限为10-17m。
综上所述，本发明通过在表面等离激元共振传感器芯片表面组装锑烯，采用金纳米棒的信号放大作用，能够超灵敏的检测mirna，通过分析表面等离激元共振传感器光谱曲线的共振峰的变化，定量检测mirna的浓度，具有超低的检测极限，最低检测极限为10-17m。结果表明，本发明可以解决目前降低mirna检测极限困难的问题。本发明检测方法简单、经济、高效、稳定，具有良好的应用前景。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。