本发明涉及化学检验领域和药物分析领域技术，特别是一种医用交联透明质酸钠凝胶的体外酶解率的检测方法。
背景技术：
：医用交联透明质酸钠凝胶适用于面部皮肤真皮层的填充，在体内可被酶解吸收，因此需建立一种评价该产品的降解情况的检验方法，以更好地对产品的质量加以控制。现有的行业标准yy/t0962-2014《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中对该指标有要求，但是没有明确检验方法。通过本发明来检测产品，能有效体现该产品的降解情况，而且实验结果准确可靠，重现性好。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于针对现有的行业标准没有明确降解试验的检测方法的情况下，建立一个全新的医用交联透明质酸钠凝胶的体外酶解率的检测方法。本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：一种医用交联透明质酸钠凝胶的体外酶解率的检测方法，包括如下步骤：(1)样品的配制步骤；(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤；(3)将步骤(2)的标准液系列各试管和步骤(1)的样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液5ml，边加边摇匀；加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温；各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温；用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度；用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。在本发明的一个优选实施例中，所述四硼酸钠硫酸溶液使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时。在本发明的一个优选实施例中，所述步骤(1)的样品的配制步骤具体是：准备6份样品，分别精密称取适量样品置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、透明质酸酶溶液1.0ml，加盖或塞，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于三个不同的时间点取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活；将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度；充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中；精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。在本发明的一个优选实施例中，所述分别精密称取适量样品置于10ml西林瓶中样品量为0.20g。在本发明的一个优选实施例中，所述透明质酸酶的浓度为8u/ml。在本发明的一个优选实施例中，所述分别于三个不同的时间点取出2份中的三个不同时间点分别为1h、3h、24h。在本发明的一个优选实施例中，所述步骤(2)的葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤具体是：精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月；临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；按下表制备葡萄糖醛酸标准液系列：。本发明是一个全新的检验方法，实验结果更准确、可靠，重现性好。具体实施方式：通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它不是对本发明的限定。实施例1实验方法与过程(1)样品的配制步骤分别精密称取0.20g样品6份，置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、8u/ml透明质酸酶溶液1.0ml，加盖(塞)，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度。充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中。精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月。临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按表1制备葡萄糖醛酸标准液系列。表1试管号0123456ga标准溶液，ml00.10.20.30.40.50.6蒸馏水，ml1.00.90.80.70.60.50.4ga含量，μg/ml020406080100120(3)将标准液系列各试管和样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液(使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时)5ml，边加边摇匀。加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温。各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温。用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。(4)实验结果实验结果见表2表2实施例2实验方法与过程(1)样品的配制步骤分别精密称取0.20g样品6份，置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、8u/ml透明质酸酶溶液1.0ml，加盖(塞)，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于2h、5h、18h取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度。充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中。精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月。临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按表3制备葡萄糖醛酸标准液系列。表3试管号0123456ga标准溶液，ml00.10.20.30.40.50.6蒸馏水，ml1.00.90.80.70.60.50.4ga含量，μg/ml020406080100120(3)将标准液系列各试管和样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液(使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时)5ml，边加边摇匀。加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温。各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温。用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。(4)实验结果实验结果见表4表4实施例3实验方法与过程(1)样品的配制步骤分别精密称取0.20g样品6份，置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、8u/ml透明质酸酶溶液1.0ml，加盖(塞)，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于0.5h、7h、20h取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度。充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中。精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月。临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按表5制备葡萄糖醛酸标准液系列。表5(3)将标准液系列各试管和样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液(使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时)5ml，边加边摇匀。加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温。各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温。用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。(4)实验结果实验结果见表6表6实施例4实验方法与过程(1)样品的配制步骤分别精密称取0.50g样品6份，置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、8u/ml透明质酸酶溶液1.0ml，加盖(塞)，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度。充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中。精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月。临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按表7制备葡萄糖醛酸标准液系列。表7试管号0123456ga标准溶液，ml00.10.20.30.40.50.6蒸馏水，ml1.00.90.80.70.60.50.4ga含量，μg/ml020406080100120(3)将标准液系列各试管和样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液(使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时)5ml，边加边摇匀。加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温。各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温。用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。(4)实验结果实验结果见表8表8实施例5实验方法与过程(1)样品的配制步骤分别精密称取0.10g样品6份，置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、8u/ml透明质酸酶溶液1.0ml，加盖(塞)，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度。充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中。精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月。临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按表9制备葡萄糖醛酸标准液系列。表9试管号0123456ga标准溶液，ml00.10.20.30.40.50.6蒸馏水，ml1.00.90.80.70.60.50.4ga含量，μg/ml020406080100120(3)将标准液系列各试管和样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液(使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时)5ml，边加边摇匀。加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温。各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温。用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。(4)实验结果实验结果见表10表10实施例6实验方法与过程(1)样品的配制步骤分别精密称取0.20g样品6份，置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、20u/ml透明质酸酶溶液1.0ml，加盖(塞)，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度。充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中。精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月。临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按表11制备葡萄糖醛酸标准液系列。表11试管号0123456ga标准溶液，ml00.10.20.30.40.50.6蒸馏水，ml1.00.90.80.70.60.50.4ga含量，μg/ml020406080100120(3)将标准液系列各试管和样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液(使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时)5ml，边加边摇匀。加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温。各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温。用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。(4)实验结果实验结果见表12表12实施例7实验方法与过程(1)样品的配制步骤分别精密称取0.20g样品6份，置于10ml西林瓶中，依次加入pbs2ml、4u/ml透明质酸酶溶液1.0ml，加盖(塞)，置37℃恒温水浴震荡，转速70rpm，分别于1h、3h、24h取出2份，立即置沸水浴中煮沸30分钟灭活。将酶解灭活液转移至25ml容量瓶中，并用适量pbs冲洗西林瓶内壁，液体转移至容量瓶中，用pbs定容至刻度。充分混匀后移取4ml于5ml离心管中，经12000r/min，离心15min，静置，取1ml上清液于试管中。精密称取样品0.01g置于试管中，加入纯化水至1.0g，精密称定，作为未酶解样品，制备2份。(2)葡萄糖醛酸标准液系列的配制步骤精确称取10mg葡萄糖醛酸于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，在4℃下贮存，有效期3个月。临用前取2ml至10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。按表13制备葡萄糖醛酸标准液系列。表13试管号0123456ga标准溶液，ml00.10.20.30.40.50.6蒸馏水，ml1.00.90.80.70.60.50.4ga含量，μg/ml020406080100120(3)将标准液系列各试管和样品试管一起置冰水浴中，用酸式滴定管缓慢地向每管中加入0.025mol/l四硼酸钠硫酸溶液(使用之前在4℃冰箱内贮存至少2小时)5ml，边加边摇匀。加毕后混匀并置沸水浴中加热10分钟后取出，冷却至室温。各试管内均加入0.125％咔唑乙醇液0.2ml，充分混匀后，置沸水浴中加热15分钟后取出，冷却至室温。用0号管作对照，用分光光度计测定530nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度-浓度曲线，根据样品管吸光度从曲线上查的待测样品管葡萄糖醛酸含量。然后根据计算公式计算得出体外酶解率。(4)实验结果实验结果见表14表14将以上实施例结果数据汇总结果如下：由上表可得出结论，实施例1、实施例2、实施例3分别在不同的时间点取出2份样品，3h的酶解率可以达到50％，18h的酶解率已经超过90％，24h已基本酶解完全，从9个时间点中选取三个酶解率有差距，且相对平均偏差较小的时间点。综合考虑，1h，3h，24h为最佳时间点。实施例1、实施例4、实施例5中所取的样品量不同，样品量过多，24h的酶解率偏高，样品量偏低，三个时间点的酶解率都偏高，因此样品量取0.20g为宜。实施例1、实施例6和实施例7所用的酶解液的浓度不同，酶解液浓度过高，3h和24h的酶解率接近；酶解液的浓度过低，1h和3h的酶解率接近，因此酶解液浓度为8u/ml为宜。用本发明来检测医用交联透明质酸钠凝胶的体外酶解率，实验结果可靠，重复性好。当前第1页12