一种海藻酸钠液滴辅助生命物质质谱制样和离子化的方法与流程

本发明涉及生物样品质谱技术，特别是借助凝胶微流控液滴技术辅助的生命 物质质谱制样和离子化技术。

背景技术：

质谱自1912年诞生以来，以其对荷质比的超高分辨能力成为分析科学不可 或缺的关键手段。其分析对象从小分子逐渐向大分子发展，从简单体系向复杂体 系发展。特别是上世纪90年代包括MALDI和ESI在内的多种生物软电离技术 的发明，加速了质谱在生命科学研究领域的应用。由于质谱特殊的分析原理，相 比其它分析方法，质谱对复杂体系进行高内涵分析具有独特的优势，特别是面对 物质关系错综复杂的生命系统，质谱对多种成分的同时分析能力无可替代。

但是作为生命体系，除了分析的体积和内涵的要求外，还有一点不可忽视， 那就是生命是具有结构和富于变化的。生命物质并不均质，容易损坏和变性，很 多物质只是由于处于特定的时空和物质环境才能维持存在并具有特定的结构和 功能。因此对样品进行破坏性的制样对生物样品特别是包含细胞的样品的精确解 析是致命的，细胞一旦破坏，物质扩散将降低物质被分析的概率，留给分析的时 间也大大降低；同时由于物质混合导致的分子破坏将进一步削弱分析结果与实际 情况的符合度。另一方面，由于生命样品本身所具有的盐分对质谱解析影响较大， 对盐分进行分离以适应质谱分析的要求又十分必要，是获得丰富质谱信息的关键 之一。因此要实现可靠的生命相关样品的分析，需要开发全新的制样和质谱离子 化技术，以同时满足维持被分析物生物学活性、抑制扩散、抑制物质过度混合、 除盐以及延长可分析时间的要求。

微流控液滴发生系统是本世纪初发展起来的一种高通量物质操控技术，微液 滴技术和质谱结合能够很好地实现样品的取样并抑制样品的扩散和样品间的相 互干扰。但是由于通常使用水油两相形成微液滴，其中的油相会形成背景，因此 其应用还相对局限。如何利用微流控芯片质谱制样的优势，是发展质谱生命物质 制样和分析的关键问题。

技术实现要素：

(1)要解决的技术问题

本发明要解决的主要问题是如何进行生命物质的质谱制样，同时能够满足保 持样品生物学活性，进行样品除盐的前处理，但又能最大程度抑制生物学活性物 质的扩散，抑制物质在制样过程中的过度混合，同时又有助于获得关于样品较多 的质谱信息。

(2)技术方案

一种海藻酸钠液滴辅助生命物质质谱制样和离子化方法，它包括以下步骤：

步骤1.将待分析物质与海藻酸钠溶液均匀混合；

步骤2.将上述混合溶液装入带针头的样品管3，并安装到离心力凝胶小球 发生装置的离心管4中，离心管(4)中事先装有含有钙离子的固化溶液(5)， 通过离心力驱动挤出样品与海藻酸钠混合溶液，形成所需尺寸的包覆有样品的海 藻酸钠凝胶球；

步骤3.取一个装载有待分析物质的海藻酸钠凝胶球装载入电喷雾质谱的毛 细管喷头，向喷雾毛细管中添加喷雾萃取剂(或溶剂)，将喷雾毛细管与质谱喷雾 电极相连，开启质谱电源进行样品分析，喷雾萃取剂在质谱离子源电场的作用下 对海藻酸钠凝胶球中装载的带分析物质进行萃取并在毛细管喷头尖端发生电喷 雾，使待测物质分子带上电荷，并在电场等的作用下进入质谱，实现带测物质的 质谱检测。

上述的海藻酸钠液滴辅助生命物质质谱制样和离子化方法，所述的海藻酸钠 溶液是2-3％的海藻酸钠的PBS溶液。

上述的海藻酸钠液滴辅助生命物质质谱制样和离子化方法，所述的含有钙离 子的固化溶液(5)是质量分数NaCl为0.9％，CaCl2为1％的水溶液。

一种上述的海藻酸钠液滴辅助生命物质质谱制样和离子化方法所采用的离 心力凝胶小球发生装置，如图1所示，它包括一个能够以所设定速度进行离心的 电动机1系统，在该装置上还包括一个能够用于装载样品-海藻酸钠混合溶液的 带针头的样品管3，带针头的样品管3的针头置于离心管4内，离心过程中混合 溶液由于离心力作用将从该针头3挤出，由于表面张力的不稳定性，在一定的离 心速度和溶液浓度下将形成混合溶液的小球，挤出的小球进入接收小球的离心管 4内，该离心管4中装有一定浓度的含有钙离子的固化溶液5，能够在混合溶液 小球接触该溶液后促使小球凝胶化，该离心管4与样品管在离心过程中保持位置 相对固定，一起做离心运动。

本发明的具体效果如下：

本发明通过凝胶混合包覆样品，将样品定量分散到空间离散的凝胶小球中。 该方法克服了制备过程中需要油相的瓶颈，能够高通量形成含有样品的凝胶液滴， 并借助其所具有的生物相容性，使样品在整个过程中维持较好的生物活性，保持 其结构的完整性和有序性。同时该系统继承了液滴微流控系统具有的操控灵活性、 抑制样品扩散和样品间相互干扰的优点。这种凝胶液滴形式的颗粒对质谱信号并 无背景干扰，且在制样和分析上带来了传统方法所不具备的巨大优势。实际分析 过程中凝胶颗粒只有在到喷雾尖端时才打开高压电场，凝胶有效保护了生物样品 在受到外场瞬间解体时，其中的盐分快速电泳分离，而其中的生物大分子相对局 域，扩散受到抑制。而且由于凝胶电泳的存在，不同的生物大分子得到一定程度 的分离，喷雾时间可通过电场调控，可以长达分钟级别，大大增强了对生命物质 的解析能力。而且这种紧接而来的分离抑制了生物样品内物质的相互作用，减少 了分子降解。更有价值的是这种凝胶辅助的质谱分析相比单纯的ESI更软，能够 允许通常无法观察到的大分子结合体出现信号，鉴于生命过程涉及大多数蛋白酶 过程都以组装体的形式发生，这种更软的电离效果对认识细胞内代谢过程是十分 重要的，在生命样品快速分析、个性化医疗、药效分析、靶向分子识别上具有广 阔的应用前景。

附图说明

图1.微流控单细胞海藻酸钠液滴制备装置示意图，1、电动机，2、链接器， 3、带针头的样品管，4、离心管，5、固化溶液；B.制备的单细胞海藻酸钠液 滴的几何结构表征；

图2.生物样品在海藻酸钠液滴中的活性分析。a.溶菌酶的蛋白凝胶球溶液3小时荧光对比；b.HL-60细胞中提取的DNA的凝胶球溶液3小时荧光对比；c. HL-60细胞凝胶球3小时培养对比图；a图左侧为刚形成蛋白凝胶球的荧光照片， 照片中黄色亮球为蛋白荧光染料与蛋白质结合后发出的光线，其亮度代表了蛋白 的浓度，右侧图片为放置3小时后的蛋白凝胶球荧光照片，从照片中黄色小球的 亮度比较中发现基本没有变化，说明凝胶球可以有效的锁住蛋白质，并保证蛋白 质不发生降解；b图左侧为刚形成DNA凝胶球的荧光照片，照片中绿色亮球为 DNA荧光染料与DNA结合后发出的光线，其亮度代表了DNA的浓度，右侧图 片为放置3小时后的DNA凝胶球荧光照片，从照片中绿色小球的亮度比较中发 现基本没有变化，说明凝胶球可以有效的锁住DNA，并保证DNA不发生降解； c图为凝胶球中包裹HL-60细胞后培养3小时的AO-EB染色荧光图片，其中发 出绿色荧光的为活体细胞，红色的为死亡细胞，从图中可以看出经过3小时培养 的HL-60细胞仍然有70％以上活体细胞，证明该方法有较好的生物相容性，可 以作为一种质谱分析的样品预处理方案。

图3.凝胶液滴血红蛋白(取自猪血)电喷雾质谱典型图谱。A.凝胶球包裹 血红蛋白电喷雾质谱图；B.无凝胶球包裹血红蛋白PBS溶液电喷雾质谱图。样 品本底溶液1X PBS，电喷雾流动相使用乙酸0.1％的甲醇水(V∶V＝1∶1)溶液。A 图中可获取明确的血红蛋白多电荷质谱信号，B图中未发现任何血红蛋白质谱信 号。

图4.凝胶液滴DNA电喷雾质谱典型图谱(对比没有凝胶保护直接碰DNA)。 A.凝胶球包裹20DP的DNA电喷雾质谱图；B.无凝胶球包裹20DP的DNA的 PBS溶液电喷雾质谱图。样品本底溶液1X PBS，电喷雾流动相使用甲醇水 (V∶V＝1∶1)溶液。A图中可获取明确的DNA多电荷质谱信号，B图中未发现任 何DNA质谱信号。

图5.凝胶液滴HL-60细胞样品电喷雾质谱典型图谱。A.凝胶球包裹HL-60 单个细胞电喷雾质谱图；B.无凝胶球包裹HL-60细胞的PBS细胞悬液电喷雾质 谱图。样品本底溶液1X PBS，电喷雾流动相使用乙酸0.1％的乙腈水(V：V＝2∶1) 溶液。A图中可获取明确的细胞中Gln和ADP等细胞内物质的质谱信号，B图 中未发现任何细胞中物质的质谱信号，仅观察到大量的盐的质谱干扰峰。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：基于离心力凝胶球发生器的质谱样品制备方法

使用移液枪量取100ul待测溶液，向待测溶液中添加150ul含有3％海藻酸钠的PBS 溶液。将两种溶液混匀后，取少量混合溶液加入图1中带针头的样品管3中，在离 心管4中加入200μL含有1％CaCl2生理盐水，然后启动电动机1，调节转速到4000 转/分钟，离心1分钟便可在离心管4中获取所需的含有样品的凝胶球。

实施例2：血红蛋白的凝胶球质谱分析

称取0.002g血红蛋白(取自猪血)，使用PBS 1mL溶解备用；使用PBS配置质量分 数为3％的海藻酸钠溶液备用；配置质量分数为NaCl 0.9％，CaCl2 1％的水溶液(固 化溶液5)备用。称取0.01g血红蛋白(取自猪血)，使用PBS 1mL溶解，作为对 比实验样品。

实验中，取血红蛋白溶液100μL添加到200μL海藻酸钠溶液中，混匀。向图 1中的离心管4加入200μL固化溶液5，并放好带针头的样品管3。取适量血红蛋白 的海藻酸钠溶液加入到带针头的样品管3中，选择转速4000转/分钟，进行离心制 样，制成直径约为150μm左右的海藻酸钠样品球备用。

取一个含有血红蛋白的凝胶球置于喷雾毛细管尖部，然后向毛细管中注入含 乙酸0.1％的甲醇水(V∶V＝1∶1)溶液，并接通电离源电极，进行质谱分析分析结 果如图3A，图中插图为血红蛋白形成的带有不同电荷量的质谱信号。图3B，为 向喷雾毛细管中直接注入血红蛋白PBS溶液，并进行质谱分析，图中较多的盐簇 信号，而没有获得血红蛋白信号。

实施例3：DNA凝胶球质谱分析

取10OD的DNA样品，使用PBS 1mL溶解备用；使用PBS配置质量分数为2％的海 藻酸钠溶液备用；配置质量分数为NaCl 0.9％，CaCl2 1％的水溶液(固化溶液5) 备用。

实验中，取DNA溶液100μL添加到200μL海藻酸钠溶液中，混匀。向图1中 离心管加入200μL固化溶液，并放好带针头的样品管3。取适量DNA的海藻酸钠 溶液加入到带针头的样品管3中，选择转速4000转/分钟，进行离心制样，制成直 径约为150μm左右的海藻酸钠样品球备用。

取一个含有DNA的凝胶球置于喷雾毛细管尖部，然后向毛细管中注入甲醇 水(V∶V＝1∶1)溶液，并接通电离源电极，进行质谱分析分析结果如图4A， m/z1000-1500为DNA形成的带有不同电荷量的质谱信号。图3B为向喷雾毛细管 中直接注入DNA的PBS溶液，并进行质谱分析，图中较多的盐簇信号，而没有获 得DNA信号。

实施例4：单个HL-60细胞凝胶球质谱分析

将5mL的HL-60培养液900转离心2分钟，去掉培养液，使用5mL PBS吹打， 离心后再使用5mL PBS吹打，然后使用PBS溶液将细胞浓度稀释至1×103个每毫 升左右备用；使用PBS配置质量分数为3％的海藻酸钠溶液备用；配置质量分数 为NaCl 0.9％，CaCl2 1％的水溶液(固化溶液5)备用。

实验中，取HL-60的PBS溶液100μL添加到200μL海藻酸钠溶液中，混匀。 向图1中离心管加入200μL固化溶液，并放好带针头的样品管3。取适量HL-60的 海藻酸钠溶液加入到带针头的样品管3中，选择转速4000转/分钟，进行离心制样， 制成直径约为150μm左右的海藻酸钠样品球备用。

取含有单个HL-60细胞的凝胶球置于喷雾毛细管尖部，然后向毛细管中注入 含乙酸0.1％的乙腈水(V∶V＝2∶1)溶液，并接通电离源电极，进行质谱分析分析 结果如图5A，图中插图为HL-60细胞的质谱信号，其中在m/z700-900之间有部分 磷脂类物质信号。图5B，为向喷雾毛细管中直接注入HL-60细胞的PBS溶液，并 进行质谱分析，图中较多的盐簇信号，而没有获得任何细胞内容物信号。