发红色荧光的金纳米团簇的制备方法及用于青霉胺的检测方法与流程

本发明属于金纳米团簇制备及应用技术领域，具体涉及发红色荧光的金纳米团簇的制备方法及用于青霉胺的检测方法，特别涉及该材料用于实际水样和尿液中青霉胺浓度的定量分析。

背景技术：
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青霉胺是青霉素的水解代谢产物，在药学中有重要的应用价值。青霉胺可以用于治疗纤维性肺病，重金属中毒，进行性系统性硬化病。作为一种免疫抑制剂,通过减少T-淋巴细胞的个数，常用来治疗类风湿关节炎。它还可以用于治疗威尔逊症，通过与体内积累的铜发生配位作用来调节体内紊乱的铜代谢。青霉胺虽然可以治疗多种疾病，但是他还会引起一些副作用。20-30％服用青霉胺的患者会产生副作用，例如骨髓抑制，味觉障碍，厌食症，呕吐与腹泻等。发展快速，灵敏的青霉胺的检测方法对于临床指导用药具有重要的应用价值。现有研究证实每日服用剂量的20-50％在24小时后可以通过尿液排出体外，因此检测尿液中青霉胺的含量可以对青霉胺的治疗过程进行监测与评价。现在有多种方法可以用于青霉胺的检测，包括化学发光，电化学，液相色谱等。这些传统检测方法虽然能够满足分析中的基本要求，但是总是存在仪器体积巨大笨重、操作繁琐耗时、价格昂贵、样品前处理过程复杂等问题。荧光传感方法的应用可以克服上述问题，但是仍需通过构建新的识别原理和信号输出模式提高检测的灵敏度。

近年来，以金属纳米发光材料作为光学单元的荧光化学传感器显示了巨大的应用潜力。他们具有小的尺寸，良好的光稳定性，可调的表面特性以及基于尺寸的高发光效率，具有广泛的应用前景。通过在金属纳米材料的表面进行功能调节，获得发稳定红色荧光的纳米材料，利用新型的荧光化学传感原理与方法，建立快速灵敏检测青霉胺的技术，目前还未见报道。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供发红色荧光的金纳米团簇的制备方法及用于青霉胺的检测方法，在不引入强还原剂的条件下，利用11-巯基十一烷酸，同时做为还原剂和稳定剂，简化材料制备过程，温和反应条件下合成发红色荧光的金团簇，通过铜离子调控其荧光，利用竞争配位作用，实现荧光由打开-关闭-打开的对青霉胺的快速灵敏识别过程。铜离子猝灭的金团簇体系可用于荧光增强型检测实际水样和尿液中的青霉胺。

本发明所提供的发红色荧光的金纳米团簇的制备方法包括以下步骤：

在制备之前将所有玻璃器皿与磁力搅拌子在王水中浸泡10-120分钟，并用超纯水多次冲洗备用；将11-巯基十一烷酸(MUA)加入装有超纯水的圆底烧瓶中，随后加入碱液控制氢氧根离子浓度为0.02-0.1mol/L，搅拌5-30分钟以后加入的氯金酸反应并持续搅拌3-24小时后停止反应，将反应溶液加入透析袋中透析3-48小时，然后离心，取出上层清液，得到所述的金纳米团簇；本发明中11-巯基十一烷酸与金的摩尔比为(2-8):1；所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液。本发明在制备过程中没有额外加入还原剂，其中11-巯基十一烷酸既做为还原剂，也是稳定剂，反应条件更温和。

本发明提供一种发红色荧光的金纳米团簇用于青霉胺的检测方法的具体步骤如下：

(1)铜离子猝灭金纳米团簇的混合体系的制备：

将金纳米团簇(MUA-AuNCs)加入pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，记录其荧光强度值，随后不断向体系中加入铜离子，随着铜离子浓度增加，荧光强度逐渐降低，当荧光强度猝灭至百分之八十时的铜离子浓度做为最优的铜离子浓度，混合铜离子与金纳米团簇形成荧光猝灭的混合体系(MUA-AuNCs-Copper ensemble)，用于下一步检测青霉胺。

本发明中将MUA-AuNCs的荧光猝灭的铜离子，可以是一价铜离子，也可以是二价铜离子，猝灭效果相同。本发明中铜离子对MUA-AuNCs荧光的猝灭作用是基于电子转移。铜离子做为电子受体，金团簇做为电子供体，发生电子转移过程，而破坏了Au表面Au与S之间的电荷转移过程，致使荧光猝灭。相关原理已通过荧光寿命，X射线光电子能谱得到证实。

(2)荧光猝灭的混合体系MUA-AuNCs-Copper ensemble用于青霉胺荧光增强型检测体系的建立：

向荧光猝灭的混合体系MUA-AuNCs-Copper ensemble中加入不同浓度的青霉胺溶液，利用荧光分光光度计记录荧光强度的变化，当青霉胺与铜离子的浓度达到10:1时，荧光强度达到最高，通过浓度滴定曲线，建立荧光强度变化与青霉胺浓度的线性响应关系，从而得到定量检测青霉胺的方法。利用湖水、自来水做为实际水样，尿液做为实际生物液体，验证该方案在实际样品中检测的有效性。本发明中针对青霉胺的检测限达到0.08M，优于大部分检测青霉胺的方法。

当向金团簇的溶液中加入铜离子，随着铜离子浓度的增加，620nm处的荧光发射强度逐渐降低，猝灭效率可以达到百分之八十以上。当向被铜离子猝灭的金团簇中加入青霉胺，随着青霉胺浓度的增加，620nm处的荧光强度逐渐增强。荧光强度的增量与青霉胺的浓度具有良好的线性响应关系，可用于定量检测实际水样和尿液中的青霉胺浓度。

本发明发红色荧光的金团簇，由11-巯基十一烷酸同时做为还原剂与稳定剂制备，所述金团簇的红色荧光可以被铜离子猝灭，猝灭效率均达百分之八十以上；所述被铜猝灭的金团簇可以用于检测尿液中的青霉胺；青霉胺包括L-青霉胺和D-青霉胺，所述铜离子包括一价铜离子和二价铜离子，硫酸铜，硝酸铜，氯化亚铜等。

本发明中MUA与金的摩尔比从2:1变化至8:1，其中摩尔比为4:1时制备的金团簇的荧光最强。本发明中NaOH的最优浓度为0.05mol/L。当NaOH的浓度低于0.02mol/L时，MUA无法完全溶解，当NaOH浓度逐渐升高，制备的金团簇达到荧光最强的时间越短。结合MUA的溶解性以及制备金团簇荧光强度的优化确定NaOH的使用浓度为0.02-0.1mol/L。

本发明中制备的的金团簇荧光最大发射在620nm，粒径范围在1.5-3.5，平均粒径为2.6nm，量子产率7.28％。该金团簇具有优良的光稳定性以及良好的水溶性，具有广泛的应用前景。

本发明中青霉胺的检测原理基于竞争配位作用，通过文献调研，荧光寿命的监测与分析以及荧光恢复试验表明铜离子与青霉胺有更强的配位能力，破坏了铜离子与金团簇之间的电子转移过程，荧光恢复。本发明中使用的荧光激发波长为310nm，扫描速率为600nm每分钟,激发与发射的狭缝宽度为10和15nm。

本发明首次利用MUA修饰的金团簇，结合铜离子，利用电子转移和竞争配位的原理以及荧光增强的信号输出，构建针对青霉胺的灵敏检测方法。该方法选择性高，对其他氨基酸以及巯基化合物均无响应，良好的抗干扰能力。

本发明针对青霉胺的检测可以在实际样品中进行，包括湖水，自来水，尿液等，均有很好的回收率，水样中回收率在91.3％至103.2％范围内，尿液中回收率在102.22％左右。

本发明中，当样品中有青霉胺时，没有仪器的条件下，仅用便携式的紫外灯观察到样品红色荧光增强即可定性青霉胺的存在。

本发明方法在金团簇的制备上避免了强还原物质的引入，突出了MUA同时作为还原剂与稳定剂的优势，也为金团簇的制备提供了新的思路。而且制备反应条件温和，量子产率高。在青霉胺的检测方面一定程度上可以避免使用大型仪器以及繁琐的样品前处理过程，仅用荧光分光光度计，将青霉胺溶液加入MUA-AuNCs-Copper ensemble的混合体系，就能灵敏定量识别，从样品加入至数据读出仅需1-2分钟；当没有荧光分光光度计时，利用简易的手持紫外灯，通过肉眼观察荧光强度变化，就可以实时定性青霉胺的存在。

附图说明：

图1是MUA修饰的金团簇的形貌与尺寸分布(透射电子显微镜观察)。

图2是铜离子对金团簇荧光猝灭的光谱图。

图3是青霉胺加入后荧光光谱的变化图。

图4相对荧光强度与青霉胺浓度之间的线性关系图(即标准曲线)。

具体实施方式：

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1：

1、制备11-巯基十一烷酸修饰的金团簇

在制备之前将所有玻璃器皿与磁力搅拌子在王水中浸泡30分钟，并用超纯水多次冲洗备用。首先将0.0545g 11-巯基十一烷酸加入有15ml超纯水的圆底烧瓶中，然后加入1mol/L的氢氧化钠0.75ml，超声条件下使其完全溶解，然后搅拌十分钟。随后向烧瓶中加入6.25ml浓度为10mmol/L的氯金酸溶液，在室温下搅拌五个小时，随时观察反应溶液荧光强度的变化。五小时后停止反应，将反应混合液加入1000分子量的透析袋中在超纯水中透析12小时，期间每隔6小时换一次水。将透析完的澄清溶液取出，加入离心管中，在12000rpm的转速下离心5分钟，然后取出上层清液，再离心两次，得到发红色荧光的金团簇备用，金团簇的尺寸和形貌见附图1。

2、铜离子猝灭金团簇的混合体系的制备:

取6μL MUA-AuNCs的母液稀释到装有2ml磷酸盐缓冲溶液的比色皿中(PBS,pH＝7.4)。以310nm作为激发波长得到金团簇的荧光光谱。利用硫酸铜配置铜离子的母液，浓度为0.5mM。向比色皿中加入不同体积的铜离子的母液，使其最终浓度为0-2.4μM。测量随着铜离子浓度增加相应的荧光光谱图(附图2)。当荧光强度猝灭至百分之八十时，停止添加，此时的铜离子浓度做为最优的铜离子浓度。

3、MUA-AuNCs-Copper ensemble的形成及其对青霉胺的荧光增强型检测

在装有2ml磷酸盐缓冲溶液的比色皿中加入6μL MUA-AuNCs和5μL硫酸铜溶液，得到铜离子猝灭金团簇的混合体系。配置青霉胺的母液，浓度为1mM。取2，2,2，3,4,6,10和15μL青霉胺的母液加入比色皿中，使青霉胺的最终浓度分别为1,2,3,4,5.5,7.5,10.5,15.5和23μM.通过浓度滴定曲线，建立荧光强度的变化与青霉胺浓度的线性响应关系及其方程，并计算针对青霉胺的检测限(附图3)。利用湖水、自来水做为实际水样，尿液做为实际生物液体，利用0.22微米的微孔滤膜对实际样品进行过滤，做MUA-AuNCs-Copper ensemble检测探针在实际样品中的标准曲线。将不同浓度(2.0,6.5,11μM)的青霉胺溶解在尿液中，对照标准曲线(附图4)，检测其回收率在102.22至111.24之间，适用于实际尿液样品中青霉胺的检测(见表1)。

表1：尿液中不同浓度青霉胺的回收实验

实施例2：

1、制备11-巯基十一烷酸修饰的金团簇

在制备之前将所有玻璃器皿与磁力搅拌子在王水中浸泡30分钟，并用超纯水多次冲洗备用。首先将0.109g 11-巯基十一烷酸加入有15ml超纯水的圆底烧瓶中，然后加入1mol/L的氢氧化钠0.5ml，超声条件下使其完全溶解，然后搅拌二十分钟。随后向烧瓶中加入6.25ml浓度为10mmol/L的氯金酸溶液，在室温下搅拌12个小时，随时观察反应溶液荧光强度的变化。十二小时后停止反应，将反应混合液加入1000分子量的透析袋中在超纯水中透析12小时，期间每隔4小时换一次水。将透析完的澄清溶液取出，加入离心管中，在10000rpm的转速下离心5分钟，然后取出上层清液，再离心两次，得到发红色荧光的金团簇备用。

2、铜离子猝灭金团簇的混合体系的制备

取20μL MUA-AuNCs的母液稀释到装有2ml HEPES缓冲溶液的比色皿中(HEPES,pH＝7.4)。以340nm作为激发波长得到金团簇的荧光光谱。利用硫酸铜配置铜离子的母液，浓度为2mM。向比色皿中逐滴加入1微升的铜离子的母液，并记录荧光光光谱，使其最终浓度为0-10μM。测量随着铜离子浓度增加相应的荧光光谱图。当荧光强度猝灭至百分之八十时，停止添加，此时的铜离子浓度做为最优的铜离子浓度。

3、MUA-AuNCs-Copper ensemble的形成及其对青霉胺的荧光增强型检测

在装有2ml磷酸盐缓冲溶液的比色皿中加入20μL MUA-AuNCs和10μL浓度为2mM的硫酸铜溶液，得到铜离子猝灭金团簇的混合体系。配置青霉胺的母液，浓度为5mM。取1，1,2，2,2,2,2,4,4μL的青霉胺的母液加入比色皿中，使青霉胺的最终浓度分别为2.5,5,10,15,20,25,30,40和50μM.通过浓度滴定曲线，建立荧光强度的变化与青霉胺浓度的线性响应关系及其方程，并计算针对青霉胺的检测限。利用湖水、自来水做为实际水样，尿液做为实际生物液体，用0.22微米的微孔滤膜对实际样品进行过滤，做MUA-AuNCs-Copper ensemble检测探针在实际样品中的标准曲线。将不同浓度的青霉胺溶解在实际样品中，对照标准曲线，检测其回收率。