本发明属于环境监测及电化学传感器领域，更具体地，涉及一种电化学聚合分子印迹仿生电化学探头、其制备和应用。
背景技术：
四溴双酚a是溴代阻燃剂的一种，广泛用于电子、电器、纺织、建筑材料等产品的阻燃。因其优异的阻燃性能，应用最为广泛，约占整个阻燃剂市场的60％。四溴双酚a与甲状腺素结构相似，能竞争结合甲状腺素转运蛋白；另一方面，四溴双酚a与双酚a结构类似，表现出一定的雌激素干扰效应，因此，它被认为是一种内分泌干扰物。除此之外，相关毒理研究表明，四溴双酚a还具有免疫毒性、神经毒性和发育毒性。《东北大西洋海洋环境保护公约》已将四溴双酚a列入危害物质名录，挪威的pohs指令也规定，四溴双酚a在电子电器等消费品中的含量不得大于0.1％。
到目前为止，所报道的四溴双酚a检测方法主要有色谱、色谱-质谱联用法、酶联免疫法和电化学方法。尽管色谱和色谱-质谱联用法已经比较成熟，但需要复杂的样品前处理，且耗时长、仪器无法实现便携化。
与色谱、色-质联用以及酶联免疫法相比，电化学传感器具有操作简便、分析时间短、分析成本低、易于在线自动化监测等特点，在环境监测中，尤其现场在线监测方面具有突出的优势。基于电化学聚合的分子印迹膜是一种模仿自然界中抗原-抗体特异性结合的仿生膜，该方法制备简单、快速，价格便宜，可以特异性识别模板分子，检测灵敏度高，性能稳定，可重复利用，是一种极具前景的电化学检测方法。
目前，关于四溴双酚a的电化学测定有少量报道，但一般是基于材料修饰电极检测，而基于电化学聚合分子印迹膜检测的则一般采用间接检测，无法方便的应用于实际环境的在线检测。因此，开展基于分子印迹膜直接检测四溴双酚a的方法和新技术研究具有重要的理论研究价值，而且对保护生态环境和保障人体健康也具有重要的意义。
技术实现要素：
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种检测四溴双酚a的电化学聚合分子印迹仿生电化学探头及其制备方法和应用，其充分结合分子印迹膜直接检测四溴双酚a的特点和需求，针对性对电化学聚合分子印迹仿生电化学探头进行重新设计，并对制备过程以及具体应用时的关键条件和工艺参数进行选择和优化，相应获得了一种能够高灵敏度、高准确度、抗干扰能力强的快速、直接检测四溴双酚a的电化学探头及其制备方法，由此解决现有技术采用间接检测四溴双酚a无法方便应用于实际环境的在线检测的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种电化学聚合分子印迹仿生电化学探头，包括玻碳电极和位于该玻碳电极表面的电化学聚合分子印迹膜，所述电化学聚合分子印迹膜包括电化学聚合功能单体形成的聚合物和洗脱掉模板分子四溴双酚a后形成的空穴。
优选地，所述位于该玻碳电极表面的电化学聚合分子印迹膜通过如下方法获得：将功能单体和模板分子四溴双酚a通过循环伏安法在所述玻碳电极的裸露面电化学聚合形成嵌有四溴双酚a的膜，然后洗脱掉四溴双酚a，得到所述电化学聚合分子印迹膜。
优选地，所述功能单体为多巴胺。
优选地，所述玻碳电极包括玻碳电极头、电极外套和铜棒状导线；所述玻碳电极头密闭封装在所述电极外套里面，位于圆柱体状电极外套正中心，所述玻碳电极头表面一端与所述电极外套一端处在同一平面，另一端与所述铜棒状导线相连，铜棒状导线延伸至所述电极外套外端。
按照本发明的另一个方面，提供了一种电化学聚合分子印迹仿生电化学探头的制备方法，包括如下步骤：
(1)将玻碳电极置于含有多巴胺、模板分子四溴双酚a和ph为6.0～8.0的缓冲溶液的混合溶液中，通过循环伏安法制备出嵌有四溴双酚a模板分子的电化学聚合膜；其中所述多巴胺和模板分子四溴双酚a的浓度比为5:1～20:1；
(2)采用洗脱液在搅拌条件下洗脱所述模板分子四溴双酚a0.5～2小时；
(3)利用恒电位氧化除去残留的四溴双酚a。
优选地，所述功能单体和模板分子四溴双酚a的浓度比为10:1。
优选地，所述模板分子四溴双酚a的浓度为0.25～1.0毫摩尔每升。
优选地，所述模板分子四溴双酚a的浓度为0.5毫摩尔每升。
优选地，步骤(1)所述循环伏安法的扫描电位范围-0.5～0.5v，扫速为25～110毫伏每秒，扫描圈数为5～13圈。
优选地，当模板分子四溴双酚a浓度为0.5毫摩尔每升时，扫速为75毫伏每秒，扫描圈数为10圈。
优选地，步骤(2)所述洗脱液为甲醇和乙酸的混合溶液。
优选地，所述甲醇和乙酸的体积比为1:1～4:1。
进一步优选地，所述甲醇和乙酸的体积比为4:1。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的电化学聚合分子印迹仿生电化学探头的应用，用于四溴双酚a的直接检测。
优选地，用于四溴双酚a的直接检测时，不需要利用探针间接检测，直接在待测液和ph为4.6～8.0的磷酸缓冲溶液的混合溶液中富集1～5分钟之后通过差分脉冲伏安法检测。
优选地，待测液ph为6.0，富集时间为3分钟。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)高灵敏度
通过循环伏安法在玻碳电极头上电化学聚合分子印迹仿生电化学探头与膜的厚度，致密程度有关；通过聚合及检测条件的优化，可以得到高灵敏度的分子印迹膜。检出限为0.27nm。
(2)分析速度快
液相色谱方法检测一个样品需要半个小时左右，本传感器可对样品直接检测，整个样品分析时间约为3min，满足现场快速监测要求。
(3)准确度高
将传感器用于电子垃圾提取液的测定，测定结果与高效液相色谱法测定结果非常吻合(相对误差低于5％)。
(4)实用性强
传感器检测时可以直接检测，不需要铁氰化钾等做为探针，更适用于实际样品的检测。此外，因为分子印迹的稳定性很好，可以洗脱后重复利用。因此作为在线监测的实用前景性良好，实用性强。
(5)抗干扰能力强
一般酚类污染物会在测定四溴双酚a时对结果产生干扰。而本传感器利用分子印迹膜对模板分子的特异性识别，在加入高浓度苯酚、对氯苯酚、双酚a时对结果影响很小。
因此，相对于传统的色谱-质谱法和间接检测方法，本方法研制的检测四溴双酚a的电化学聚合分子印迹仿生电化学探头表现出了高灵敏度、快速、环境友好、操作简单、准确度高、实用性强、抗干扰能力强的优点。
附图说明
图1是本发明提供的电化学聚合分子印迹仿生电化学探头的结构示意图和实物图；
图2是裸的玻碳电极(a)的表面扫描电镜图；
图3是电化学聚合上分子印迹膜之后电极(b)的表面扫描电镜图；
图4是电化学聚合的tbbpa模板浓度(a)对40钠摩尔每升四溴双酚a氧化信号的影响；
图5是电化学聚合的扫描圈数(b)对40钠摩尔每升四溴双酚a氧化信号的影响；
图6是电化学聚合的扫描速度(c)对40钠摩尔每升四溴双酚a氧化信号的影响；
图7是检测的ph(a)对40钠摩尔每升四溴双酚a氧化信号的影响；
图8是检测的富集时间(b)对40钠摩尔每升四溴双酚a氧化信号的影响；
图9是用差分脉冲伏安法检测四溴双酚a(tbbpa)和加入高浓度苯酚(phenol)、对氯苯酚(chlorophenol)、双酚a(bpa)之后的响应信号比较图。
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：
1-玻碳电极头；2-电化学聚合分子印迹膜；3-电极外套；4-铜棒状导线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
如图1所示，本发明提供的一种电化学聚合分子印迹仿生电化学探头，包括玻碳电极和位于该玻碳电极表面的电化学聚合分子印迹膜。玻碳电极包括玻碳电极头、电极外套和铜棒状导线；玻碳电极头密闭封装在电极外套里面，位于圆柱体状电极外套正中心，玻碳电极头表面一端与电极外套一端处在同一平面，另一端与铜棒状导线相连，电极外套一般由聚四氟乙烯、聚三氟氯乙烯或聚醚醚酮制作而成，本发明使用的外套材料为聚四氟乙烯；铜棒状导线延伸至电极外套外端，导线直径根据需要设置，一般为1毫米左右。该玻碳电极可以市购得到。玻碳电极头一般为圆柱体状，直径在1～6毫米(mm)不等，长度1～5毫米。本发明使用的玻碳电极头直径为3毫米，长度为4毫米。电化学聚合分子印迹膜为由电化学聚合功能单体聚合物和洗脱掉模板分子四溴双酚a后的空穴组成。该电化学聚合分子印迹膜通过如下方法获得：将功能单体和模板分子四溴双酚a通过循环伏安法在所述玻碳电极的裸露面电化学聚合形成嵌有四溴双酚a的膜，然后洗脱掉四溴双酚a得到所述电化学聚合分子印迹膜，功能单体为多巴胺。
本发明提供的一种电化学聚合分子印迹仿生电化学探头的制备方法，包括如下步骤：
(1)将玻碳电极置于含有功能单体多巴胺、模板分子四溴双酚a和ph为6.0～8.0的0.01摩尔每升磷酸缓冲溶液的混合溶液中，通过循环伏安法制备出嵌有四溴双酚a模板分子的聚多巴胺膜；其中所述多巴胺和模板分子四溴双酚a的浓度比为5:1～20:1；模板分子四溴双酚a的浓度为0.25～1.0毫摩尔每升；所述缓冲溶液优选为ph为7.5的0.01摩尔每升磷酸缓冲液。
(2)采用洗脱液在搅拌条件下洗脱所述四溴双酚a模板分子0.5～2小时；循环伏安法的扫描电位范围-0.5～0.5v，扫速为25～110毫伏每秒，扫描圈数为5～13圈；优选地，当模板分子四溴双酚a浓度为0.5毫摩尔每升时，扫速为75毫伏每秒，扫描圈数为10圈。洗脱液为甲醇和乙酸的混合溶液，优选地，所述甲醇和乙酸的体积比为1:1～4:1，进一步优选为4:1。
(3)利用恒电位氧化除去少量残留的四溴双酚a。
通过上述方法得到能特异性识别四溴双酚a的电化学聚合分子印迹膜，其扫描电镜如图3所示。通过对四溴双酚a溶液的响应信号，优化制备的扫速、圈数和模板分子的含量，筛选出灵敏度最好的电化学聚合分子印迹膜。该电化学聚合分子印迹仿生电化学探头可用于四溴双酚a的直接检测，具体检测方法如下：不需要铁氰化钾等作为探针，而是直接在待测液和ph为4.6～8.0的0.01摩尔每升磷酸缓冲溶液的混合溶液中富集1～5分钟之后通过差分脉冲伏安法直接快速检测，优选地，待测液ph为6.0，富集时间为3分钟。
本发明的电化学探头由玻碳电极和位于该电极玻碳表面的电化学聚合分子印迹膜构成，电化学聚合分子印迹膜为首先由功能单体比如多巴胺和模板分子四溴双酚a通过循环伏安法在玻碳裸露面电化学聚合形成嵌有四溴双酚a的膜，然后洗脱掉四溴双酚a所得的聚合分子印迹膜。采用多巴胺作为功能单体，因为其分子结构具有苯环和氨基、羟基，可以和四溴双酚a分子的苯环和羟基通过苯环之间π-π相互作用，与氨基、羟基的氢键作用识别，为分子印迹膜空穴提供足够的识别位点。其他现有技术常用的功能单体比如吡咯、邻苯二胺或半胱氨酸，笔者经实验证实用于直接检测效果较差。
相对于传统的色谱-质谱法和间接检测方法，本发明研制的检测四溴双酚a的电化学聚合分子印迹仿生电化学探头表现出了高灵敏度、快速、环境友好、操作简单、准确度高、实用性强、抗干扰能力强的优点。
以下为实施例：
实施例1
电化学聚合分子印迹膜仿生(分子印迹是模拟自然界中抗原-抗体结合的一种化学方法，所以说是仿生)电化学传感器的制备：
将打磨至镜面的玻碳电极置于含有0.5毫摩尔多巴胺和0.5毫摩尔每升的模板分子四溴双酚a的0.01摩尔每升磷酸缓冲液中，通过循环伏安法扫描电位范围：-0.5～0.5伏，扫速为75毫伏每秒，扫描圈数为10圈制备出嵌四溴双酚a模板分子的聚多巴胺膜。接着以甲醇：乙酸(4：1)溶液作为洗脱液，搅拌下洗脱四溴双酚a模板分子1小时，自然晾干。然后利用1伏的恒电位氧化除去少量残留的四溴双酚a即得到能特异性识别四溴双酚a的分子印迹膜。玻碳电极购自武汉高仕睿联科技有限公司。玻碳电极头直径为3毫米，长度为4毫米。外套材料为聚四氟乙烯。铜棒状导线，直径为1毫米，一段与玻碳相连，另一端由电极外套底部伸出。
制备前后裸的玻碳电极的表面扫描电镜图和得到的电化学聚合分子印迹膜的扫描电镜分别如图2和图3所示，可以看出该印迹膜为一层致密的平滑的聚合物膜。
采用常用的三电极体系，以电化学聚合分子印迹仿生电化学传感器探头作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂柱电极作为对电极，连接电化学工作站和计算机对实验数据进行采集和记录。在充分搅拌的情况下，用差分脉冲伏安法检测四溴双酚a的响应信号。检测电位范围为0.3～1.0伏，介质为5.00毫升，0.01摩尔每升的ph6.0的磷酸盐缓冲溶液。搅拌下富集3分钟，测定差分脉冲伏安法的的峰强度作为四溴双酚a的电流响应信号。通过不同条件制备的电化学传感器探头对四溴双酚a的电流响应信号强度的差别来筛选最佳条件，如图4、图5和如6所示，实验结果表明，在制备分子印迹膜时，电聚合最优条件为：模板分子四溴双酚a浓度为0.5毫摩尔每升，扫速为75毫伏每秒，扫描圈数为10圈，这时对四溴双酚a的电化学响应信号最强。
实际应用：在充分搅拌的情况下，用差分脉冲伏安法检测四溴双酚a的响应信号。检测电位范围为0.3～1.0伏，介质为5.00毫升,0.01摩尔每升的ph6的磷酸盐缓冲溶液。搅拌下富集3分钟，测定差分脉冲伏安法的峰强度作为四溴双酚a的电流响应信号。图7是检测的ph(a)对40钠摩尔每升四溴双酚a氧化信号的影响；图8是检测的富集时间(b)对40钠摩尔每升四溴双酚a氧化信号的影响；从图中可以看出，在ph为6.0，富集了3分钟之后时，电流响应信号最大。
将研发的电化学探头用于3份不同来源电子垃圾样品乙醇萃取液检测，样品序号分别记作1、2、3，实际样品四溴双酚a含量通过差分脉冲伏安法实验测定并结合线性回归方程计算得到。每个样品平行测定三次，相对标准偏差(rsd)低于4％，说明该传感器的重现性好。为了验证此方法的准确性，用比较成熟的高效液相色谱测定进行对照，结果见表1。高效液相色谱测定结果与传感器测定结果非常吻合(相对误差低于5％，此偏差一般在可接受范围内)，说明该传感器准确度高。
表1实际样品的四溴双酚a含量测定
实施例2
采用常用的三电极体系，以电化学聚合分子印迹仿生电化学传感器探头作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂柱电极作为对电极，连接电化学工作站和计算机对实验数据进行采集和记录。在充分搅拌的情况下，用差分脉冲伏安法检测四溴双酚a(tbbpa)和加入高浓度苯酚(phenol)、对氯苯酚(chlorophenol)、双酚a(bpa)之后的响应信号。检测电位范围为0.3～1.0伏，介质为5.00毫升,0.01摩尔每升的ph6.0的磷酸盐缓冲溶液。搅拌下富集3分钟，测定差分脉冲伏安法的的峰强度作为40钠摩尔四溴双酚a和加入高浓度的400钠摩尔苯酚、200钠摩尔对氯苯酚、200钠摩尔双酚a之后的电流响应信号。如图9所示，电化学检测信号改变在10％以内，证明分子印迹膜抗干扰性良好。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。