本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种cd151蛋白表达量的免疫组化检测方法及试剂盒。
背景技术：
恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的主要疾病。我国肿瘤发生人数不断升高，死亡率从70年代的83.65/10万上升到90年代的108.26/10万，上升了29.42％。广西的恶性肿瘤死亡率也呈上升趋势，仅1996年(34700人死亡)就比1991年增加12700人，增长近57.73％；广西的恶性肿瘤死亡标化减寿率为9.88‰；广西居民一生(按出生至74岁计算)死于恶性肿瘤的风险约为1/10左右(累积危险度10.66％)；恶性肿瘤使广西人口平均期望寿命减少2.13岁。恶性肿瘤引发了沉重的社会经济负担，据估算每年用于癌症病人的医疗费用约800亿元，约占卫生总费用的20％。全国因癌症损失的失能调整生命年为185.1万人年，以此估算的经济损失高达1432.3亿元。肿瘤的早诊早治是目前预防治疗肿瘤的有效手段。
cd151是四跨膜蛋白超家族(transmembrane4superfamily，tm4sf)中的一个成员，它能将整合素接收到的生物信号转导到细胞内的其他关键蛋白质(如激酶)，参与细胞的黏附、迁移、形成半桥粒结构等多种病理生理过程，在肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移中起重要作用，其过表达与多种癌症的预后不良有关。研究发现，cd151是癌蛋白，在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、胆囊癌等肿瘤中高表达。动物实验发现小鼠模型中敲除cd151后肿瘤发生延迟，原发性肿瘤减少。因此，cd151是肿瘤诊断和预后判断的一个标志，也是靶向治疗的一个潜在重要靶点。开展cd151蛋白的表达水平检测，有利于开展临床快速诊断、治疗效果判断和预后判断的研究和应用。
目前，国内外报道的cd151检测方法都不很成熟，而且仅用于科研实验，尚未开发
成适用于临床检测的试剂盒，不利于临床常规使用。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术中的上述缺陷，提供一种cd151蛋白表达量的免疫组化检测方法及试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种cd151蛋白表达量的免疫组化试剂盒，包括cd151抗体；5％bsa封闭液20ml；dako即用型hrp标记二抗10ml；3％h2o220ml；dab；苏木精。
此外，本发明还提供如下附属技术方案：
优选地，上述cd151蛋白表达量的免疫组化检测方法，包括如下步骤：
(1)制备免疫组化反应试剂和优化反应条件：cd151重组蛋白的制备与鉴定、制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型、单抗杂交瘤-小鼠腹水cd151抗体的纯化；
(2)采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片蛋白进行染色，检测染色浓度和染色范围；
(3)根据染色信号进行半定量评估，获得组织中cd151蛋白表达量。
优选地，上述步骤(2)中所述采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片进行检测，具体方法为：
a、取癌旁组织和肿瘤组织进行石蜡包埋制备病理切片；
b、cd151抗体进行第一孵育；
c、用型hrp标记二抗进行第二孵育；
d、以dab为显色剂显色，后再用苏木精复染；
e、使用封片剂封片。
优选地，上述步骤e所述封皮剂为中性树胶或水溶性封片剂。
优选地，上述步骤b所述第一孵育的温度为37℃，孵育的时间为1-2h。
优选地，上述步骤c所述第二孵育的温度为37℃，孵育的时间为20—40h。
本发明的优点和积极效果：
本发明提供cd151蛋白表达量的检测方法及试剂盒，采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片进行染色，检测染色浓度和染色范围；根据染色信号进行半定量评估，获得组织中cd151蛋白量表达，独立开发成高敏感性试剂盒。通过用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物。这种聚合物拥有强大的信号放大能力，特别适合免疫组化的应用。研制试剂盒具有稳定性好，检测灵敏度高，背景低的特点。
本发明检测方法能够快速检测血清中cd151蛋白表达量，研究显示cd151蛋白在各种肿
瘤组织中高表达。提示cd151蛋白作为一种潜在的肿瘤相关标志物，可为临床快速诊断、治疗效果判断和预后判断提供参考。
附图说明
图1a乳腺癌正常癌旁组织cd151表达；
图1b乳腺癌中cd151表达；
图2cd151免疫组化模式图；
图3人cd151免疫组化阳性结果图。
具体实施方式
以下结合较佳实施例及其附图对本发明技术方案作进一步非限制性的详细说明。
实施例1
cd151蛋白表达量的免疫组化试剂盒，包括cd151抗体；5％bsa封闭液20ml；dako即用型hrp标记二抗10ml；3％h2o220ml；dab；苏木精。
上述cd151蛋白表达量的免疫组化检测方法，包括如下步骤：
(1)制备免疫组化反应试剂和优化反应条件：cd151重组蛋白的制备与鉴定、制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型、单抗杂交瘤-小鼠腹水cd151抗体的纯化；
(2)采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片蛋白进行染色，检测染色浓度和染色范围；
(3)根据染色信号进行半定量评估，获得组织中cd151蛋白表达量。
上述步骤(2)中所述采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片进行检测，具体方法为：
a、取癌旁组织和肿瘤组织进行石蜡包埋制备病理切片；
b、cd151抗体进行第一孵育；
c、用型hrp标记二抗进行第二孵育；
d、以dab为显色剂显色，后再用苏木精复染；
e、使用封片剂封片。
上述步骤e所述封皮剂为水溶性封片剂。
上述步骤b所述第一孵育的温度为37℃，孵育的时间为1h。
上述步骤c所述第二孵育的温度为37℃，孵育的时间为40min。
实施例2
cd151蛋白表达量的免疫组化试剂盒，包括cd151抗体；5％bsa封闭液20ml；dako即用型hrp标记二抗10ml；3％h2o220ml；dab；苏木精。
上述cd151蛋白表达量的免疫组化检测方法，包括如下步骤：
(1)制备免疫组化反应试剂和优化反应条件：cd151重组蛋白的制备与鉴定、制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型、单抗杂交瘤-小鼠腹水cd151抗体的纯化；
(2)采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片蛋白进行染色，检测染色浓度和染色范围；
(3)根据染色信号进行半定量评估，获得组织中cd151蛋白表达量。
上述步骤(2)中所述采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片进行检测，具体方法为：
a、取癌旁组织和肿瘤组织进行石蜡包埋制备病理切片；
b、cd151抗体进行第一孵育；
c、用型hrp标记二抗进行第二孵育；
d、以dab为显色剂显色，后再用苏木精复染；
e、使用封片剂封片。
上述步骤e所述封皮剂为中性树胶封片剂。
上述步骤b所述第一孵育的温度为37℃，孵育的时间为2h。
上述步骤c所述第二孵育的温度为37℃，孵育的时间为20min。
实施例3
cd151蛋白表达量的免疫组化试剂盒，包括cd151抗体；5％bsa封闭液20ml；dako即用型hrp标记二抗10ml；3％h2o220ml；dab；苏木精。
上述cd151蛋白表达量的免疫组化检测方法，包括如下步骤：
(1)制备免疫组化反应试剂和优化反应条件：cd151重组蛋白的制备与鉴定、制备单抗杂交瘤细胞-小鼠腹水模型、单抗杂交瘤-小鼠腹水cd151抗体的纯化；
(2)采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片蛋白进行染色，检测染色浓度和染色范围；
(3)根据染色信号进行半定量评估，获得组织中cd151蛋白表达量。
上述步骤(2)中所述采用免疫组化技术对癌旁组织和肿瘤组织病理切片进行检测，具体方法为：
a、取癌旁组织和肿瘤组织进行石蜡包埋制备病理切片；
b、cd151抗体进行第一孵育；
c、用型hrp标记二抗进行第二孵育；
d、以dab为显色剂显色，后再用苏木精复染；
e、使用封片剂封片。
上述步骤e所述封皮剂为中性树胶或水溶性封片剂。
上述步骤b所述第一孵育的温度为37℃，孵育的时间为2h。
上述步骤c所述第二孵育的温度为37℃，孵育的时间为30min。
病例实施例1
在本实施中所述的阴性是指，所述癌旁组织为病理确证的正常对照组织。
在本实施中所述的阳性是指，所述待测肿瘤组织为病理确证的各种肿瘤组织。
在本实施例中所述的表达量高是指，所述待检血清呈色反应高于空白对照和阴性对照，且其呈色反应越深，cd151蛋白表达量越高。
在本实施例中提供的cd151蛋白表达量的免疫组化试剂盒中所用生物材料、试剂或仪器均可由市场购得。
一、材料和方法
1、病人和组织样本
为了做免疫组化检测，共收集广西壮族自治区人民医院2014年1月至-2016年12月份50例石蜡包埋的乳腺癌和50例乳腺癌旁正常组织标本。收集标准为乳腺癌的病理学诊断，初诊和未经治疗的，没有其他肿瘤的病史。原位癌排除在研究之外。临床样本仅用于研究，经过广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准。
临床样本包括50例女性乳腺癌患者，年龄在35-55岁之间，平均年龄42.6岁。所有病人接受乳腺癌切除术。本研究的组织病理学分级和临床分期依据世界卫生组织(who)和第六版ptmn国际抗癌联盟(uicc,2002)的标准定义。由广西壮族自治区人民医院的两位病理医师对所有肿瘤的组织学类型和分级进行评估。
2、免疫组化
福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片(5μm),常规脱蜡至水。3％h2o2去离子水室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。pbs冲洗每次5分钟，重复3次。封闭。滴加5％bsa封闭液，37℃孵育30分钟，甩干。滴加一抗cd151(稀释100-200倍)，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。pbs冲洗，5分钟×3次。滴加dako即用型hrp标记二抗，37℃孵育30分钟，pbs冲洗，5分钟×3次。显色液dab显色，镜下控制反应时间。自来水充分冲洗。根据需要进行苏木素复染，染色时间为0.5-2分钟。用正常孵育的样本作为阴性对照。
3、免疫染色评估
由两位病理医师对临床样本的每张切片的5个区域进行独立的评估和确认。如果两人意见不一致，他们将对标本进行重新评估。染色结果采用综合判定：采用阳性强度积分与阳性数量积分相加。(1)定量/半定量分析：按染色阳性细胞数占比例(y)分四级。阴性为0分，阴性；0％＜y≤25％为1分，少数细胞阳性；25％＜y≤50％为2分，中等量细胞阳性；50％＜y为3分；多数细胞阳性。(2)按染色强度分(四级)：无色记为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。(3)综合判定总分：采用阳性强度积分与定量/半定量积分相加：0分为(-)阴性；2分为(+)弱阳性；3-4为(++)中度阳性；5-6分(+++)高度阳性。
4、统计学分析
用卡方检验评估cd151蛋白的表达和临床病理参数之间的关系的显著性。用spss22.0软件进行统计学分析。p＜0.05，认为差异有显著性。
二、结果
1、乳腺癌病人cd151高表达
为分析cd151在乳腺癌和正常癌旁组织间的表达差异，本研究用免疫组化方法检测50例乳腺癌患者的石蜡切片和50例正常癌旁组织的石蜡切片。正常乳腺细胞无染色或弱染色(图1a)。而30例(60％)乳腺癌组织中cd151高表达(p＜0.05)。染色分布于乳腺癌细胞的胞浆内(图1b)。
2、cd151蛋白表达和临床病例特征的相关性
cd151蛋白高表达与肿瘤分级、tmn分期的相关性有统计学意义(p＜0.05)，特征的相关性见表1所示。
表1：乳腺癌病人cd151蛋白表达和临床病例特征的相关性
如表1所示，cd151蛋白高表达与肿瘤分级、tmn分期的相关性有统计学意义(p＜0.05)。
3、乳腺癌临床样本cd151蛋白表达的验证分析
在病理学诊断的乳腺癌临床样本中，cd151蛋白表达验证效果良好，验证分析见表2所示。
表2：乳腺癌临床样本cd151蛋白表达的验证分析
如表2所示，在病理学诊断的乳腺癌临床样本中，cd151蛋白表达验证效果良好。
需要指出的是，上述较佳实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。