一种简单快速评估分子克隆体系效率的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种简单快速评估分子克隆体系效率的方法。

背景技术：

酶切连接是目前分子生物学领域分子克隆、载体构建的最基础的技术方案。体系中用到的酶为限制性内切酶，经酶切dna片段产生互补的粘末端，经过粘性末端配对，然后用t4连接酶进行连接，将两个dna分子连接成一个完整的分子。酶切-连接体系的效率直接影响到分子克隆的成功率，但是实验室环境下总是偶尔阶段性的出现载体构建效率低下的问题，每当这类问题出现时总要各种寻找原因。内切酶或/和连接酶活性不足是出现这类问题的原因之一，但是分子实验是一种肉眼不可见的实验过程，只能通过各种测试去排查问题发生的根源。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种简单快速评估分子克隆体系效率的方法，设计了一种标准的dna体系，用来快速测试酶切连接体系中主要成分的活性，此体系也可以用来评价生产或购买的内切酶或者连接酶的活性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种简单快速评估分子克隆体系效率的方法，设计一dna片段，其上设置至少2个多克隆位点，所述多克隆位点内有待测限制性内切酶的酶切位点，且所述酶切位点只存在于所述多克隆位点上；同一内切酶在不同的所述多克隆位点内产生的粘性末端能够互补连接；

对所述dna片段酶切，将上述酶切产物经过连接酶连接后进行电泳，对形成的电泳条带进行分析：

当电泳条带以较大片段或单一的完整载体片段存在，说明内切酶活性比较低或者没有活性；当电泳条带以较小片段存在，说明连接酶活性较低或者没有活性。

优选地，所述dna片段为环状或线性。更优选地，所述dna片段为环状。

优选地，所述dna片段为pbrtestdna载体。

多个所述多克隆位点之间间距(k)可以相等也可不等，优选地，多个所述多克隆位点之间间隔的距离相等。

优选地，将所述多克隆位点的个数记为m，将所述多克隆位点之间的间距记为k，所述较大片段或单一的完整片段指长度为m*k的片段，所述较小片段指长度为k的片段。

优选地，当电泳条带不是清晰的dnaladder，呈现弥散的条带，说明体系内有其他dna酶污染。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种评估分子克隆体系效率的方法，成本低，可以简单快速的测试酶切连接体系中的主要成分(内切酶或者连接酶)的活性。

附图说明

图1为实施例中构建的pbrtestdna载体示意图。

图2为实施例中凝胶电泳结果。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例设计一环状dna片段，其上设置有6个多克隆位点mcs，一种mcs的序列如序列表中seqidno.1所示；多个所述多克隆位点mcs之间间隔的距离相等，记为k，具体为如图1所示的pbrtestdna载体，该载体通过委托基因合成公司用全基因合成的方式得到，如序列表中seqidno.2所示。

其中，每个多克隆位点mcs内有待测限制性内切酶的酶切位点，且所述酶切位点只存在于所述多克隆位点mcs上；同一个酶在不同的所述多克隆位点mcs内产生的粘性末端能够互补连接，这样任何两个粘性末端之间可以相互连接。mcs内对应酶切位点有ecori-saci-kpni-smai-bamhi-xbai-sali-psti-sphi-hindiii，此载体用以上的任一一种酶切位点单酶切后产生单一的1000bpdna条带，用连接酶连接后，产生间隔1000bp的dnaladder条带。

评估方法：酶切将pbrtestdna载体片段化，65℃使内切酶失活，添加连接酶将片段连接组装，具体步骤如下：

1，酶切体系：

h2o:13ul

buffer:2ul

待测内切酶:1ul

pbrtest:4ul或者200ng；

37℃for大于5分钟。

2，内切酶失活：

65℃大于5min使内切酶失活

3，片段连接：

向65℃处理后的酶切体系中添加1ul连接酶和适量的atp。

37℃温度下连接反应大于10分钟。

4，电泳：酶切连接后的体系全部点样电泳。

电泳结果如图2所示，由图可知，a泳道为完整质粒大小，如果电泳结果类似于a泳道(长度为m*k的片段)，表明酶切连接体系中至少内切酶没有活性或者活性较低；b泳道为pbrtestdna完全酶切后的电泳结果，整个3000bp的片段被均匀的酶切成250bp的片段，如果电泳结果类似于b泳道(长度为k的片段)，说明连接酶没有活性或活性较低，没有能够将酶切后的片段进行连接组装。c泳道为连接酶将250pb片段组装后的结果得到250,500,750,100,1500,1750,2000bp的片段，更长的连接时间甚至可以看到更大的ladder条带，出现类似c泳道的ladder条带表明酶切-连接体系中，内切酶和连接酶功能正常。

电泳条带为清晰的dnaladder，无弥散的条带，说明体系内无其他dna酶污染。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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<110>武汉艾德士生物科技有限公司

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