一种评价血液及其代用品总携氧量及氧饱和度的测量方法及测量装置与流程

本发明涉及一种评价血液及其代用品总携氧量及氧饱和度的测量方法及测量装置。

背景技术：

目前，血氧饱和度的在线分析方装置，如临床使用的血氧分析仪和临床监护仪，运用的技术是基于人血红蛋白光谱信息的反射光谱分析方法。

血氧分析仪和临床监护仪中血氧饱和度的测定方法是利用氧合血红蛋白与还原血红蛋白对红光以及红外光的吸收光谱不同，测量两种蛋白质的特征波长反射强度的波动信号和非波动信号，两者相除再计算比值。该方法采用发射并接收反射光的光电转换器作为传感器，发出氧合血红蛋白和还原血红蛋白特定波长的两种光，同时要求样品在血管中流动才可测量。但是对其他动物的血红蛋白，需要预先对测量测量样本进行预实验以获取氧合血红蛋白和还原血红蛋白的光谱特征信息。对于多种血红蛋白复合的血液代用品、经过分子修饰和处理过的血红蛋白制成的血液代用品以及非血红蛋白携氧原理的样品无法直接测量，不仅要重新采集样品光谱特征，而且可能遇到特征波长超出常用光谱分析法范围，甚至特征波长不明显无法使用光谱法分析的情况。

在血液代用品研究领域，测量血氧饱和度并绘制氧解离曲线是对血液代用品评价的重要手段之一。氧解离曲线是血液及血液替代品相互比较和临床应用的重要指标，能反映出血液替代品的携氧性能，还可以计算出血液替代品的p50数值，此数值是血氧饱和度为50%时氧分压大小，此数据反映出氧释放功能和血红蛋白与氧气亲和力的常用指标，具有十分重要的研究意义和临床意义。因此，实现对各种血液替代品测量血液替代品的氧饱和动力学分析研究有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种不依赖样品光谱信息的电化学方法进行携氧量的测定方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种评价血液或其代用品总携氧量的方法，该方法通过原电池原理消耗血液或其代用品中所包含的氧气，通过对消耗氧气过程中电流随时间变化的记录，计算出反应中还原氧气过程产生的总电荷量，利用总电荷量与氧气物质的量之间的比例推算血液或其代用品总携氧量。

其中，血液或其代用品中所包含的氧气通过采用原电池原理的空气-金属电池进行消耗；该空气-金属电池的正极采用铂黑电极，负极采用铁片电极，血液或其代用品加入正极反应池中进行氧化还原反应。

进一步的，空气-金属电池的正极反应池内的正极溶液采用pH缓冲溶液，负极反应池内的负极溶液采用加入饱和氯化钾配置的柠檬酸溶液，连通正极和负极的盐桥中填充有饱和的氯化钾溶液；血液或其代用品的加入时间为：空气-金属电池的回路接通后，通过的电流逐渐减小并稳定超过300s后加入；血液或其代用品的加入流速为4ml/min。

进一步的，血液或其代用品先采用正极溶液稀释后再加入，加入量为1mL。

本发明还提供了采用上述方法进行血液或其代用品氧饱和度的测量方法，具体步骤为：先在某一氧分压下待测定的血液或其代用品总携氧量的测定，再将待测定的血液或其代用品置于氧饱和环境内，测定其最大总携氧量，从而计算待测定的血液或其代用品在该氧分压下氧饱和度。

本发明还提供了一种评价血液或其代用品总携氧量及其氧饱和度的测量装置，包括电化学工作站、空气-金属电池、磁力搅拌器、密封电极架、加样毛细管；空气-金属电池的正极采用铂黑电极，负极采用铁片电极，正极反应池内的正极溶液采用pH缓冲溶液，负极反应池内的负极溶液采用加入饱和氯化钾配置的柠檬酸溶液，正极反应池和负极反应池上端通过密封电极架密封连接，连接正极溶液和负极溶液之间的盐桥内填充有饱和氯化钾溶液；正极反应池内设有磁力转子，外部下方设有磁力搅拌器；加样毛细管一端通过正极溶液内，一端伸出密封电极架；电化学工作站的工作电极线连接正极，对电极线和参比电极线连接负极。

其中，铂黑电极通过以下方法制备：配制含有2 mmol/L K2PtCl6的0.5 mol/L H2SO4溶液8ml加入电解池，以1cm*1cm*0.1cm的铂片电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，将溶液通高纯氮气除氧30min后，使用循环伏安法在-0.2~1V的电位范围内以50mV/s的速度扫描600圈，完成后取出铂片电极，用双蒸水冲洗后放入双蒸水中备用。

负极电极通过以下方法制备：将0.5mm厚的DT4E铁片切割成20mm*35mm大小，用金相砂纸将其表面打磨光亮，取出铁锈等痕迹后固定在不锈钢电极夹上制成负极电极。

正极溶液在使用前先进行除氧处理。

正极溶液采用磷酸缓冲溶液、PBS缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、Tris缓冲溶液或者生理盐水，优选0.1mol/L pH=7的磷酸缓冲溶液。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明采用原电池原理进行携氧量和氧饱和度的测定，不依赖样品光谱信息，不受样品种类和携氧机制的限制，可对各种血液及其代用品的氧饱和度和携氧量进行测量，将其与氧分压测量设备组合后，可绘制出氧解离曲线，为客观地测定评价血液及其代用品的携氧功能提供了可能，可以有效地评价出各种血液代用品的动力学特征。

附图说明

图1为本发明测量装置的结构示意图；

图2为实施例1中采用本发明装置测得的样品氧气还原时间-电流曲线；

图3为实施2中采用本发明装置对过氧化氢标准品的检测结果。

图中，1-磁力搅拌器，2-玻璃平台，3-磁力转子，4-铂黑电极，5-正极反应池，6-密封电极架，7-工作电极线，8-加样毛细管，9-盐桥，10-对电极线，11-参比电极线，12-负极反应池，13-铁片电极。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明。

实施例1

如图1所示，本发明血液及其代用品总携氧量及氧饱和度的测量装置包括：

1）正极部分包括正极反应池5及通入其中的正极溶液、磁力搅拌器1、磁力转子3、加样毛细管8、盐桥9的正极部分和铂黑电极4；

2）负极部分包括负极反应池12及通入其中的负极溶液、铁片电极13和盐桥9的负极部分；

3）正负极部分通过密封电极架6和盐桥9链接，放置于玻璃平台2之上；

4）电化学工作站（未画出），通过工作电极线7与铂黑电极4相连，通过对电极线10和参比电极线11与铁片电极13相连。

本发明的原理：本发明利用铂黑电极对氧气还原的催化性质，通过测量氧气还原反应的消耗电量数计算被还原的氧气质量，实现对样本的氧气含量测量。

本发明的功能和操作流程：在盐桥9中填充饱和氯化钾溶液，在正极反应池中加入适合样本的pH缓冲溶液，并对溶液充分除氧，在负极反应池加入饱和氯化钾溶液配制的柠檬酸溶液，按照图1进行装置组装，通过加样毛细管8持续对正极反应池通氮气隔绝氧气，开动磁力搅拌器后，在电化学工作站上选择时间电流曲线方法，电压设置为0V，时间设置为20000s，灵敏度设置为1×10^-4A/V，然后开始测量。此时系统电流由于初始状态堆积在两个电极表面的电荷开始运动，电流很大，但会逐渐减小，待电流减小幅度变小，电流趋于稳定，并降低到1.5×10^-6A以下并稳定时，加入样品并封闭，加入样品后电流将快速增大，而后逐渐降低，当电流降低速度减小，当电流平稳并接近加样前电流时，停止测量，实验结束并保存数据。将数据导出后截取加样起始点至测量结束点进行积分，得到的电量值经过计算，求得样品中氧气的含量。

具体步骤如下：

1、正极电极的制备：配制含有2 mmol/L K2PtCl6的0.5 mol/L H2SO4溶液8ml加入电解池，以1cm*1cm*0.1cm的铂片电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，将溶液通高纯氮气除氧30min后，使用循环伏安法在-0.2~1V的电位范围内以50mV/s的速度扫描600圈，完成后取出铂片电极，用双蒸水冲洗后放入双蒸水中备用。

2、负极电极的制备：将0.5mm厚的DT4E铁片切割成20mm*35mm大小，用金相砂纸将其表面打磨光亮，取出铁锈等痕迹后固定在不锈钢电极夹上制成负极电极。

3、正极溶液的除氧：使用石英亚沸水配制0.1mol/L pH=7的磷酸缓冲溶液，取适量溶液于离心管中放入真空干燥箱中进行真空处理（干燥箱保持室温且不添加干燥剂），使用真空泵不断抽真空至离心管壁析出气泡并微沸时停止，放置过夜后使用。

4、组装反应装置：包括磁力搅拌器、加样毛细管、正极反应池、正极电极、负极反应池、负极电极、盐桥、电化学工作站和计算机，按照图1所示的设计方案进行连接，加入正极溶液和负极溶液，通过氮气对正极反应池内的正极溶液进行除氧处理，开始正极池搅拌。

5、初始电流的稳定和样品加注：在回路接通之前，正负电极表面堆积了大量的电荷和离子，刚开始记录电流时，由于装置回路刚接通，两电极表面双电层不稳定，正负极电位差大，此时电流较大，随着两电极表面的双电层结构随时间趋于稳定，流过装置的电流逐渐减小并稳定，当电流降低并稳定一定超过300s后加入样本开始测量。

6、样本测量过程：用除氧的正极溶液将待测样品稀释1000倍后，以4ml/min的流速通过加样毛细管8向正极反应池5内加入1ml样品的稀释溶液，由于样品在反应池中的扩散和氧气还原反应的进行，电流会先快速增大，再缓慢减小，电流减小速度逐渐减慢，当电流减小速度逐渐变小并趋近于加样前电流时，视为正极反应池中氧气还原反应结束，对样本的测量结束。

7、测量结果和数据处理分析：对测量的电流-时间数据进行提取，选取未加入样品前无氧电流最后一个数据点为起始点，加入样品后电流减小趋近于无氧电流一定时间后一点为终止点，对此部分的电流-时间数据进行定积分，计算出氧气还原反应的总电量，推算出氧气质量，扣除样品溶剂溶氧量后，得到样品的携氧量。

在以上步骤1中，可根据实际需要选择面积更大、形状特殊的铂片电极或铂网电极来制作正极电极，也可选择修饰其他氧气还原反应的催化剂的其他类型的惰性电极。

在以上步骤2中，可根据实际需要选择面积更大、形状特殊、还原性更强的金属或化合物来制作负极电极，同时也可以改变负极溶液，使负极电极更容易失去电子，降低负极电动势。

在以上步骤3中，可根据样品的性质不同，更换保持样品生物活性的正极电解液，如不同pH值的PBS缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液和Tris缓冲溶液，或者生理盐水。

在以上步骤4中，盐桥由两个摘除含汞部分的甘汞电极通过橡胶管链接，为了加快其离子转移速度，可使用其他形状和原理的盐桥，并对正负极电解池进行适当调整。

在以上步骤5中，加样前电流大小有两电极电动势差和体系阻抗决定，电极电动势取决于正负极电极有效表面积、正负极电解液与电极类型，是否搅拌等；体系阻抗取决于盐桥阻抗、正负极溶液阻抗和电极表面积。由于未加样的空白电流过大会导致氧气还原反应电流占比减小，故应控制电极电动势适中不过大，减小盐桥和电解液阻抗。

在以上步骤6中，判断检测是否停止，取决于电流的稳定情况，当电流在300s内基本保持稳定且不具备下降趋势，则可认为测量可停止。但如果电流小于加样前电流，则证明加样前电流仍有下降空间，未达到稳定状态，测量数据无效。

在上述步骤7中，根据图2数据所计算的通入的稀释后样本携氧量为8.3251微克，即待测样品的总携氧量为8.3251mg/mL。

上述方法通过对氧气还原反应过程的电流进行测量，采用定积分求得氧气还原过程中的电量，推算出血液或血液代用品的总携氧量，对血液及血液替代品的携氧能力研究与分析起到关键作用。

与现有的分析装置及方法相比，本发明采用还原氧气测量电量的方法，不依赖样品的光谱性质，可将血液及其代用品储存的氧气充分释放，因此可对多种血液代用品进行携氧量测量。

本发明的另一目的是通过这样的技术方案实现对血液及血液代用品的氧饱和度进行测量，在前面所述步骤基础上，先对某氧分压下的样品进行溶氧量测量，将剩余样品调制氧饱和状态再次测量，测得样品完全携氧时的溶氧量进行测量，根据氧饱和度的公式可得：

氧饱和度=样品实际携带氧气量/样品携带氧气最大量。

首先测量样品在某一氧分压下的携氧量，再将样品放置于氧饱和环境内，测量样品的最大携氧量，将结果减去溶剂等其他干扰，所得到血液或血液替代品的携氧量，通过氧饱和度公式可计算出在某一氧分压下血液或血液替代品的氧饱和度。

本发明由于采用了不依赖样品光谱信息的电化学方法进行携氧量和氧饱和度的测量，不受样品种类和携氧机制的限制，可对各种血液及其代用品的氧饱和度和携氧量进行测量，将其与氧分压测量设备组合后，可绘制出氧解离曲线，为客观地测定评价血液及其代用品的携氧功能提供了可能，可以有效地评价出各种血液代用品的动力学特征。

实施例2

在实施例1基础上，在阳极电解池中加入少量二氧化锰固体，对过氧化氢标准品进行测量，通过计算不同浓度过氧化氢在二氧化锰催化下产生的已知氧气质量来标定装置的检测效果和精度。

如图3所示，本装置对过氧化氢标准品测量过程中，对氧气含量小的样品测量精度更高，当样品含氧量为5~8微克时，测量结果呈明显的线性关系，R²为0.9979，证明样品在这一范围内检测准确。一般血液及其代用品的总携氧量为5~8微克/毫升，当采用实施例1的方法对待测样品进行稀释1000倍的处理后，总携氧量能够维持在线性相关范围内，所测得的结果准确。