本发明属于新型功能材料与生物传感检测技术领域，具体涉及一种基于TiO2 MOFs纳米材料的整合型电致化学发光探针及其竞争型免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术：
间接竞争法，一种常用的分析方法，利用固相抗原与异相抗原去竞争结合一定量标记抗体，因此固相吸附的标记抗体与待测抗原的含量成反比，被广泛应用在荧光、电致化学发光、光电和电化学等领域。相比其他分析技术，电致化学发光具有灵敏度高、简单、快速反应等优点，其与竞争型分析技术的结合为生物传感器的发展提供了更广阔的应用前景。电致化学发光免疫传感器，利用抗原与抗体之间的特异性结合的一类生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点，具有良好的应用前景。本发明制备了一种基于TiO2 MOFs纳米材料的整合型电致化学发光探针及其竞争型电致化学发光免疫传感器，并实现对呕吐毒素的高灵敏检测。
TiO2 MOFs纳米材料因其独特的表面多孔结构、化学和物理稳定性、无毒性，优异的光散射和光捕获能力，使其成为电致化学发光传感器的理想材料。TiO2 MOFs纳米材料结合了TiO2介晶和金属有机框架的优点，使其具有更加优良的性能。本发明提供了一种基于TiO2 MOFs纳米材料的整合型电致化学发光探针的制备方法及其对呕吐毒素的竞争型免疫传感方法，特点是基于TiO2 MOFs纳米材料的大比表面积及较高孔隙率，分别引入钌联吡啶（Ru(bpy)32+）信号探针及巯基-环糊精（β-CD）；利用巯基-环糊精（β-CD）与氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs）的特异性识别，进一步引入氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs）作为电致化学发光共反应试剂，最终制备了一种整合型电致化学发光探针；通过将该电致化学发光探针进一步功能化呕吐毒素（DON）抗体，运用于竞争免疫策略，实现对呕吐毒素（DON）的高灵敏、高稳定性检测。所制得的竞争型电致化学发光免疫传感平台，具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测限低等优点，不仅可用于呕吐毒素（DON）的检测，还在临床应用方面具有非常重要的应用价值及实际意义。
技术实现要素：
本发明的目的之一是基于TiO2 MOFs纳米材料，制备一种整合型电致化学发光探针，从而构建一种简易、快速、稳定性好，灵敏度高的竞争型电致化学发光免疫传感器及其制备方法。
本发明的目的之二是将该电致化学发光免疫传感器应用于呕吐毒素的高灵敏检测。
为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：
1. 一种基于TiO2 MOFs纳米材料的整合型电致化学发光探针的制备及其对呕吐毒素的竞争型免疫传感方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2） 取1 mL 5 mg/ml碳纳米角（CNHs）与2.0 mL1.0 mg/mL 3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）溶液混合，在黑暗条件下反应12 h，经离心、洗涤，再分散制得PTCA@CNHs复合物溶液，随后，取2 mL浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液加入到上述复合物溶液中室温震荡过夜，以达到活化羧基的目的；然后将5 mL 5.56 mol/L 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到上述混合液中，在4 °C下震荡12 h，后经离心、洗涤，再分散制得APTES-PTCA@CNHs复合物；滴加5 μL 浓度为5 mg/ml APTES-PTCA@CNHs复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得APTES-PTCA@CNHs修饰玻碳电极；
（3）滴加5 μL浓度为5 mg/ml呕吐毒素（DON）于步骤（2）所制的修饰电极界面，将其置于红外灯下烘干，冷却至室温，制得Ag/APTES-PTCA@CNHs修饰玻碳电极；
（4）将步骤（3）制备的修饰电极置于浓度为1.0 wt.%的BSA溶液中孵育30 min，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；
（5）取体积比为1:1的5 mg/mL TiO2 MOFs溶液与1.0×10-2 mol/L 钌联吡啶（Ru(bpy)32+）在室温下混合震荡5 h，洗涤、离心制得TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+复合物；然后将上述复合物重新分散在去离子水中，再分别加入体积比为1:1 的5 wt.% 戊二醛与1mg/ml 呕吐毒素抗体（Ab）溶液，混合震荡1 h，经离心、洗涤、再分散得到TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液；取70 μL 1.0 mmol/L巯基-环糊精（β-CD）溶液加入到上述复合物溶液，在4°C下震荡90 min，完成β-CD的自组装，经离心、洗涤、再分散制得β-CD@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液，然后在上述溶液中加入1.0 wt.% BSA封闭非特异性吸附位点，最后加入70 μL 1.0×10-6 mol/L氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs）在12 °C 下反应90 min。经离心、洗涤、再分散制得整合型电致化学发光探针（F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab）复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用；
（6）将步骤（4）获得的修饰电极浸入不同浓度的呕吐毒素（DON）标准溶液中，并同时滴加80μL步骤（5）制备的整合型电致化学发光探针（F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab）复合物溶液，在4°C冰箱中孵育40 min，用去离子水冲洗电极表面，制得F-couSiPcs@TiO2MOFs@Ru(bpy)32+@Ab /BSA/Ag/APTES-PTCA@CNHs修饰玻碳电极, 并保存在4 °C冰箱中备用。
1. 上述3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）由下述方法制备的：将5 ml 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液加入到5 ml 5 mg/mL 3,4, 9,10-四羧酸二酐（PTCDA）溶液中，溶液颜色变为黄绿色后加逐滴加入0.5 mol/L盐酸溶液直至暗红色沉淀完全析出，经离心、洗涤数次，得到3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）。
2. 上述碳纳米角（CNHs）、3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）复合物由下述方法制备的：将1 mL 5 mg/ml碳纳米角（CNHs）与2.0 mL1.0 mg/mL 3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）溶液混合，在黑暗条件下反应12 h，经离心、洗涤，再分散制得PTCA@CNH复合物溶液，随后，取2 mL浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液加入到上述复合物溶液中室温震荡过夜，以达到活化羧基的目的，然后将5 mL 5.56 mol/L 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到上述混合液中，在4 °C下震荡12 h，后经离心、洗涤，再分散制得APTES-PTCA@CNHs复合物。
3. 上述TiO2 MOFs纳米材料由下述方法制备的：4.5 g 对苯二甲酸，9 mL 无水甲醇，81 mL 无水N, N-二甲基甲酰胺（DMF）以及2.34 ml 钛酸四丁酯混合后转移至100 mL反应釜中，在150 °C 下加热48 h，待反应物冷却后用甲醇离心、洗涤数次，最后，将所得产物在400 °C 下煅烧5 h，自然冷却即可。
4. 上述整合型电致化学发光探针（F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab）复合物溶液由下述方法制备的：1）体积比为1:1的5 mg/mL TiO2 MOFs溶液与1.0×10-2 mol/L 钌联吡啶（Ru(bpy)32+）在室温下混合震荡5 h，洗涤、离心收集沉淀物，然后重新分散在去离子水中，得到TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+复合物溶液；2) 在上述复合物溶液中分别加入体积比为1:1 的5 wt.% 戊二醛与1mg/ml 呕吐毒素抗体（Ab）溶液，混合震荡1 h，经离心、洗涤，再分散得到TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液；3）取70 μL 1.0 mmol/L巯基-环糊精（β-CD）溶液加入到上述复合物溶液，在4°C下震荡90 min，离心收集沉淀物得到β-CD@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物，重新分散于去离子水中，然后加入1 wt % BSA封闭非特异性活性位点，最后加入70 μL 1.0×10-6 mol/L氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs），并在12 °C 下反应90 min,之后用去离子水洗涤反应混合物数次，离心之后重新分散于去离子水中制得F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用。
5. 呕吐毒素（DON）的检测步骤：
（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以权利要求6所述的竞争型免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）采用电位范围0 V-1.6 V，扫描速率0.05 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的呕吐毒素（DON）标准溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集1.1 V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与呕吐毒素（DON）标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）待测样品溶液代替呕吐毒素（DON）标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。
本发明的显著优点为：
（1）间接竞争法，一种常用的分析方法，利用固相抗原与异相抗原去竞争结合一定量标记抗体，因此固相吸附的标记抗体与待测抗原的含量成反比，已被广泛应用在荧光、电致化学发光、光电和电化学等领域。相比其他分析技术，电致化学发光具有灵敏度高、简单、快速反应等优点，其与竞争型分析技术的结合为生物传感器的发展提供了更广阔的应用前景。
（2）具有大比表面积的CNHs作为生物传感器传感平台可以承载大量的生物分子，同时，3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）作为一种连接剂可以将DON紧密结合到电极表面，得到一个稳定的ECL信号。
（3）具有大比表面积及较高孔隙率的TiO2 MOFs纳米材料作为生物传感器探针平台可以承载大量的生物分子及信号探针，同时，基于巯基-环糊精（β-CD）与氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs）的特异性识别，引入大量敏化试剂氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs），由于氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs）的吸电子基团可加速钌联吡啶失去电子，得到一个增强的ECL信号，从而制备一种高效整合型电致化学发光探针。
（3）本发明利用抗原、抗体的免疫反应，提高了检测方法的特异性。
附图说明
图1为碳纳米角（CNHs）、3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）及PTCA@CNHs复合物溶液的紫外光谱图，图中a、b、c曲线分别表示碳纳米角（CNHs）、3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）及PTCA@CNHs复合物溶液的紫外吸收曲线。
图2为免疫传感电极的电致化学发光响应信号与呕吐毒素（DON）标准溶液浓度的线性关系图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
一种基于TiO2 MOFs纳米材料的整合型电致化学发光探针及其对呕吐毒素的竞争型免疫传感器的制备方法：
（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；
（2）取1 mL 5 mg/ml碳纳米角（CNHs）与2.0 mL1.0 mg/mL 3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）溶液混合，在黑暗条件下反应12 h，经离心、洗涤，再分散制得PTCA@CNHs复合物溶液，随后，取2 mL浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液加入到上述复合物溶液中室温震荡过夜，以达到活化羧基的目的；然后将5 mL 5.56 mol/L 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到上述混合液中，在4 °C下震荡12 h，后经离心、洗涤，再分散制得APTES-PTCA@CNHs复合物；滴加5 μL 浓度为5 mg/ml APTES-PTCA@CNHs复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得APTES-PTCA@CNHs修饰玻碳电极；
（3）滴加5 μL浓度为5 mg/ml呕吐毒素（DON，又称去氧瓜萎镰菌醇）于步骤（2）所制的APTES-PTCA@CNHs修饰电极界面，将其置于红外灯下烘干，冷却至室温，制得Ag/APTES-PTCA@CNHs修饰玻碳电极；
（4）将步骤（3）制备的修饰电极置于浓度为1.0 wt.%的BSA溶液中孵育30 min，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；
（5）取体积比为1:1的5 mg/mL TiO2 MOFs溶液与1.0×10-2 mol/L 钌联吡啶（Ru(bpy)32+）在室温下混合震荡5 h，洗涤、离心制得TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+复合物；然后将上述复合物重新分散在去离子水中，再分别加入体积比为1:1 的5 wt. % 戊二醛与1mg/ml 呕吐毒素抗体（Ab）溶液，混合震荡1 h，经离心、洗涤、再分散得到TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液；取70 μL 1.0 mmol/L巯基-环糊精（又称β-环状糊精，简称β-CD）溶液加入到上述复合物溶液，在4°C下震荡90 min，完成β-CD的自组装，经离心、洗涤、再分散制得β-CD@TiO2MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液，然后在上述溶液中加入1.0 wt.% BSA封闭非特异性吸附位点，最后加入70 μL 1.0×10-6 mol/L氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs）在12 °C 下反应90 min，经离心、洗涤、再分散制得整合型电致化学发光探针（F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab）复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用；
（6）将步骤（4）获得的修饰电极浸入不同浓度的呕吐毒素（DON）标准溶液中，并同时滴加80μL步骤（5）制备的整合型电致化学发光探针（F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab）复合物溶液，在4°C冰箱中孵育40 min，用去离子水冲洗电极表面，制得F-couSiPcs@TiO2MOFs@Ru(bpy)32+@Ab /BSA/Ag/APTES-PTCA@CNHs修饰玻碳电极, 并保存在4 °C冰箱中备用。
实施例2
上述实施例1所用的3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）的制备：将5 ml 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液加入到5 ml 5 mg/mL 3,4, 9,10-四羧酸二酐（PTCDA）溶液中，溶液颜色变为黄绿色后加逐滴加入0.5 mol/L盐酸溶液直至暗红色沉淀完全析出，经离心、洗涤数次，得到最终产物。
实施例3
上述实施例1所用的碳纳米角（CNHs）、3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）复合物的制备：将1 mL 5 mg/ml碳纳米角（CNHs）与2.0 mL1.0 mg/mL 3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）溶液混合，在黑暗条件下反应12 h，经离心、洗涤，再分散制得PTCA@CNH复合物溶液，随后，取2 mL浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液加入到上述复合物溶液中室温震荡过夜，以达到活化羧基的目的，然后将5 mL 5.56 mol/L 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到上述混合液中，在4 °C下震荡12 h，后经离心、洗涤，再分散制得APTES-PTCA@CNH复合物。图1为碳纳米角（CNHs）、3,4,9,10-苝四甲酸（PTCA）及PTCA@CNHs复合物溶液的紫外光谱图。相比于CNHs，PTCA@CNH在439 nm and 467 nm处有特征吸收峰，说明PTCA已经成功地结合到CNHs上。
实施例4
上述实施例1所用的TiO2 MOFs纳米材料的制备：4.5 g 对苯二甲酸，9 mL 无水甲醇，81 mL 无水N, N-二甲基甲酰胺（DMF）以及2.34 ml 钛酸四丁酯混合后转移至100 mL反应釜中，在150 °C 下加热48 h，待反应物冷却后用甲醇离心、洗涤数次，最后，将所得产物在400 °C 下煅烧5 h，自然冷却即可。
实施例5
上述实施例1所用的整合型电致化学发光探针（F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab）复合物溶液由下述方法制备的：1）体积比为1:1的5 mg/mL TiO2 MOFs溶液与1.0×10-2mol/L 钌联吡啶（Ru(bpy)32+）在室温下混合震荡5 h，洗涤、离心收集沉淀物，然后重新分散在去离子水中，得到TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+复合物溶液；2) 在上述复合物溶液中分别加入体积比为1:1 的5 wt.% 戊二醛与1mg/ml 呕吐毒素抗体（Ab）溶液，混合震荡1 h，经离心、洗涤，再分散得到TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液；3）取70 μL 1.0 mmol/L巯基-环糊精（β-CD）溶液加入到上述复合物溶液，在4°C下震荡90 min，离心收集沉淀物得到β-CD@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物，重新分散于去离子水中，然后加入1.0 wt.% BSA封闭非特异性活性位点，最后加入70 μL 1.0×10-6 mol/L氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs），并在12 °C 下反应90 min，之后用去离子水洗涤反应混合物数次，离心之后重新分散于去离子水中制得F-couSiPcs@TiO2 MOFs@Ru(bpy)32+@Ab复合物溶液，储存在4°C冰箱中备用。
实施例6
上述实施例1所用的钌联吡啶（Ru(bpy)32+）购买于上海化学科技有限公司；氟代香豆素硅酞菁（F-couSiPcs）购买于武汉鑫伟烨化工有限公司。
实施例7
呕吐毒素（DON）的检测步骤：
（1）使用电化学工作站采用三电极体系进行测定，以实施例1所制备的竞争型免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，在0.1 mol/mL pH 8.0的 PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）采用电位范围0 V-1.6 V，扫描速率0.05 V/s电位窗口，电致化学发光设备光电倍增管800 V对不同浓度的呕吐毒素（DON）标准溶液进行检测，通过电致化学发光设备采集1.1 V的ECL信号强度，通过ECL信号强度与呕吐毒素（DON）标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（3）待测样品溶液代替呕吐毒素（DON）标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线查得。