本发明涉及以鸡传染性支气管炎病毒5b蛋白为包被抗原的elisa抗体检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
传支冠状病毒(infectiousbronchitiscoronavirus,ibv)：传染性支气管炎病毒ibv是由套式病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属γ冠状病毒亚属ibv引起的急性高度接触性呼吸道疾病，主要以张口呼吸，气管啰音，咳嗽，腺胃肿大、出血，“花斑肾”为特征。ibv是不分节的单股正链rna病毒，全长约27.6kb，不连续转录机制，含有十个明显的开放阅读框orf,5’1a-1b-s-3a-3b-e-m-5a-5b-n-3’。编码4种结构蛋白s、n、m、e和15种非结构蛋白nsp2-nsp16以及4种附属蛋白3a、3b、5a、5b。
ibv感染细胞后,在早期rna聚合酶作用下转录出负链rna,在晚期rna聚合酶作用下以不连续转录机制从负链rna转录出6种亚基因组mrna(l-6)。这些mrna具有共同的3’末端,形成套式结构。其中mrna2、mrna4和mrna6分别编码ibv三个主要结构蛋白:纤突蛋白(spike,s)、膜蛋白(membrane,m)和核蛋白(nucleocapsid,n)。mrna5大约由443个核昔酸组成,包含两个orf(orf5a和orf5b),分别编码分子量约7.4kda和9.5kda的两种多肽。
不像α和β冠状病毒nsp1抑制宿主蛋白的合成，γ冠状病毒ibv没有nsp1的同源染色体，有文献证明在γ冠状病毒ibv中5b代替nsp1抑制宿主蛋白的合成。在冠状病毒属中5b的结构和功能均保守。非结构蛋白是在病毒感染复制阶段产生的，不参与病毒粒子的组成，灭活的疫苗不具有感染复制能力，也就无法产生非结构蛋白，以非结构蛋白5b作为检测抗原具有区分灭活疫苗免疫和活毒感染的潜力。
由于当前国内防控ibv主要还是以灭活和弱毒疫苗免疫为主，其中灭活疫苗的免疫效果远没有弱毒疫苗的免疫效果好。ibv具有易突变的特性，其中弱毒疫苗可能又会有散毒的风险，这些对于将来ibv疾病的净化带来很大的挑战，所以弱毒疫苗必将随着技术的发展而淘汰。
现有技术不管是用全病毒蛋白包被还是用非结构蛋白、结构蛋白包被的间接elisa方法，都不能区分疫苗免疫和活毒感染，因为当前ibv的防控主要还是以灭活疫苗和弱毒疫苗免疫为主，弱毒疫苗在免疫过程中会产生非结构蛋白。所以随着将来弱毒疫苗退出市场，这里提供一种新的，可选择的间接elisa方法来净化ibv疾病。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，为临床ib的诊断和抗体水平的检测以及将来对ibv疾病净化提供经济实用可靠的检测工具。
为解决上述技术问题，本发明的解决方案是提供一种鸡传染性支气管炎病毒5belisa抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：ibv非结构蛋白5b包被的elisa反应板。
其中，ibv非结构蛋白5b的核苷酸序列如seqidno.1所示；其氨基酸序列如seqidno.2所示。
作为一种优选的实施方式，ibv非结构蛋白5b是通过重组表达产生的。
作为本发明一种可选的实施方式，ibv非结构蛋白5b重组表达的方法如下：
s1.rt-pcr扩增ibv5b基因；作为优选的实施方式，扩增ibv5b基因的引物对如seqidno.3和seqidno.4所示；
s2.将步骤s1所得基因整合到质粒载体中，获得重组质粒；作为优选的实施方式，所述的质粒载体为pet-32a；
s3.将步骤s2所构建的重组质粒转化到宿主菌中并诱导表达，获得菌液；作为优选的实施方式，所述的宿主菌为大肠杆菌；
s4.筛选携带ibv5b基因的重组菌，在iptg诱导下大量表达与his融合的5b重组蛋白；
s5.利用his标签镍柱亲和层析柱纯化，获得提纯后的ibv5b重组蛋白。
进一步地，本发明的试剂盒，还包括以下组分：
(1)酶标试剂：所述的酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡igg抗体。
(2)封闭液：所述的封闭液为含bsa或脱脂奶粉的pbs(即pbst)；优选地，为含5％脱脂奶粉的pbs。
(3)洗涤液：所述的洗涤液为含0.01～0.1％tween-20的pbs(即pbst)；优选地，为含0.05％tween-20的pbs。
(4)稀释液：所述的稀释液为含bsa或脱脂奶粉的pbst；优选地，为含5％脱脂奶粉的pbst.。
(5)阳性对照样品：所述的阳性对照样品为抗ibv5b鸡血清。
(6)阴性对照样品：述的阴性对照样品阴性spf(specificpathogenfree无特定病原)
(7)显色液：所述的显色液为tmb单组分显色液。
(8)终止液：所述的终止液为1m～2mh2so4；优选地，为2mh2so4。
上述的试剂盒的使用方法为：
1)抗原包被；
制备的重组5b蛋白经bca蛋白检测试剂盒测定浓度后，用包被液将其稀释，加入到酶联反应板中，于孵育过夜，即制备好酶联反应板。其中，抗原包被的浓度为2～10μg/ml，抗原包被为4℃孵育过夜；优选地，抗原包被的浓度为5μg/ml；优选地，包被液为ph为9.6的0.05m碳酸盐缓冲液。
2)封闭；
去掉酶联反应板的包被液后，加入封闭液孵育，用pbst洗板一次；其中，封闭液为脱脂奶粉或bsa的pbs，封闭孵育时间为1～3h；优选地，封闭液为含0.2％bsa或5％或7.5％脱脂奶粉，封闭时间为2h；更优选地，封闭液为5％的脱脂奶粉的pbs。
3)一抗孵育；
加入用稀释液以1:400稀释的待检血清(一抗)，同时设置阳性和阴性血清对照；孵育，pbst洗板5次。其中，待检血清的稀释浓度为1:200～1:600，一抗在35～39℃孵育45～90min；优选地，血清的稀释浓度为1:400；一抗在37℃孵育1h。其中，所述的稀释液为含bsa或脱脂奶粉的pbst；优选地，为含5％脱脂奶粉的pbst。
4)二抗孵育；
加入用稀释液以1:10000稀释的hrp标记的羊抗鸡igg二抗，孵育，pbst洗板5次。其中酶标二抗稀释倍数为1：5000～1:10000，二抗在35～39℃孵育30～90min；优选地，酶标二抗稀释倍数为1:10000，二抗在37℃孵育45min。
5)显色；
以加入显色剂反应孔，在黑暗处显色。其中显色剂为tmb，在室温避光显色8～15min；优选显色10min。
6)终止；
采用的终止液为1m～2mh2so4；优选地，为2mh2so4。
7)结果判定。
采用酶标仪测od450nm处吸光值判定标准为：对样品od450nm值≥
0.336时判定为ibv阳性，反之则为阴性。
上述的试剂盒，其应用于检测传染性支气管炎灭活疫苗免疫鸡和鸡感染传染性支气管炎后诱导产生的传染性支气管炎病毒特异性抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的ibvelisa抗体检测试剂盒，以非结构蛋白5b作为包被抗原。
非结构蛋白不参与病毒粒子的组成，以非结构蛋白5b作为检测抗原具有区分灭活疫苗免疫和活毒感染的潜力。本试剂盒的使用具有方便快捷、敏感性高、特异性强等优点，为ibv抗体监测、流行病学调查以及将来对ibv的疾病净化提供了一种新的有效的检测手段。
附图说明
图1ibv重组5b蛋白的表达；
图25b纯化westernblot图；…
图3攻毒lx4毒株组5b-elisa检测结果；
图4攻毒qxibv2毒株组5b-elisa检测结果。
具体实施方式
一种鸡传染性支气管炎病毒5belisa抗体检测试剂盒
本发明中所利用的试剂盒组成包括：
(1)重组表达的ibv非结构蛋白5b和elisa反应板；
(2)用样品稀释液稀释的igg酶标抗体溶液。所述酶标抗体为辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鸡igg抗体；
(3)封闭液：含5％的脱脂奶粉的pbs；
(4)洗涤液：含0.05％tween-20的pbs，即pbst；
(5)样品稀释液：含5％脱脂奶粉的pbst；
(6)阳性对照样品：抗ibv5b鸡血清；
(7)阴性对照样品：阴性spf鸡血清；
(8)显色液：tmb单组分显色液(biohao)
(9)终止液：2mh2so4。
上述试剂盒的使用方法
依次包括下列步骤：
(1)elisa抗原的制备：
利用ibv5b特异性引物以ibvlx4毒株感染的鸡胚尿囊液抽提的核酸为模板，经rt-pcr方法扩增获得ibv5b的基因，将其克隆到原核表达载体pet-32a中，转化大肠杆菌，筛选携带ibv5b基因的重组菌，在iptg诱导下大量表达与his融合的5b重组蛋白，利用his标签镍柱亲和层析柱纯化，获得高纯度的ibv5b重组蛋白保存于-80℃备用。所述ibv5b的基因的核苷酸序列如seqidno：1所示；ibv5b的基因编码的氨基酸序列如seqidno：2所示。
seqidno：1ibv5b基因的核苷酸序列
atgaataatagtaaagataatccttttcgcggagcaatagcacgaaaagcgcgaatttatctgagaggaggattagattgtgtttactttcttaacaaagcaggacaagcagagccttgccccgcgtgcacatcactagtattccaggggaaaacttgtgaagagcacatacgtaataataacttgctatcatggcgagcggtaaagcagctggaaagtcagactcccccgcgccaatcatcaaactag
seqidno：2
ibv5b基因的氨基酸序列
mnnskdnpfrgaiarkariylrggldcvyflnkagqaepcpactslvfqgktceehirnnnllswravkqlesqtpprqssn
扩增ibv5b基因的引物对如seqidno.3和seqidno.4所示：
seqidno.3:5b-fcgcggatccatgaataatagtaaagata
seqidno.4:5b-rcccaagcttctagtttgatgattggcgc
(2)ibv5b包被的酶联反应板的制备：
制备的重组5b蛋白经bca蛋白检测试剂盒测定浓度后，用包被液将其稀释到5μg/ml的量，按200μl/孔加入到酶联反应板中，于4℃孵育过夜，即制备好酶联反应板；
(3)封闭：上述制备好的酶联反应板，去掉包被液后，pbst洗板5次，加入200μl/孔的封闭液，37℃孵育2小时，用pbst洗板一次；
(4)一抗孵育：加入100μl/孔用稀释液以1:400稀释的待检血清(一抗)，同时设置阳性和阴性血清对照。37℃孵育1小时，pbst洗板5次；
(5)二抗孵育：加入100μl/孔用稀释液以1:10000稀释的hrp标记的羊抗鸡igg二抗，37℃孵育45分钟，pbst洗板5次；
(6)显色：以100μl/孔加入反应孔，在黑暗处显色10分钟；
(7)终止：加入100μl/孔终止液。
(8)结果判定：以酶标仪测定od450读数，如血清样品值大于0.336，判为ibv阳性，反之则为阴性。
下面结合实施例和附图作进一步说明。应该理解这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。
实施例15b重组蛋白抗原的制备
将携带有pet-32a-5b载体的表达宿主菌e.colibl21(de3)经lb液体培养基活化，按1:100转接于含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中大量培养扩繁。当菌液的od600nm达0.4-0.6时加入终浓度为1mm的iptg诱导表达6h后，4℃10,000rpm离心10min收集菌体，使用镍柱亲和层析柱，按照产品手册纯化目的蛋白。洗脱后获得的蛋白取样进行sds-page分析。如图2所示，纯化的重组蛋白pet-32a-5b分子量大小为27kd，具有很高的纯度。纯化的pet-32a-5b保存在-80℃备用。
实施例2阴阳性血清的制备和筛选
本试剂盒使用到的阳性血清可通过将实施例1纯化到的重组pet-32a-5b蛋白，按1mg/只的剂量免疫spf鸡三次后，收集和分离免疫鸡血清，利用间接免疫荧光试验(ifa)验证血清中含有高效价的抗5b抗体后，分装于-80℃保存，作为ibv5b阳性血清。未免疫spf鸡血清，用ifa验证为ibv5b抗体阴性后，分装-80℃保存，即为ibv5b阴性血清。
实施例3感染ibv血清和未感染ibv血清的制备
40只3周龄spf鸡分为4组，分别感染弱毒qxibv2和强毒组lx4，免疫m41灭活疫苗以及pbs对照组。
表1
实施例45belisa方法的优化
1.5belisa方法的步骤
(1)包被：用elisa包被液将抗原稀释至工作浓度，按200μl/孔包被酶标板,4℃包被过夜，pbst洗板5次；
(2)封闭：以200μl/孔的量加入封闭液，37℃封闭2h，pbst洗板5次；
(3)一抗的孵育：以100μl/孔的量加入稀释的待检血清，37℃恒温箱孵育1h，pbst洗板5次；
(4)二抗的孵育：以100μl/孔的量加入稀释好的hrp标记的羊抗鸡igg，37℃恒温箱中孵育1h(优化前的时间)，pbst洗板5次；
(5)显色：以100μl/孔的量加入tmb底物，37℃恒温箱中避光显色10-15min；
(6)终止：以100μl/孔的量加入2mh2so4终止液终止反应；
(7)读数：使用酶标仪测定各孔在od450nm处吸光值。
(8)判断结果。
以上述的基本程序为基础，对5belisa的反应条件进行优化。
2.elisa反应条件的优化
(1)抗原及血清的最佳工作浓度确定
根据重组蛋白的浓度依次用elisa包被液将蛋白稀释为0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml，每孔100ul包被elisa板，4度包被过夜。在96孔酶联反应板上采用方阵法优化，将阳性和阴性血清作1:20、1:100、1:200、1:400、1:600稀释。elisa反应后测定od450nm值，选取p/n值(阳性血清od450nm平均值/阴性血清od450nm平均值)最大为优化的最终条件。经分析，当抗原包被浓度为2～10ug/ml，血清稀释倍数为1:200～1:600，p/n值较大，可实现检测功能。最佳地，当抗原包被浓度为5μg/ml，待检血清稀释倍数为1:400时，p/n值最大。
表2
(2)酶标抗体工作浓度的选择
在确定的最佳抗原包被浓度和血清稀释倍数基础上，将酶标二抗分别作1:1000、1:2000、1:5000、1:10000稀释，进行elisa检测，选择p/n值最大的酶标抗体稀释倍数为最佳工作浓度。经分析，当酶标抗体的稀释倍数为1:10000时，p/n最大，可实现检测功能。
表3
(3)包被液的选择
分别以单蒸水(h2o,ph5.0)、0.9％nacl的生理盐水(ns,ph7.0)、0.01m磷酸盐缓冲液(pbs,ph7.4)、0.05m碳酸盐缓冲液(cb,ph9.6)作为包被液，进行elisa检测，选定p/n值最大对应的包被液。0.05mph9.6碳酸盐缓冲液为包被液时，p/n值最大。
表4
(4)封闭液的选择
分别用2％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、7.5％脱脂奶粉、0.1％bsa、0.5％bsa、1％bsa作封闭液，进行elisa检测，选定p/n值最大对应的封闭液。经分析，当封闭液为5％和7.5％脱脂奶或0.2％bsa时p/n较大，可实现检测功能。最佳地，当5％脱脂奶为封闭液时，p/n值最大。
表5
(5)一抗稀释液的选择
分别以pbs，0.05％tween-20的pbs(pbst1)，0.1％tween-20的pbs(pbst2)，o.1％bsa的pbs，1％bsa的pbs，5％脱脂奶的pbs作一抗稀释液，进行elisa检测，选定p/n值最大对应的一抗稀释液。经分析，当1％bsa的pbs、1％bsa的pbs、5％脱脂奶的pbs为稀释液时，p/n值较大，可实现检测功能。最佳地，当含5％脱脂奶为样品稀释液时，p/n值最大。
表6
(6)一抗反应时间的选择
加入稀释的一抗后，分别在37℃孵育10min、30min、45min、60min、90min，进行elisa检测，选定p/n值最大对应的一抗反应时间。经分析，当待检血清反应时间为60min～90min，p/n值较大，可实现检测功能。最佳地，当待检血清反应时间为60min时，p/n值最大。
表7
(7)酶标二抗反应时间的选择
加入稀释的酶标抗体后，分别在37℃孵育10min、30min、45min、60min、90min，进行elisa检测，选定p/n值最大对应的酶标抗体反应时间。经分析，当酶标二抗反应时间为45min90min，p/n值较大，可实现检测功能。最佳地，当酶标二抗反应时间为45min时(45min为优化后的时间)，p/n值最大。
表8
(8)tmb底物反应时间的选择
加入显色液后分别在37℃孵育3min、5min、8min、10min、15min、20min、25min，之后加100μl/孔的2mh2so4终止，选定p/n值最大对应的tmb底物反应时间。经分析，当底物反应时间为8min～15min，p/n值较大，可实现检测功能。最佳地，当底物反应时间为10min时，p/n值最大。
表9
因此，最终确定的最佳反应条件为：反应条件的优化，确定了最佳反应条件：抗原包被浓度为5μg/ml，待检血清稀释倍数为1:400，酶标抗体稀释倍数为1:10000；0.05mph9.6的碳酸盐缓冲液为包被液；5％脱脂奶粉为封闭液；5％脱脂奶为样品稀释液；待检血清和酶标二抗反应时间分别为60min和45min，底物反应时间10min。
实施例5判定标准的确定
选取30份阴性血清，用优化的elisa反应体系检测血清抗体od450值。对结果进行统计学分析，得出od450值的平均值(x)和标准差(s)，以此作为elisa方法阴、阳性判定的临界标准。
表10elisa测定结果
经计算，以上30份阴性血清平均值x＝0.194，标准差s＝0.0475，elisa阴阳临界值＝x+3s＝0.336，所以以od450值0.336阴阳性血清临界值。
实施例6特异性试验
使用建立的elisa方法最优条件检测鸡新城疫病毒(ndv)阳性血清，禽流感病毒(aiv)阳性血清和禽白血病病毒(alv-k)阳性血清，设立ibv阳性和阴性血清对照，鉴定该方法的特异性。检测结果显示上述血清结果均为阴性，表明重组抗原与上述血清不存在交叉反应，具有较好的特异性。
表11
实施例7重复性试验
用优化的elisa反应体系，选取3份阳性和1份阴性血清进行重复性实验，同时设立空白对照孔，结果进行统计学分析，分别计算各组的平均数(x)、标准差(s)和变异系数(c.v)。检测结果显示变异系数均小于5％，说明同一样品在不同批次试验中变异程度小，重复性较好。
表12
实施例85b-elisa方法的初步应用
对感染lx4毒株的spf鸡和感染qxibv2毒株的spf鸡以及免疫灭活疫苗的和对照组的spf鸡分别在3d、5d、7d、10d、13d、21d翅隐静脉采血并分离血清，-80℃保存。采用建立的5b-elisa方法检测3d、5d、7d、10d、13d、21d的spf鸡血清，具体步骤为：用elisa包被液将抗原稀释至5μg/ml，按200μl/孔包被酶标板,4℃包被过夜，pbst洗板5次；封闭：以200μl/孔的量加入5％脱脂奶粉封闭液，37℃封闭2h，pbst洗板5次；一抗的孵育：以100μl/孔的量加入用5％脱脂奶稀释1:400的待检血清，37℃恒温箱孵育1h，pbst洗板5次；二抗的孵育：以100μl/孔的量加入稀释1:10000的hrp标记的羊抗鸡igg，37℃恒温箱中孵育1h，pbst洗板5次；显色：以100μl/孔的量加入tmb底物，37℃恒温箱中避光显色10min；
终止：以100μl/孔的量加入2mh2so4终止液终止反应；读数：使用酶标仪测定各孔在od450nm处吸光值。判断结果如图3和4。
表明使用5b-elisa方法检测攻毒实验动物血清，对照组和灭活疫苗组3d、5d、7d、10d、13d、21d的全为阴性，od450值<0.336。攻毒组5d和7d显示为阴性，10d，13d和21d显示为阳性。商品化试剂盒idexxibv检测试剂盒检测结果显示与5belsia检测结果相符合，对照组3d、5d、7d、10d、13d、21d全为阴性，攻毒组攻毒成功的和灭活疫苗组显示为阳性。说明建立的5b-elisa检测方法具有区分灭活疫苗免疫和活毒感染的潜力。
序列表
<110>华南农业大学
<120>鸡传染性支气管炎病毒5belisa抗体检测试剂盒及其应用
<141>2018-03-27
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>249
<212>dna
<213>fectiousbronchitiscoronavirus
<400>1
atgaataatagtaaagataatccttttcgcggagcaatagcacgaaaagcgcgaatttat60
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<210>2
<211>82
<212>prt
<213>fectiousbronchitiscoronavirus
<400>2
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<211>28
<212>dna
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<400>3
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<210>4
<211>28
<212>dna
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