本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种铁染色试剂。
背景技术：
铁染色是骨髓细胞形态学检查常用的细胞化学染色方法之一。它对于诊断和鉴别缺铁性贫血、非缺铁性贫血(如营养性巨幼红细胞贫血、再生障碍性贫血、难治性贫血等)和铁粒幼红细胞贫血有重要的价值。普鲁士蓝染色是一种普遍使用的显示铁的染色方法，其检测原理是骨髓中的细胞内外铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，可形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁部位，蓝色沉淀颗粒的多少和深浅与细胞内外铁的含量成正比。现有技术在进行骨髓细胞铁染色时大多出现细胞类型不易区分，细胞结构不清晰，严重影响细胞内铁的对察。中国专利公开号cn105136549a公开了一种含核固红复染液的铁染色试剂盒及其染色方法，所述铁染色试剂盒中核固红复染液包含去污剂tritonx-100。该发明调整了核固红复染液的成分组成，加入了去污剂tritonx-100，使其在进行骨髓细胞铁染色时相比常规核固红复染液更易于区分细胞类型，细胞结构清晰，对察细胞内铁的判定更准确，同时在本发明染色方法中，采用微波方式替代常规的水浴方式，使得整体的染色时间大幅缩短。技术实现要素：本发明目的是提供一种铁染色试剂，可使骨髓铁染色细胞结构清晰，细胞类型易区分，从而更易于观察细胞内铁。本发明采用如下技术方案：一种沙黄染色液，含有沙黄和缓冲液。进一步地，所述缓冲液选自tris缓冲液、hepes缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等中的一种或几种；优选包括磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液等中的一种或几种。进一步地，上述沙黄染色液的ph值范围为4.5-6.5；优选为5.2-6.2；进一步优选为5.8。作为优选，所述缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；更优选地，磷酸二氢钾在沙黄染色液中的浓度为14.46g/l，磷酸氢二钠在沙黄染色液中的浓度为3.72g/l。进一步地，上述沙黄染色液中，沙黄的浓度为0.04-5g/l，优选为0.06-1g/l，更优选为0.1g/l。进一步地，上述沙黄染色液中还可含有适量防腐剂。所述防腐剂可选自proclin系列防腐剂(supelco公司提供)、叠氮钠、苯酚、咪唑烷基脲(izu)等中的一种或多种；其中所述proclin系列防腐剂优选为proclin300。上述沙黄染色液中防腐剂的含量以0.1-5g/l为宜，可优选为1-4g/l，或可优选为1-2g/l。上述沙黄染色液可按常规方法配制。本发明意外地发现，当上述含有缓冲液的沙黄染色液用于骨髓细胞铁染色时，不仅可使细胞结构清晰，易于将幼红细胞、单核细胞和粒细胞区分开来；而且还可使核浆对比度更清晰，更易于观察细胞内铁。本发明还提供一种铁染色试剂(或铁染色试剂盒)，其包括上述沙黄染色液。该铁染色试剂(或铁染色试剂盒)还包括固定剂(或固定液)、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液等中的一种或几种。其中，固定剂(或称固定液)、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液均可按常规铁染色方法的需要进行配制。为更好地提高染色效果，所述固定剂优选由乙醇、甲醛、戊二醛中的一种或多种配制而成。特别是当所述固定剂中含有戊二醛时，染色效果更好，更利于使核浆对比度更清晰，更易于观察细胞内铁。进一步地，所述固定剂中乙醇、甲醛、戊二醛的浓度分别优选为650-900ml/l、50-150ml/l、10-100ml/l。所述固定剂中乙醇、甲醛、戊二醛的浓度分别更优选为750-890ml/l、60-130ml/l、20-80ml/l。较佳地，所述固定剂中乙醇、甲醛、戊二醛的浓度分别为810ml/l、90ml/l、50ml/l。若无特殊指明，本发明所述戊二醛均指50％戊二醛。进一步地，所述亚铁氰化钾溶液的浓度为1-200g/l，优选为20-200g/l，更优选为120-150g/l，较佳为108g/l。为解决亚铁氰化钾溶液易氧化失效的问题，所述亚铁氰化钾溶液还可含有适量抗氧化剂。所述抗氧化剂以亚硫酸为佳，其含量以5±1g/l为宜。进一步地，所述盐酸溶液的浓度为1-200g/l，优选为20-200g/l，更优选为120-150g/l，较佳为108g/l。当所述亚铁氰化钾溶液与所述盐酸溶液的浓度相同时，临用前可将二者按体积比1:1混匀后再使用，可选择滴染或浸染。若无特殊说明，本发明均以水为溶剂。具体地，上述铁染色试剂包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇65～90％亚铁氰化钾0.1～20％浓盐酸0.1～20％沙黄0.004～0.5％甲醛5～15％亚硫酸0～0.6％纯化水余量；缓冲液0.05～10％50％戊二醛1～10％纯化水余量；防腐剂0.01～0.5％；纯化水余量；纯化水余量。优选地，上述铁染色试剂包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇75～89％亚铁氰化钾2～20％浓盐酸2～20％沙黄0.006～0.1％甲醛6～13％亚硫酸0～0.5％纯化水余量；缓冲液0.2～6％50％戊二醛2～8％纯化水余量；防腐剂0.1～0.4％；纯化水余量；纯化水余量。较佳地，上述铁染色试剂包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇81％亚铁氰化钾10.8％浓盐酸10.8％沙黄0.01％甲醛9％亚硫酸0～0.5％纯化水余量；缓冲液0.5％50％戊二醛5％纯化水余量；防腐剂0.2％；纯化水余量；纯化水余量。本发明还包括上述沙黄染色液或上述铁染色试剂(或铁染色试剂盒)在铁染色方面的应用，尤其是在骨髓细胞等铁染色方面的应用。本发明还提供一种骨髓细胞铁染色的方法，包括如下步骤：1)将骨髓涂片上滴加固定剂固定(一般将固定剂布满涂片固定约60秒)，水洗待干；2)将亚铁氰化钾溶液与盐酸溶液配制成工作液，将骨髓涂片用该工作液染色；一般地，可将向骨髓涂片上滴加或将骨髓涂片浸入工作液中至布满涂片，于37℃左右染色30分钟左右；然后用纯化水充分冲洗，待干或用滤纸吸干；3)用上述沙黄染色液复染，水洗，干后镜检。一般地，可在室温条件下复染2分钟左右。本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。进一步地，可使用本发明上述亚铁氰化钾溶液与盐酸溶液配制工作液；优选地，所述工作液中亚铁氰化钾与盐酸的的含量分别为2％-20％。检测原理：正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。结果判定：幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。细胞内(外)和细胞间隙无蓝色沉淀物为阴性、有蓝色沉淀物为阳性。与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明沙黄染色液采用缓冲液配制，可使骨髓铁染色细胞结构清晰，易于将幼红细胞、单核细胞和粒细胞区分开来大大缩短内铁的观察时间；特别是还可使核浆对比度更清晰，更易于观察细胞内铁。另外，当所述固定剂中含有戊二醛时，染色效果更好，更利于使核浆对比度更清晰，更易于观察细胞内铁。附图说明图1-图2分别为实验例1-2实验结果图。图3-图6为实验例3实验结果图。图7-图10分别实验例4-7实验结果图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中涉及到的百分号“％”，是指质量百分比或体积百分比，固体的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”。实施例1一种铁染色试剂，包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇81％亚铁氰化钾10.8％浓盐酸10.8％沙黄0.01％甲醛9％纯化水余量；纯化水余量；磷酸盐缓冲液0.5％50％戊二醛5％proclin3000.2％纯化水余量；纯化水余量。沙黄染色液中的缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；磷酸二氢钾在沙黄染色液中的浓度为14.46g/l，磷酸氢二钠在沙黄染色液中的浓度为3.72g/l，所述缓冲液的ph为5.8。实施例2一种铁染色试剂，包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇90％亚铁氰化钾20％浓盐酸20％沙黄0.5％甲醛15％纯化水余量；纯化水余量；tris缓冲液10％50％戊二醛10％叠氮钠0.5％纯化水余量；纯化水余量。实施例3一种铁染色试剂，包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇65％亚铁氰化钾0.1％浓盐酸0.1％沙黄0.004％甲醛5％纯化水余量；纯化水余量；hepes缓冲液0.05％50％戊二醛1％苯酚0.01％纯化水余量；纯化水余量。实施例4一种铁染色试剂包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇89％亚铁氰化钾20％浓盐酸20％沙黄0.1％甲醛13％纯化水余量；纯化水余量；醋酸缓冲液6％50％戊二醛8％咪唑烷基脲(izu)0.4％纯化水余量；纯化水余量。实施例5一种铁染色试剂，包括固定剂、亚铁氰化钾溶液、盐酸溶液、沙黄染色液，组成如下：固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄染色液乙醇75％亚铁氰化钾2％浓盐酸2％沙黄0.006％甲醛6％纯化水余量；纯化水余量；缓冲液0.2％50％戊二醛2％防腐剂0.1％纯化水余量；纯化水余量。实验例1采用实施例1铁染色试剂进行骨髓细胞铁染色，方法如下：1)骨髓涂片空气中自然干燥后，滴加固定剂，布满涂片固定约60秒，纯化水冲洗，待干或用滤纸吸干；2)滴加或浸入工作液布满涂片37℃染色30分钟，纯化水充分冲洗，待干或用滤纸吸干；其中，工作液由亚铁氰化钾溶液和盐酸溶液为按体积比1:1配制而成；3)沙黄染色液室温复染2分钟，纯化水冲洗，干后镜检。实验结果见图1，箭头所指表示细胞内铁、细胞外铁，细胞结构清晰，细胞内铁更易识别。实验例2骨髓细胞铁染色方法，与实施例1的区别仅在于步骤3)采用中国专利公开号cn105136549a实施例2记载的核固红复染液；具体如下：1)样本滴加固定液5～8滴，盖满即可。10分钟后水洗待干、备用；2)将盐酸溶液缓缓加入亚铁氰化钾溶液内，混合后放入样本，37℃水浴箱染色60分钟，纯化水充分冲洗，待干；3)核固红复染1～2分钟，纯化水冲洗，干后镜检。实验结果见图2，箭头所指表示细胞内铁、细胞外铁，细胞较模糊，不易分清细胞类别，严重影响内铁的观察。以上实验结果表明，实验例1方法细胞结构清晰，易于将幼红细胞、单核细胞和粒细胞区分开来，更易于观察细胞内铁，大大缩短内铁的观察时间；而且与实验例2相比，核浆对比度更清晰。实验例3分别采用实施例2-5铁染色试剂进行骨髓细胞铁染色，方法与实验例1相同。实验结果见图3-6，图3着色最深、图4最浅，铁颗粒已不太好辨认；图5着色较深、图6较浅。结果表明，实施例2-5铁染色试剂的染色效果略差与实施例1，但核浆对比度较清晰，好于cn105136549a。实验例4骨髓细胞铁染色方法，与实施例1的区别仅在于步骤3)复染所用沙黄染色液中不含缓冲液。实验结果见图7，出现针状结晶，背景不清晰。实验例5骨髓细胞铁染色方法，与实施例1的区别仅在于步骤1)所用固定剂中不含戊二醛。实验结果见图8，细胞类型模糊，不易区分。实验例6采用如下铁染色试剂，按实验例1相同方法进行骨髓细胞铁染色，实验结果见图9，着色太浅，不易区分铁颗粒。固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄溶液乙醇＜65％亚铁氰化钾＜0.1％浓盐酸＜0.1％沙黄＜0.004％甲醛＜5％纯化水余量；纯化水余量；纯化水余量(50％)戊二醛＜1％//防腐剂＜0.01％纯化水余量；//缓冲液＜0.05％实验例7采用如下铁染色试剂，按实验例1相同方法进行骨髓细胞铁染色，实验结果见图10，着色太深，无法看清。固定剂亚铁氰化钾溶液盐酸溶液沙黄溶液乙醇＞90％亚铁氰化钾＞20％浓盐酸＞20％沙黄＞0.5％甲醛＞15％纯化水余量纯化水余量纯化水余量(50％)戊二醛＞10％//防腐剂＞0.5％纯化水余量；//缓冲液＞10％虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12