一种从猕猴桃果实中提取和鉴定多酚类物质的方法与流程

本发明属于植物多酚提取与含量检测技术领域，具体涉及一种从猕猴桃果实中提取和鉴定多酚类物质的方法。

背景技术：

猕猴桃果肉由于其口味香甜、富含多种营养物质、维生素c、多种矿物质、有机酸、氨基酸等，且具有抗氧化、降血脂、抑制动脉硬化、抗癌、抗衰老等作用，因此一直深受人们的喜爱，具有很高的食用和药用价值。猕猴桃果肉中还存在一种植物多酚类物质，这类物质包括原儿茶酸、酚酸、黄酮、花青素、槲皮素-3-芸香糖苷、槲皮素-3-鼠李糖、山奈素-3-鼠李糖和山奈素-3-芸香糖苷等，具有很强的生理活性，除此之外儿茶素类、白藜芦醇、原花色素及缩合单宁等也具有较强的抗氧化活性，可以抑制人体低密度脂蛋白的氧化，从而阻碍动脉粥样硬化的形成，防止由动脉硬化引起的冠心病的发生。植物多酚已在食品、日化、医药等领域得到广泛应用，具有良好的发展前景，而植物多酚的应用都关系到多酚含量的检测与鉴定。

在植物多酚的应用及相关领域，多酚鉴定与其含量或纯度测定是非常重要也是最常遇到的问题，由于植物多酚与黄酮类、蒽醌类、简单酚和木质素等在植物体内共存并且性质相近，其本身更是一类结构和性质都极为相似的混合物，并且多酚性质较为活泼，很易发生缩合或者降解，因此对其进行精确定量比较困难，特别是用分离提纯的方法对其进行定量测定是极其困难的。目前关于植物多酚含量的测定方法有数十种，但是获得一种快速、简便、准确地测定出各类样品中多酚含量的方法尚处于进一步研究开发中，必须根据实际情况选择不同的测定方法及相关测试条件，如何选择合适的测定法和标准物，以及样品的制备与多酚的提取检测条件，均会对测定结果有很大影响。

中国专利文献cn107621456a报道了一种猕猴桃多酚含量的测定方法，其包括浸提、测定吸光度数值、重复浸提、计算多酚当量、计算多酚含量等步骤，但其是针对总多酚含量进行测定，其提取率不高，检测结果不够精确，无法快速、准确测定出多种多酚的含量。期刊文献《从猕猴桃中提取多酚的研究》，周跃勇等，研究了提取猕猴桃中多酚的最佳工艺条件，得出采用30％的丙酮溶液按1:9的料液比，在35℃下提取30min，但其也仅仅是针对总酚含量进行测定，无法对猕猴桃果肉中数十种多酚含量进行检测，且其检测准确性不高，检测结果精密度不够。

现有的有关猕猴桃中多酚类物质的检测方法，要么提取效率不高，要么检测手段复杂，往往需要采用多种精密检测仪器进行联用的方法，才能较准确地测定出猕猴桃中各种多酚类物质的含量，对于猕猴桃多酚的提取鉴定方法，尚需提供一种准确度和精密度高，且检测手段操作简单、方便，能够快速精准检测出猕猴桃中植物多酚的方法。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种从猕猴桃果实中提取和鉴定酚类物质的方法，具备检测准确度和精密度高、多酚提取液稳定性好，能够同时检测出猕猴桃中十来种多酚类物质的含量。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种从猕猴桃果实中提取和鉴定多酚类物质的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)猕猴桃多酚类物质的提取：

取猕猴桃果肉，经研磨成猕猴桃粉，向其中加入提取液进行超声提取，所述提取液为70％甲醇溶液(v/v)内含2％蚁酸(v:v)的混合溶液，提取完毕后进行离心，取离心后的上清液用过滤膜过滤得到滤液；

(2)猕猴桃多酚类物质的定性和定量分析：

a.采用高效液相色谱仪测定滤液中的各种多酚类物质含量，色谱柱为：comatexc18(250mm*4.6mm，5μm)，流动相a为2％乙酸水溶液；流动相b为0.5％乙酸-乙腈水(1:1，v/v)；检测器：dad；柱温：30℃；进样量：20μl；流速：1ml/min；紫外检测波长：210nm；梯度洗脱程序如下：0-50min，流动相a的体积占比为90％-55％；50-60min，流动相a的体积占比为55％-0％；60-65min，流动相a的体积占比为0％-90％；分别在以下波长下进行检测：260nm、270nm、280nm、320nm、330nm、360nm，得到猕猴桃样品色谱图；

b.标准溶液的配制：取各多酚类物质标准品，分别用色谱甲醇溶解，配制成800mg/l的母液，再逐级稀释配成浓度为0.5、1、2、5、10、20、25、50、100mg/l的标准溶液，再配制成混合标准溶液，备用，取20μl标准溶液进样分析，得到标准溶液色谱图，再制作成标准曲线；

c.根据高效液相色谱仪检测出的样品色谱图与标准品色谱图进行对比鉴定，并通过标准曲线对提取到的多酚类物质进行定量分析。

采用本发明的上述方法对猕猴桃多酚进行提取和测定，提取后的各酚类物质稳定性好，多酚的回收率高，猕猴桃样品中各酚类物质的含量检测准确度和精密度高、重复性试验效果好，能够快速、准确检测出多种酚类物质的含量。

特别指出的是，本发明的提取液中含有70％体积的甲醇和2％体积的蚁酸，余量为28％体积的水，即提取液中甲醇:蚁酸:水(v:v:v)＝70:2:28。

进一步的，所述猕猴桃粉与提取液的质量体积比为2:3g/ml。

进一步的，所述超声提取的条件为：在30℃的恒温下超声提取30min。

进一步的，所述离心的操作为：在10000g下离心10min。

进一步的，所述过滤膜的孔径大小为0.45μm。

进一步的，所述酚类物质标准品包括：原儿茶酸、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、槲皮苷、香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸(样品纯度hlpc≥98％)的标准品。

进一步的，所述猕猴桃粉是将猕猴桃果肉洗净、去皮、切片后经真空冷冻干燥研磨成粉。

本发明的有益效果在于：本发明无需多种精密检测仪器的联用，仅仅采用高效液相色谱法即可准确检测出猕猴桃中多种酚类物质的含量，其检测的准确性好、精密度高，在多酚提取的过程中，回收率高、多酚提取液稳定性好，可定性及定量完成对猕猴桃中多种多酚类物质的快速测定。

附图说明

图1为酚类物质混合标准品在260nm波长下50min内的检测色谱图；

图2为酚类物质混合标准品在270nm波长下50min内的检测色谱图；

图3为酚类物质混合标准品在280nm波长下50min内的检测色谱图；

图4为酚类物质混合标准品在320nm波长下50min内的检测色谱图；

图5为酚类物质混合标准品在330nm波长下50min内的检测色谱图；

图6为酚类物质混合标准品在360nm波长下50min内的检测色谱图；

图7为猕猴桃多酚提取样品在260nm波长下50min内的检测色谱图；

图8为猕猴桃多酚提取样品在270nm波长下50min内的检测色谱图；

图9为猕猴桃多酚提取样品在280nm波长下50min内的检测色谱图；

图10为猕猴桃多酚提取样品在320nm波长下50min内的检测色谱图；

图11为猕猴桃多酚提取样品在330nm波长下50min内的检测色谱图；

图12为猕猴桃多酚提取样品在360nm波长下50min内的检测色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

本发明提供了一种猕猴桃果实中多酚类物质的提取和鉴定方法，按下列步骤进行。

1材料与方法

1.1提取方法：将猕猴桃果肉洗净、去皮、切片后经真空冷冻干燥研磨成粉，称取猕猴桃粉2g，用3ml提取液进行超声提取(按料液比2:3g/ml)，提取液是70％的甲醇(v/v)内含2％的蚁酸(v/v)，超声条件为在30℃下超声30min，以充分提取，将粗提液于10000g离心10min，将离心后的上清液用0.45μm的过滤膜过滤后上机分析。

1.2仪器与试剂：

1.2.1仪器：高效液相色谱仪(美国agilent公司1260系列)，配有dad紫外检测器；色谱柱：comatexc18(250mm*4.6mm，5μm)；5ml一次性注射器；0.45μm针式水性过滤头；fb15060超声波清洗器；sorvallst16r高速冷冻离心机，thermofisher公司；bsa224s电子天平，赛多利斯公司(北京)；milli-qintegral10超纯水仪，millipore公司。

1.2.2试剂：原儿茶酸、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、槲皮苷、香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸(纯度≥98％)，均购自北京索莱宝科技有限公司；甲醇、蚁酸为色谱纯；水为millipore超纯水。

1.2.3检测条件：所使用色谱柱为comatexc18色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；流动相：a为2％乙酸水溶液(v/v)；b为0.5％乙酸-乙腈水(乙酸:乙腈＝1:1，v/v)；检测器：dad；柱温：30℃；进样量：20μl；流速：1ml/min；紫外检测波长：210nm。梯度洗脱程序如下：0-50min，流动相a为90％-55％；50-60min，流动相a为55％-0％；60-65min，流动相a为0％-90％(上述流动相a均为体积百分占比)。检测波长分别为：260nm、270nm、280nm、320nm、330nm、360nm。

1.2.4标准溶液配制：分别称取9种酚类物质标准品各20mg，用色谱甲醇溶解，定容至25ml，均配制成800mg/l的母液。再逐级稀释配成浓度为0.5、1、2、5、10、20、25、50、100mg/l的标准溶液，再配制成混合标准溶液，备用。取20μl混合标准品进行高效液相分析，得到混合标准品色谱图，再制作成标准曲线。

9种酚类物质标准品信息如下表1。

表1

1.3数据分析

采用软件excel2010计算试验数据并作图。所有样品均设3个重复，测定结果以平均值(means)±标准误(standarddeviation)表示。用spss20.0软件进行显著性分析，以p＜0.05为显著水平。

2结果与分析

2.1酚类物质混合标准品色谱图与猕猴桃多酚提取样品色谱图

酚类物质混合标准品在各波长下的检测色谱图如图1-6所示。

猕猴桃多酚提取样品在各波长下的检测色谱图如图7-12所示。

其中，图1-6分别为酚类物质混合标准品在260nm、270nm、280nm、320nm、330nm、360nm波长下50min内的色谱图。根据保留时间，峰依次为1、原儿茶酸；2、对轻基苯甲酸；3、绿原酸；4、香草酸；5、咖啡酸；6、表儿茶素；7、对香豆酸；8、阿魏酸；9、槲皮苷。图7-12分别为猕猴桃多酚提取样品在260nm、270nm、280nm、320nm、330nm、360nm波长下50min内的色谱图，其中对羟基苯甲酸和香草酸在猕猴桃果实样品中未检测到。

2.2hplc方法的考察

2.2.1线性关系与检出限

将酚类物质混合标准品配制成0.5、1、2、5、10、20、25、50、100mg/l浓度梯度进行测定，根据色谱图计算回归方程、相关系数、线性范围及检出限。如表2所示，9种酚类物质标准品相应的线性范围内的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数均在0.9994-0.9999之间，且检出限(s/n＝3)均小于0.03μg*g^-1，满足酚类物质的检测分析。

表2

2.2.2精密度试验

为了验证方法的精密度，将50mg/l混合标准样品按1.2.3色谱条件重复进样6次，根据各标准物质的积分峰面积计算其相对标准偏差(rsd)。原儿茶酸、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、槲皮苷、香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸9种酚类物质的rsd分别为0.41％、0.39％、0.76％、0.93％、0.53％、0.71％、1.30％、1.12％、0.29％。结果表明，9种酚类物质的rsd介于0.29％-1.30％，说明该方法具有较高的精密度。

2.2.3重复性试验

称取同一份猕猴桃样品6份，按1.1样品前处理方法将样品做同样处理，在1.2.3色谱条件下进行测定，通过计算各成分的积分峰面积的rsd值检验方法的重复性。原儿茶酸、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、槲皮苷、香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸9种酚类物质的rsd分别为2.59％、2.46％、3.22％、3.33％、2.17％、3.02％、3.24％、3.31％、1.93％。结果显示，9种酚类物质的rsd值均低于3.33％，表明该方法重复性良好。

2.2.4稳定性试验

制备同一猕猴桃多酚提取样品溶液，在相同色谱条件下，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h进样，测定样品中酚类物质含量。样品中原儿茶酸、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、槲皮苷、香草酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸9种酚类物质保留时间和含量的rsd值均小于4.79％，表明供试品溶液在48h内稳定，说明该方法稳定性良好。

2.2.5回收率试验

称取已知含量的样品6份，根据样品中各酚类物质含量确定各标样加标量，按照上述样品前处理方法和色谱条件进行回收率试验，验证该方法的准确性。试验结果如表3，从表3可以看出，加标回收率在92.20％-115.17％之间，rsd值在1.03％-3.02％之间，说明该实验方法准确度较高，能用于猕猴桃中酚类物质的检测分析。

表3酚类物质的回收率试验结果