本发明涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种肝素类药物生物效价的测定方法。
背景技术：
血液凝固由一系列连锁的复杂化学反应构成，这一系列连锁反应组成了凝血级联系统。目前公认的凝血因子，有12种，国际上统一按发现的顺序标记为罗马数字i、ii、iii、iv、v、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii。每一个连锁反应都是蛋白水解反应，会将一个酶原转化成相应的丝氨酸蛋白酶并最终生成凝血酶(fiia，其中表示a表示凝血因子的活性形式)。抗凝剂大都是凝血级联反应中关键酶的抑制剂，在临床上用于预防和治疗血栓栓塞性疾病。
目前应用最为广泛的抗凝血剂是肝素类药物，包括普通肝素(ufh)和低分子量肝素(lmwh)。肝素类药物的抗凝血作用是通过抗凝血酶iii(atiii)来实现的。肝素类药物和atiii的结合加速了对凝血级联反应中凝血因子ea(e＝ii、vii、ix、x、xi、xii)等多种关键蛋白酶的抑制，其中凝血因子iia(fiia)和凝血因子xa(fxa)对其抑制作用最敏感。高负电荷密度的肝素类药物能与atiii上带正电的赖氨酸结合，使atiii的分子结构发生变化，暴露出活性部位的精氨酸，从而大大增加了atiii与凝血因子中丝氨酸接触的概率，可使atiii的抗凝血活性增强1000倍左右。
生物效价的测定是肝素类药物质量控制的1个重要生物学指标，能反映肝素类药物的抗凝活性。传统的肝素类药物生物效价测定包括：凝血法(活化部分凝血活酶时间(aptt)和活化凝血时间(act))、免疫印迹法、显色法(紫外和荧光法测定)。凝血法易受实验室、试剂、仪器设备等条件变化的影响，重现性差，并且灵敏度低，通常只能得到半定量的结果；免疫印迹法是基于与几种独特的抗肝素抗体的反应建立的方法，应用受到限制。对于显色法：现行中国药典(chp2015)使用的紫外分光光度法所需要的试剂量较大且价格昂贵，测试成本较高，且会受到样品基质的干扰。荧光法具有特异性强，灵敏度高的优势，但荧光底物的背景荧光会对检测产生较明显的干扰。另外，荧光法测定使用人血浆作为酶源，以此建立酶的反应体系，容易受到血浆个体差异的干扰，且人血浆的提供和保存也有苛刻的条件限制。
鉴于此，本发明提供一种新的肝素类药物生物效价的测定方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种肝素类药物生物效价的测定方法，其通过构建体外抗凝血因子的效价体系，利用高效液相色谱-质谱联用分析系统进行定量测定，反应体系微小、灵敏度高、特异性强，且能避免复杂生物样品中的物质对测定结果的干扰。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种肝素类药物生物效价的测定方法，其包括：
将凝血因子与待测药物、抗凝血酶iii以及凝血因子所对应的特异性底物混合，构建体外抗凝血因子的效价体系；
通过高效液相色谱-质谱联用分析法测定效价体系中反应产物的含量；
以已知效价的肝素类药物为标准品，根据量反应平行线法计算待测药物的生物效价。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
本发明提供的这种肝素类药物生物效价的测定方法，通过构建体外抗凝血因子的效价体系，避免直接使用生物样品进行测定，且通过利用高效液相色谱-质谱联用分析法测定效价体系中反应产物的含量，以此来衡量效价体系中的凝血因子的反应活性；再通过与标准品进行比对，即可得到待测药物的生物效价。
体外抗凝血因子的效价体系的原理为：待测药物，例如普通肝素(ufh)，与抗凝血酶(atiii)、过量的凝血因子混合后，会形成ufh-atiii-凝血因子三元复合物，形成复合物的凝血因子不具有凝血活性也无法催化特异性底物转化成产物的反应，即抑制了该部分凝血因子的反应活性，此时只有体系中未形成复合物的凝血因子才可继续催化特异性底物转化成产物，从而导致产物的生成量减少。因此，通过测定产物的含量，便可反映出待测药物的抗凝作用大小，即得到待测药物的生物效价。相比于现有技术，这种肝素类药物生物效价的测定方法，一方面可用商品化的酶代替血浆，避免了血浆特异性差异的干扰，也省去了血浆购买、保存等繁琐的工作；另一方面，利用商品化的酶和商品化的底物建立的反应体系，使该方法更利于重复和推广，且反应体系微小，成本低。另外，利用高效液相色谱-质谱联用分析法对反应产物进行测定，能有效降低干扰，使得测定的灵敏度高和重现性强，且可以连续分析大批量的待测样品，具有高通量的特点。因此，该测定方法可以有效降低干扰，特异性强，且操作简便、节约时间，能够有效的提高测定效率。该方法不仅可以检验药厂生产的肝素类药物是否合格，还可以用于临床用药中肝素类药物的用药剂量以及体内凝血水平的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为在线样品前处理系统搭建的示意图；
图2为本发明中肝素类药物生物效价测定方法的原理图；
图3为实施例1中产物对硝基苯胺与内标的峰面积比值(i/i0)对pna浓度的标准曲线；
图4为实施例1中产物7-氨基-4-甲基香豆素与内标的峰面积比值(i/i0)对7-氨基-4-甲基香豆素浓度的标准曲线；
图5为实施例1中产物苯甲酰精氨酸与内标的峰面积比值(i/i0)对苯甲酰精氨酸浓度的标准曲线；
图6为实施例1中产物4-硝基苯酚与内标的峰面积比值(i/i0)对4-硝基苯酚浓度的标准曲线；
图7为实施例1中待测定肝素钠生物效价抗iia的结果；
图8为实施例1中待测定肝素钠生物效价中抗ixa的结果；
图9为实施例1中待测定肝素钠生物效价中抗xa的结果
图10为实施例1中待测定肝素钠生物效价中抗xia的结果；
图11为实施例1中待测定肝素钠生物效价中抗xiia的结果；
图12为实施例1中待测定肝素钠生物效价中抗viia的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本实施方式提供一种肝素类药物生物效价的测定方法，其包括以下步骤：
步骤s1:将凝血因子与待测药物、抗凝血酶iii以及所述凝血因子所对应的特异性底物混合，构建体外抗凝血因子的效价体系。
其中，凝血因子包括凝血因子iia、凝血因子viia、凝血因子ixa、凝血因子xa、凝血因子xia和凝血因子xiia中的任意一个。
测定上述凝血因子的抗凝活性，所需的底物以及生成的反应产物，如表1所示：
表1.抗凝血因子效价体系的建立
进一步地，体外抗凝血因子的所述效价体系的构建方法包括：
先将所述待测药物与抗凝血酶iii混合，再加入所述凝血因子和所述特异性底物，混合反应3-7分钟后，加入淬灭剂，制得供试品。
优选地，淬灭剂为有机溶剂，例如甲醇、乙腈等。
供试品的制备包括：将加入淬灭剂后的反应液离心，取上清液即为供试品。
进一步地，为了方便后续的定量测定，将上清液与等体积的内标混合，得到待测的供试品。
步骤s2:通过高效液相色谱-质谱联用分析法测定效价体系中反应产物的含量；
利用底物在相应凝血因子作用下分别产生相应的产物对硝基苯胺(pna)、7-氨基-4-甲基香豆素、苯甲酰精氨酸和4-硝基苯酚的原理，利用产物对硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素、苯甲酰精氨酸和4-硝基苯酚作为定量标准。
进一步地，通过内标法测定反应产物的含量。
该步骤采用普通的高效液相色谱-质谱联用分析法(hplc-ms)进行测定。在测定过程中，发明人为了进一步的降低效价体系中酶、蛋白等物质对分析结果的干扰，自行研发一种在hplc-ms分析过程中能在线进行样品前处理的装置及方法，以此实现待测样品的在线处理。
这种hplc-ms分析包括高效在线样品前处理系统和高效液相色谱-质谱联用系统，其结构如图1所示，在线样品前处理系统包括依次连接的第一泵体(即泵a)、自动进样器、多通阀、前处理色谱柱、多通阀和废液收集器；高效液相色谱-质谱联用系统通过所述多通阀与所述前处理色谱柱连接或断开。
在检测过程中，在线样品前处理系统，作为第一维的样品预处理系统，执行样品前处理命令，将反应体系进行净化处理，使极性较小的反应产物保留在前处理色谱柱上；与此同时，液相溶液通过第二泵体(即泵b)和多通阀与分析色谱柱相连通，对分析色谱柱进行平衡处理。随后，切换多通阀，使液相溶液、泵b、多通阀、前处理色谱柱、多通阀、分析色谱柱和质谱检测器依次连接，作为第二维样品洗脱与分析系统，执行洗脱与分析命令。在该过程中，极性较小的反应产物被洗脱到分析柱上后进行分析处理；此时，液相溶液、泵a、自动进样系统和废液收集系统连接，为下一次进样准备；待第二维分析完成后，多通阀重新切换至初始连接位置，则重新进入第一维采样后样品前处理状态，依此循环至样品所需分析部分分析结束。
进一步的，多通阀的接口数量大于6且为偶数个，例如多通阀可以是六通阀、八通阀、十通阀等。
以二位十通阀为例，如图1所示，在样品前处理阶段，液相溶液、泵a、自动进样系统、十通阀(9→10)、前处理色谱柱、十通阀(7→8)和废液收集器依次连通，作为样品前处理通道；与此同时，液相溶液、泵b、十通阀(1→2)、分析色谱柱、十通阀(5→6→3→4)和质谱检测器连通，作为分析色谱柱平衡通道。
在样品洗脱与分析阶段，液相溶液、泵b、十通阀(1→10)、样品前处理柱、十通阀(7→6→3→2)、分析色谱柱、十通阀(5→4)和质谱检测器连通，作为样品洗脱和分析通道；此时，液相溶液、泵a、十通阀(9→8)和废液收集器依次连通。
进一步地，利用上述hplc-ms分析法检测反应产物的方法包括：
a.利用自动进样器进样，采用有机溶剂-水体系洗脱所述前处理色谱柱，洗脱液进入所述废液收集器；
优选地，该在线样品前处理系统中，所述前处理色谱柱为反相色谱柱，流动相为甲醇-水，流速为0.3-0.8ml·min-1；进样量为1-20μl；冲洗时间为0.5-1.5分钟。
b.切换所述多通阀，使所述液相色谱的第二泵体与所述前处理色谱柱连通，以甲醇-水溶剂体系洗脱分析色谱柱，洗脱液进入质谱检测器进行分析。
优选地，该hplc-ms中液相色谱的条件包括：采用反向色谱柱为分析色谱柱，流动相的流速为0.1-0.5ml·min-1；分析时间为3-10分钟。
优选地，该hplc-ms中质谱的条件包括：采用电喷雾质谱正离子模式，干燥气温度为250-350℃，雾化器电压为20-60psi，毛细管电压为3000-4500v，毛细管出口电压为50-150v，干燥气流速为4-12l·min-1。
c.在分析结束后，切换多通阀，对前处理色谱柱和分析色谱柱进行平衡处理，方便下一次进样分析。
步骤s3:以已知效价的肝素类药物为标准品，根据量反应平行线法计算待测药物的生物效价。
进一步地，待测药物的生物效价pt按照下式计算：
pt＝ps×(st/ss)
式中，ps为肝素类药物标准品的生物效价；st和ss分别为待测药物的斜率和标准品的斜率。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种肝素钠生物效价的测定方法，其检测原理如图2所示，其包括：
一、建立体外抗凝血因子(iia、viia、ixa、xa、xia、xiia)效价反应体系：
1.溶液配制：
配置三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液(ph＝8.4)：50mmtris，7.5mmedta，175mmnacl，0.1％peg6000，加800ml水，盐酸调节ph＝8.4，用水稀释成1000ml作为缓冲溶液；精密称取凝血因子(iia、ixa、xa、xia、xiia、viia)粉末适量，使用缓冲液分别将其稀释成0.05iu·ml-1、0.25iu·ml-1、0.015iu·ml-1、0.25iu·ml-1、0.5iu·ml-1和0.25iu·ml-1；精密称取底物粉末适量，用蒸馏水将s2238、d-leu-phg-arg-4-nitroanilide(lpan)、s2765和z-gly-gly-arg-7-amido-4-methylcoumarin(ggam)、benzoylarginineethylester(bae)和benzyloxycarbonyl-arg-p-nitrobenzylester(ban)分别配制成5μm、50μm、15μm、50μm、100μm和50μm的溶液；精密称取atiii粉末适量，使用缓冲液稀释成0.00015iu·ml-1；精密称取肝素钠粉末适量，用蒸馏水将肝素标准品稀释成0.00020iu·ml-1、0.0001iu·ml-1、0.00005iu·ml-1、0.000025iu·ml-1一系列浓度。
2.效价体系构建：
按照表1，精密量取0.0002iu·ml-1、0.0001iu·ml-1、0.00005iu·ml-1、0.000025iu·ml-1四个浓度肝素钠各50μl，分别加入50μl0.00015iu·ml-1atiii溶液，混匀后按表1所示加入相同体积的凝血因子及其相对应的特异性底物，混合后，反应5分钟，加入100μl0.2％乙酸的乙腈溶液淬灭。12000转高速离心10分钟后取100μl的上清液和100μl的内标混合进行在线样品前处理及高效液相色谱-质谱联用分析。
二、建立基于高效在线样品前处理hplc-ms法分析效价体系中的反应产物：
1.利用高效在线样品前处理hplc-ms分析方法的建立
如图1所示搭建高效在线样品前处理hplc-ms分析系统，当切换阀1-2位连通时，样品前处理通道接通，执行样品前处理命令，将反应体系进行净化处理，极性较小的反应产物保留在前处理色谱柱上；此时流动相与分析通道也连通，对分析色谱柱进行平衡处理。待前处理完成后，自动切换多通阀，使多通阀1-10位连通，此时样品前处理柱与分析通道接通，执行样品洗脱与分析命令，极性较小的反应产物被洗脱到分析柱上后进行hplc-ms分析处理。
该检测过程包括：
a.上样：定量吸取效价体系反应液2μl；
b.样品在线处理：样品前处理柱采用普通c18(或c8)色谱柱；采用甲醇:0.05％甲酸水溶液(v:v＝1:9)为流动相；流速为0.6ml·min-1，冲洗1分钟，洗脱液进废液收集器；
c.洗脱与分析：分析色谱柱采用普通c18柱；采用甲醇:0.01％甲酸水溶液(v:v＝6:4)为流动相；流速为0.4ml·min-1；洗脱3分钟，洗脱液进质谱检测器。
在该步骤中，质谱条件为电喷雾质谱(esi-ms)正离子模式；毛细管出口电压：90v；干燥气温度：350℃；雾化器电压：15psi；毛细管电压：4000v；定量方式为多重离子监测模式(mrm)，产物定量离子对如表2所示：
表2.产物定量离子对
d.再平衡：在c步骤结束时，切换多通阀，对前处理色谱柱和分析色谱柱进行1分钟的平衡处理。
该分析过程总共耗时5分钟，即前处理(1分钟)+洗脱与分析(3分钟)+再平衡(1分钟)。
2.采用内标法建立对凝血因子催化的酶反应产物的定量方法：
准确称取对硝基苯胺(pna)、7-氨基-4-甲基香豆素、苯甲酰精氨酸和4-硝基苯酚粉末适量，分别定容于250ml容量瓶中，保存于4℃冰箱中。使用时，用50％乙腈水(v:v)溶液分别配置成0.05μg·l-1到2000μg·l-1系列浓度的产物标准溶液，采用内标法定量，内标分别为n-甲基-4-硝基苯胺、n-甲基-7-氨基-4-甲基香豆素、苯甲酰精氨酸(arg-n15)和4-硝基苯甲醚，进行在线样品前处理高效液相色谱-质谱联用分析。
以产物与内标质谱响应面积比i/i0为y轴和产物浓度为x轴，建立标准曲线：
产物对硝基苯胺的标准曲线如图3所示，线性回归方程为y＝0.2797x±0.003311(r2＝0.999)，定量范围为0.05μg·l-1到1000μg·l-1；
产物7-氨基-4-甲基香豆素的标准曲线如图4所示，线性回归方程为y＝0.1309x±0.01878(r2＝0.999)，定量范围为0.1μg·l-1到1000μg·l-1；
产物苯甲酰精氨酸的标准曲线如图5所示，线性回归方程为y＝0.1167x±0.04046(r2＝0.999)，定量范围为0.25μg·l-1到1200μg·l-1；
产物4-硝基苯酚的标准曲线如图6所示，线性回归方程为y＝2.018x±1.261(r2＝0.999)，定量范围为0.05μg·l-1到1500μg·l-1。
上述标准曲线线性良好，因此，采用在线样品前处理高效液相色谱-质谱联用分析的结果是准确可靠的。
3.方法学验证：
针对建立的产物定量方法进行方法验证，考察定量限、检测限、精密度、准确度和基质效应，应符合2015版中国药典四部《分析方法验证指导原则》要求。
(1)定量限和检测限
对硝基苯胺的检测限：0.01μg·l-1(snr＝3.50±1.53；n＝6)；定量下限：0.05μg·l-1(snr＝11.05±1.26；n＝6)。7-氨基-4-甲基香豆素的检测限：0.05μg·l-1(snr＝3.65±1.31；n＝6)；定量下限：0.1μg·l-1(snr＝10.75±1.42；n＝6)。苯甲酰精氨酸的检测限：0.1μg·l-1(snr＝3.23±1.12；n＝6)；定量下限：0.25μg·l-1(snr＝10.45±1.56；n＝6)。4-硝基苯酚的检测限：0.01μg·l-1(snr＝3.36±1.51；n＝6)；定量下限：0.05μg·l-1(snr＝11.40±1.31；n＝6)。由该结果可以看出该方法检测灵敏度高。
(2)精密度和准确度考察
配置低浓度(5μg·l-1)，中间浓度(50μg·l-1)，高浓度(500μg·l-1)三个浓度水平的产物溶液作为质控样品，进行准确度和精密度的考察。准确度都在85％-115％之间，精密度的相对偏差都在±15％之内，说明该方法精密度和准确度好。
(3)基质效应的考察
分别用缓冲液和酶溶液配置低浓度(5μg·l-1)，中间浓度(50μg·l-1)，高浓度(500μg·l-1)三个浓度水平的产物溶液并与相应的内标混匀，分析基质(酶溶液)中产物检测的回收率和精密度。回收率都在85％-115％之间，说明该方法不受基质干扰。
4.建立以肝素药物为代表的生物效价测定方法
使用的已知效价的肝素钠做标准药物，对一批肝素钠供试品分别就抗iia活性、抗ixa活性、抗xa活性、抗xia活性、抗xiia活性和抗viia活性进行生物效价测定，以生物效价为评价标准，其结果应为标示值的90-110％，抗xa因子效价与抗iia因子的效价比应符合规定。
肝素钠标准品，按照1:0.5的剂间比配制一组梯度效价浓度的溶液，浓度分别为0.0002iu·ml-1、0.0001iu·ml-1、0.00005iu·ml-1、0.000025iu·ml-1，分别标记为s1、s2、s3、s4。对于供试品肝素，首先对效价进行预估，再根据预估效价配制出与标准品效价浓度相同梯度溶液，分别标记为t1、t2、t3、t4。
测试时，按照上述优化好的方法，按照以下顺序：s1、s2、s3、s4、t1、t2、t3、t4、t1、t2、t3、t4、s1、s2、s3、s4，每个样品3次重复，测试48次。取100μl的上清液和100μl的内标混合进行在线样品前处理及高效液相色谱-质谱联用分析。记录下每次反应中产物及其对应内标的峰面积比值。以峰面积比值(i/i0)为纵坐标，标准品和供试品效价浓度的对数值为横坐标分别做线性回归曲线。按照生物检定统计方法计算效价和实验误差，平均可信限率(fl％)不得大于15％，结果表3所示：
表3.肝素钠供试品生物效价测定结果
由表3可知，本方法测得的结果与标示值结果接近，fl小于15％,可靠性检测全部通过。由此说明本实施例建立的利用在线样品前处理及hplc-ms分析测定肝素类药物生物效价的方法准确，灵敏，可以作为肝素类药物生产中质量控制的方法。
实施例2～10
分别使用如表4所示的药物磺达肝素、达肝素、阿地肝素、那屈肝素、舍托肝素、帕肝素、瑞维肝素、亭扎肝素和依诺肝素代替实施例1中的肝素钠，根据表5所示选择合适的底物建立抗凝血因子ea(e＝ii、vii、ix、x、xi、xii)效价体系，建立对应产物的在线样品前处理高效液相色谱-质谱联用分析方法。使用标准品作为参考标准，测量不同肝素类药物针对不同凝血因子的生物效价。其结果与实验1结果一致，其结果为标示值的90-110％，抗xa因子效价与抗iia因子的效价比符合规定。
表4.肝素类药物
表5.抗凝血因子ea效价体系中可用的酶和底物
综上所述，本发明利用高效在线样品前处理hplc-ms分析系统测定了肝素类药物的生物效价，并对其生物效价与标准品进行了对比，结果符合要求。从测定结果可以看出，跟现有方法相比，该方法灵敏度高，准确度好，稳定性强，且大大节约酶和底物的用量。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。