本发明属于烟草成分理化检测
技术领域：
，涉及一种尿液中尼古丁及可替宁的分析方法。
背景技术：
：随着人类对健康的呼声越来越高，“吸烟与健康”问题已成了社会群众和世界卫生组织关注的焦点，因此弄清楚卷烟烟气中的成分及其含量对于有效降低吸烟群体的健康风险，生产低危害或低风险卷烟产品意义重大。另一方面，虽然全球控烟行动正在紧锣密鼓地进行中，但目前吸烟人口数量依然庞大，很难在短期内完全消失。此时，唯有对卷烟的风险进行客观评价，并在此基础上大力发展减害及风险评价技术，降低吸烟人群健康风险。尼古丁及可替宁是最常用也是最重要的烟气暴露标志物。准确分析吸烟者体液中的尼古丁及可替宁含量对完善卷烟风险评估技术极为重要。吸烟者尿中的尼古丁及可替宁相较于血液或唾液来说，半衰期更长，且取样方便，因此，尿液成为了卷烟生物标志物研究中主要关注的生物基质。目前，尿液前处理一般利用市售固相富集(SPE)小柱进行，但上样及洗脱步骤操作较繁琐，自动化程度不高，过程耗时较长，不利于大规模样品批量分析。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种尿液中尼古丁及可替宁的分析方法，采用改性介孔材料作为吸附-脱附填料，结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)，通过富集-热脱附-进样-分析为一体的全自动在线样品分析联用系统，无须使用溶剂洗脱，实现了吸烟者尿液中尼古丁及可替宁全自动在线分析，为大批量尿液样品快速测定提供了一种全新途径。为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种尿液中尼古丁及可替宁的分析方法，包括以下步骤：1)取含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液，注入富集装置中在辅助气吹扫下进行吸附富集，在载气吹扫下进行热脱附后，获得含有内标物的标准样品；2)取尿液样品，注入富集装置中在辅助气吹扫下进行吸附富集，在载气吹扫下进行热脱附后，获得待测样品；3)分别将步骤1)中含有内标物的标准样品、步骤2)中待测样品，在载气吹扫下进入GC-MS进行检测，根据获得的质谱图比较保留时间进行定性，确定待测样品中的尼古丁和可替宁成分，并采用内标法计算待测样品中的尼古丁和可替宁成分的含量。优选地，步骤1)中，所述富集装置包括有恒温杯、富集填充柱、切换阀，所述富集填充柱、切换阀置于恒温杯内，所述富集填充柱的进料口和出料口分别与切换阀之间经管路连通，所述切换阀还经管路分别外接有辅助气及载气。更优选地，所述切换阀为六通阀，所述六通阀按逆时针方向依次设有第一接口、第二接口、第三接口、第四接口、第五接口、第六接口。更优选地，所述富集填充柱的出料口与切换阀之间的管路上设有控制阀。进一步优选地，所述控制阀为三通截止阀。所述三通截止阀为三通球阀。更优选地，所述恒温杯为具有程序升温功能的恒温加热杯。所述恒温杯可以调控富集装置内的温度。更优选地，所述富集填充柱内填充有介孔材料，所述富集填充柱两端装填有玻璃纤维。进一步优选地，所述介孔材料的化学成分选自纯SiO2或纯碳中的一种或两种混合。进一步优选地，所述介孔材料为介孔小球，所述介孔小球的孔径为2～5nm。进一步优选地，所述介孔材料要进行预处理，所述介孔材料的预处理条件为在650-750℃下的100％水蒸气中焙烧5-7h。最优选地，所述介孔材料的预处理条件为在700℃下的100％水蒸气中焙烧6h。进一步优选地，所述玻璃纤维为去活化玻璃纤维。所述去活化玻璃纤维为市售的去活化玻璃纤维，可从生产气相色谱仪厂家购买获得。进一步优选地，所述玻璃纤维在富集填充柱内一端的装填高度为1～10mm。最优选地，所述玻璃纤维在富集填充柱内一端的装填高度为5mm。更优选地，所述富集填充柱为不锈钢管。更优选地，所述富集填充柱的外径为5-7mm，内径为3-5mm。进一步优选地，所述富集填充柱的外径为6mm，内径为4mm。优选地，步骤1)中，所述富集装置在辅助气吹扫下进行吸附富集的温度为100-300℃，即此时恒温杯的设定温度为100-300℃。更优选地，所述富集装置在辅助气吹扫下进行吸附富集时的温度为250℃，即此时恒温杯的设定温度为250℃。优选地，步骤1)中，所述吸附富集的时间为1-5min。更优选地，所述吸附富集的时间为2min。优选地，步骤1)中，所述辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-3min。更优选地，所述辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为2min。优选地，步骤1)或2)中，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液或尿液样品从富集装置中的富集填充柱的进料口注入。优选地，步骤1)中，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为5-15：0.05-0.15。更优选地，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为10：0.1。优选地，步骤1)中，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液中，所述内标物为正十六烷，所述溶剂为甲醇。优选地，步骤1)中，所述尼古丁的CAS号为54-11-5。所述可替宁的CAS号为486-56-6。所述正十六烷的CAS号为544-76-3。优选地，步骤1)中，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液为，含有同一浓度的内标物、尼古丁、可替宁的混合甲醇溶液或者含有同一浓度的内标物以及一系列不同浓度的尼古丁、可替宁的混合甲醇溶液。更优选地，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液为，含有同一浓度的内标物以及一系列不同浓度的尼古丁、可替宁的混合甲醇溶液。优选地，步骤1)中，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液中，所述尼古丁的浓度为1-2000ng/mL，所述可替宁的浓度为1-2000ng/mL，所述内标物的浓度为90-110ng/mL。更优选地，所述内标物的浓度为100ng/mL。优选地，步骤1)中，所述含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液的制备，包括以下步骤：A)取正十六烷标准品，加入甲醇溶解并定容，配制成内标溶液；B)取尼古丁标准品，加入步骤A)中的内标溶液溶解并定容，配制尼古丁标准储备溶液；C)取可替宁标准品，加入步骤A)中的内标溶液溶解并定容，配制可替宁标准储备溶液；D)再取步骤B)中的尼古丁标准储备溶液，步骤C)中的可替宁标准储备溶液，加入甲醇溶解并定容，配制为标准工作溶液。更优选地，步骤B)中，所述尼古丁标准储备溶液的浓度为10-100μg/mL。进一步优选地，所述尼古丁标准储备溶液的浓度为10μg/mL。更优选地，步骤C)中，所述可替宁标准储备溶液的浓度为10-100μg/mL。进一步优选地，所述可替宁标准储备溶液的浓度为10μg/mL。优选地，步骤2)中，所述尿液样品注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为5-15：0.05-0.15。更优选地，所述尿液样品注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为10：0.1。优选地，步骤1)或3)中，所述富集装置在载气吹扫下进行热脱附或进入GC-MS进行检测时的温度为240-260℃，即此时恒温杯的设定温度为240-260℃。更优选地，所述富集装置在载气吹扫下进行热脱附或进入GC-MS进行检测时的温度为250℃，即此时恒温杯的设定温度为250℃。优选地，步骤1)或3)中，所述载气吹扫条件为：载气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-10min。更优选地，所述载气吹扫条件为：载气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为5min。优选地，步骤3)中，所述含有内标物的标准样品或待测样品在载气吹扫下进入GC-MS进行检测后，所述富集装置的温度与气相色谱仪中升温程序的初始温度相同，即此时恒温杯的设定温度与气相色谱仪中升温程序的初始温度相同。更优选地，所述含有内标物的标准样品或待测样品在载气吹扫下进入GC-MS进行检测后，所述富集装置的温度为140℃，即此时恒温杯的设定温度为140℃。优选地，步骤3)中，所述GC-MS检测条件为：气相色谱条件为：色谱柱：HP-5ms毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μmdf)；进样口温度：250℃；进样量：10μL；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：1.0ml/min，恒流模式；分流模式：不分流；接口温度：250℃；升温程序：初始温度140℃保持1min，以5℃/min的速率升至160℃保持1min，再以30℃/min的速率升至230℃，保持1min。质谱条件为：离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离方式：EI源；电离能量：70eV；扫描方式：选择离子监测(SIM)；定量离子：尼古丁为m/z＝84，可替宁为m/z＝98。优选地，步骤3)中，所述内标法是指：分别将步骤2)所述含有内标物的标准样品中同一浓度的内标物以及一系列不同浓度的尼古丁、可替宁采用GC-MS进样分析，分别获得含有内标物的标准样品中尼古丁、可替宁含量与峰面积的线性关系，以及内标物与峰面积的对应关系，以内标物与峰面积的对应含量关系为定量基准，分别以尼古丁或可替宁色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测样品采用GC-MS检测，将获得的待测样品中尼古丁、可替宁的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可计算得到相应尼古丁、可替宁成分的含量。本发明第二方面提供一种尿液中尼古丁及可替宁的在线分析系统，包括依次经管路连接的富集装置、气相色谱仪、质谱仪，所述富集装置包括有恒温杯、富集填充柱、切换阀，所述富集填充柱、切换阀置于恒温杯内，所述富集填充柱的进料口和出料口分别与切换阀之间经管路连通，所述切换阀还经管路分别外接有辅助气及载气。优选地，所述切换阀为六通阀，所述六通阀按逆时针方向依次设有第一接口、第二接口、第三接口、第四接口、第五接口、第六接口。优选地，所述富集填充柱的出料口与切换阀之间的管路上设有控制阀。优选地，所述富集填充柱内填充有介孔材料，所述富集填充柱两端装填有玻璃纤维。更优选地，所述控制阀为三通截止阀。所述三通截止阀为三通球阀。优选地，所述恒温杯为带有程序升温控制器的恒温加热杯。所述恒温杯可以调控富集装置内的温度。本发明第三方面提供一种尿液中尼古丁及可替宁的在线分析系统的使用方法，包括以下步骤：A)在所述富集装置中，接通辅助气，通过切换阀切换，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空；B)将尿液样品或含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入进料口，通过切换阀切换，所述辅助气承载尿液样品或含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气排空；C)接通载气，通过切换阀切换，所述辅助气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路通过控制阀流过富集填充柱后，承载所需分析成分流入气相色谱仪及质谱仪进行分析；D)通过切换阀切换，所述载气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路直接流入至气相色谱仪及质谱仪，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空。优选地，步骤B)中，所述辅助气经管路依次通过切换阀的第二接口、第一接口，在进料口承载尿液样品或含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液后，流入所述富集填充柱富集所需分析成分。优选地，步骤C)中，所述辅助气与富集填充柱断开连通后，所述辅助气经管路依次通过切换阀的第二接口、第三接口，排出。优选地，步骤C)中，所述载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第四接口，并通过控制阀流过富集填充柱后，承载所需分析成分经管路依次通过切换阀的第一接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪。优选地，步骤D)中，所述载气与富集填充柱断开连通后，所述载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪。优选地，步骤A)或D)中，所述辅助气经管路依次通过切换阀的第二接口、第一接口，流入所述富集填充柱进行吹扫。优选地，步骤A)、B)或C)中，所述排空是指，所述辅助气经控制阀或切换阀排空。更优选地，所述辅助气经控制阀排空是指，所述辅助气经管路由控制阀切换从vent口排出。更优选地，所述辅助气经切换阀排空是指，所述辅助气经管路通过控制阀后，依次通过切换阀的第四接口、第三接口，排出。如上所述，本发明提供的一种尿液中尼古丁及可替宁的分析方法，采用改性介孔材料作为吸附-脱附填料从而对尼古丁及可替宁进行固相富集，结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)，开发了集富集-热脱附-进样-分析为一体的在线样品分析联用系统，无须使用溶剂洗脱，实现了吸烟者尿液中尼古丁及可替宁在线分析。该分析方法便捷、高效、快速，灵敏度高、重复性好，能够完全满足尿液中尼古丁及可替宁的分析需要，为大批量尿液样品快速测定提供了一种新的途径。附图说明图1显示为本发明的一种尿液中尼古丁及可替宁的分析系统在样品富集或吹扫状态时的连接结构示意图。图2显示为本发明的一种尿液中尼古丁及可替宁的分析系统在样品进样状态时的连接结构示意图。图1、2中，1：富集填充柱；2：进料口；3：控制阀；4：切换阀；5：恒温杯；6：气相色谱仪；7：质谱仪。图1、2中，六通阀中的接口分别为A：第一接口；B：第二接口；C：第三接口；D：第四接口；E：第五接口；F：第六接口。图3显示为本发明的固相富集装置中热脱附填料的SEM图3a、3b，其中，图3a为改性前的SEM图，图3b为改性后的SEM图。图4显示为本发明的一种尿液中尼古丁及可替宁检测的气相色谱图，其中，IS为内标物组分。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。以下实施例使用的试剂和仪器如下：1、试剂尿液(每天吸烟在15～25支的有4～6年吸烟史的人群排泄物)；氦气(纯度≥99.999％，上海浦江特种气体有限公司)；尼古丁标准品(纯度≥99.5％，百灵威公司)；可替宁标准品(纯度≥99.5％，百灵威公司)；介孔材料(参照Chem.Eur.J.,2018,24,478-486合成材料)；玻璃纤维(Agilent公司生产的进样口衬管专用玻璃纤维)；甲醇(纯度≥99.5％，百灵威公司)；正十六烷(纯度≥99.5％，百灵威公司)；纯水(纯水机自制)。2、仪器7890B-5977A型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；HP-5ms毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μmdf，美国Agilent公司)；恒温杯(由K型热电偶、加热带和日本希曼顿MR13温控表头自制)。实施例11、实验装置本发明中提供一种尿液中尼古丁及可替宁的在线分析系统，包括依次经管路连接的富集装置、气相色谱仪、质谱仪，所述富集装置包括有恒温杯、富集填充柱、切换阀，所述富集填充柱、切换阀置于恒温杯内，所述富集填充柱的进料口和出料口分别与切换阀之间经管路连通，所述切换阀还经管路分别外接有辅助气及载气。其中，所述切换阀为六通阀，所述六通阀按逆时针方向依次设有第一接口、第二接口、第三接口、第四接口、第五接口、第六接口。所述富集填充柱的出料口与切换阀之间的管路上设有控制阀，所述控制阀为三通截止阀，即三通球阀。所述恒温杯为带有程序升温控制器的恒温加热杯。富集填充柱为不锈钢管，富集填充柱的外径为5-7mm，内径为3-5mm。富集填充柱内填充有介孔材料，所述富集填充柱两端装填有玻璃纤维，介孔材料的化学成分选自纯SiO2或纯碳中的一种或两种混合。介孔材料为介孔小球，介孔小球的孔径为2～5nm，介孔材料要进行预处理，所述介孔材料的预处理条件为在650-750℃下的100％水蒸气中焙烧5-7h。玻璃纤维为去活化玻璃纤维，玻璃纤维在富集填充柱内一端的装填高度为1～10mm。2、色谱条件所述GC-MS检测条件为：气相色谱条件为：色谱柱：HP-5ms毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μmdf)；进样口温度：250℃；进样量：10μL；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：1.0ml/min，恒流模式；分流模式：不分流；接口温度：250℃；升温程序：初始温度140℃保持1min，以5℃/min的速率升至160℃保持1min，再以30℃/min的速率升至230℃，保持1min。质谱条件为：离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离方式：EI源；电离能量：70eV；扫描方式：选择离子监测(SIM)；定量离子：尼古丁为m/z＝84，可替宁为m/z＝98。3、含有内标物的标准样品制备在进样前，如图1所示，通过六通阀切换，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空。具体来说，辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，流入富集填充柱进行吹扫，并通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-3min。取含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入进料口，如图1所示，通过六通阀切换，辅助气承载含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气排空。具体来说，辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，在进料口承载含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，富集装置在辅助气吹扫下进行吸附富集的温度为100-300℃，即此时恒温杯的设定温度为100-300℃。吸附富集的时间为1-5min。辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-3min。含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为5-15：0.05-0.15。含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液中，尼古丁的浓度为1-2000ng/mL，可替宁的浓度为1-2000ng/mL，内标物的浓度为90-110ng/mL。其中，内标物为正十六烷，溶剂为甲醇。接通载气，如图2所示，通过六通阀切换，所述辅助气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路通过控制阀流过富集填充柱后，在载气吹扫下进行热脱附后，承载所需分析成分流出，作为含有内标物的标准样品，流入气相色谱仪及质谱仪进行分析。具体来说，辅助气与富集填充柱断开连通后，所述辅助气经管路依次通过切换阀的第二接口、第三接口，排出。载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第四接口，并通过控制阀流过富集填充柱后进行热脱附，承载所需分析成分经管路依次通过切换阀的第一接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪进行测定。其中，富集装置在载气吹扫下进行热脱附或进入GC-MS进行检测时的温度为240-260℃，即此时恒温杯的设定温度为240-260℃。载气吹扫条件为：载气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-10min。含有内标物的标准样品在载气吹扫下进入GC-MS进行检测后，所述富集装置的温度与气相色谱仪中升温程序的初始温度相同，即此时恒温杯的设定温度与气相色谱仪中升温程序的初始温度相同。含有内标物的标准样品的检测结果见图4。测定后，如图1所示，通过六通阀切换，所述载气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路直接流入至气相色谱仪及质谱仪，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空。具体来说，所述载气与富集填充柱断开连通后，所述载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪。辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，流入富集填充柱进行吹扫，并通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-3min。4、待测样品的制备取尿液样品注入进料口，如图1所示，通过六通阀切换，辅助气承载尿液样品经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气排空。具体来说，辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，在进料口承载尿液样品经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，富集装置在辅助气吹扫下进行吸附富集的温度为100-300℃，即此时恒温杯的设定温度为100-300℃。吸附富集的时间为1-5min。辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-3min。尿液样品注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为5-15：0.05-0.15。接通载气，如图2所示，通过六通阀切换，所述辅助气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路通过控制阀流过富集填充柱后，在载气吹扫下进行热脱附后，承载所需分析成分流出，作为待测样品，流入气相色谱仪及质谱仪进行分析。具体来说，辅助气与富集填充柱断开连通后，所述辅助气经管路依次通过切换阀的第二接口、第三接口，排出。载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第四接口，并通过控制阀流过富集填充柱后进行热脱附，承载所需分析成分经管路依次通过切换阀的第一接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪进行测定。其中，富集装置在载气吹扫下进行热脱附或进入GC-MS进行检测时的温度为240-260℃，即此时恒温杯的设定温度为240-260℃。载气吹扫条件为：载气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-10min。待测样品在载气吹扫下进入GC-MS进行检测后，所述富集装置的温度与气相色谱仪中升温程序的初始温度相同，即此时恒温杯的设定温度与气相色谱仪中升温程序的初始温度相同。测定后，如图1所示，通过六通阀切换，所述载气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路直接流入至气相色谱仪及质谱仪，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空。具体来说，所述载气与富集填充柱断开连通后，所述载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪。辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，流入富集填充柱进行吹扫，并通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为40-60mL/min；吹扫时间为1-3min。5、测定采用内标法，先配制一系列不同浓度的含有内标物的标准样品，其中含有同一浓度的内标物以及一系列不同浓度的尼古丁、可替宁。采用GC-MS进样分析，分别获得含有内标物的标准样品中尼古丁、可替宁含量与峰面积的线性关系，以及内标物与峰面积的对应关系，以内标物与峰面积的对应含量关系为定量基准，分别以尼古丁或可替宁色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测样品采用GC-MS检测，将获得的待测样品中尼古丁、可替宁的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可计算得到相应尼古丁、可替宁成分的含量。实施例21、实验装置本实施例中使用的一种尿液中尼古丁及可替宁的在线分析系统，同实施例1的1中的实验装置。其中，富集填充柱为不锈钢管，其外径为6mm，内径为4mm。富集填充柱内填充有介孔材料，所述富集填充柱两端装填有玻璃纤维，介孔材料的化学成分选自纯SiO2或纯碳中的一种或两种混合。介孔材料为介孔小球，介孔小球的孔径为2～5nm，介孔材料要进行预处理，介孔材料的预处理条件为在700℃下的100％水蒸气中焙烧6h。玻璃纤维为去活化玻璃纤维，玻璃纤维在富集填充柱内一端的装填高度为5mm。富集装置中介孔材料的填充量为0.1g。2、色谱条件所述GC-MS检测条件为：气相色谱条件为：色谱柱：HP-5ms毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μmdf)；进样口温度：250℃；进样量：10μL；载气：高纯氦气，载气纯度≥99.999％；载气流速：1.0ml/min，恒流模式；分流模式：不分流；接口温度：250℃；升温程序：初始温度140℃保持1min，以5℃/min的速率升至160℃保持1min，再以30℃/min的速率升至230℃，保持1min。质谱条件为：离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离方式：EI源；电离能量：70eV；扫描方式：选择离子监测(SIM)；定量离子：尼古丁为m/z＝84，可替宁为m/z＝98。3、含有内标物的标准样品制备在进样前，如图1所示，通过六通阀切换，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空。具体来说，辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，流入富集填充柱进行吹扫，并通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为2min。取含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入进料口，如图1所示，通过六通阀切换，辅助气承载含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气排空。具体来说，辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，在进料口承载含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，富集装置在辅助气吹扫下进行吸附富集的温度为250℃，即此时恒温杯的设定温度为250℃。吸附富集的时间为2min。辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为2min。含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入的体积为10μL，即含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为10：0.1。含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液中，尼古丁的浓度为1-2000ng/mL，可替宁的浓度为1-2000ng/mL，内标物的浓度为100ng/mL。其中，内标物为正十六烷，溶剂为甲醇。接通载气，如图2所示，通过六通阀切换，所述辅助气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路通过控制阀流过富集填充柱后，在载气吹扫下进行热脱附后，承载所需分析成分流出，作为含有内标物的标准样品，流入气相色谱仪及质谱仪进行分析。具体来说，辅助气与富集填充柱断开连通后，所述辅助气经管路依次通过切换阀的第二接口、第三接口，排出。载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第四接口，并通过控制阀流过富集填充柱后进行热脱附，承载所需分析成分经管路依次通过切换阀的第一接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪进行测定。其中，富集装置在载气吹扫下进行热脱附或进入GC-MS进行检测时的温度为250℃，即此时恒温杯的设定温度为250℃。载气吹扫条件为：载气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为5min。含有内标物的标准样品在载气吹扫下进入GC-MS进行检测后，所述富集装置的温度为140℃，即此时恒温杯的设定温度为140℃。含有内标物的标准样品的检测结果见图4。测定后，如图1所示，通过六通阀切换，所述载气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路直接流入至气相色谱仪及质谱仪，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空。具体来说，所述载气与富集填充柱断开连通后，所述载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪。辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，流入富集填充柱进行吹扫，并通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为2min。4、待测样品的制备取尿液样品注入进料口，如图1所示，通过六通阀切换，辅助气承载尿液样品经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气排空。具体来说，辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，在进料口承载尿液样品经管路流入富集填充柱富集所需分析成分，流出富集填充柱的辅助气通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，富集装置在辅助气吹扫下进行吸附富集的温度为250℃，即此时恒温杯的设定温度为250℃。吸附富集的时间为2min。辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为2min。尿液样品注入的体积为10μL，即尿液样品注入的体积(μL)，与富集装置中介孔材料的填充量(g)之比为10：0.1。接通载气，如图2所示，通过六通阀切换，所述辅助气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路通过控制阀流过富集填充柱后，在载气吹扫下进行热脱附后，承载所需分析成分流出，作为待测样品，流入气相色谱仪及质谱仪进行分析。具体来说，辅助气与富集填充柱断开连通后，所述辅助气经管路依次通过切换阀的第二接口、第三接口，排出。载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第四接口，并通过控制阀流过富集填充柱后进行热脱附，承载所需分析成分经管路依次通过切换阀的第一接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪进行测定。其中，富集装置在载气吹扫下进行热脱附或进入GC-MS进行检测时的温度为250℃，即此时恒温杯的设定温度为250℃。载气吹扫条件为：载气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为5min。待测样品在载气吹扫下进入GC-MS进行检测后，所述富集装置的温度为140℃，即此时恒温杯的设定温度为140℃。测定后，如图1所示，通过六通阀切换，所述载气与富集填充柱断开连通，所述载气经管路直接流入至气相色谱仪及质谱仪，所述辅助气经管路流入富集填充柱进行吹扫，吹扫后的辅助气流出富集填充柱排空。具体来说，所述载气与富集填充柱断开连通后，所述载气经管路依次通过切换阀的第五接口、第六接口，流入气相色谱仪及质谱仪。辅助气经管路通过六通阀的第二接口、第一接口，流入富集填充柱进行吹扫，并通过管路由三通截止阀切换从vent口排出或者经六通阀的第四接口、第三接口排出。其中，辅助气吹扫条件为：辅助气为氦气，纯度≥99.999％；吹扫流速为50mL/min；吹扫时间为2min。5、测定采用内标法，先配制一系列不同浓度的含有内标物的标准样品，其中含有同一浓度的内标物以及一系列不同浓度的尼古丁、可替宁。采用GC-MS进样分析，分别获得含有内标物的标准样品中尼古丁、可替宁含量与峰面积的线性关系，以及内标物与峰面积的对应关系，以内标物与峰面积的对应含量关系为定量基准，分别以尼古丁或可替宁色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测样品采用GC-MS检测，将获得的待测样品中尼古丁、可替宁的色谱峰面积，分别代入相应标准工作曲线的回归方程中，可计算得到相应尼古丁、可替宁成分的含量。实施例3取含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液，按实施例2中的3制备含有内标物的标准样品，并根据实施例2中的2的色谱条件进行测定，含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液中，尼古丁的浓度为2000ng/mL，可替宁的浓度为2000ng/mL，内标物正十六烷的浓度为100ng/mL。在测定过程中，富集填充柱中介孔材料的填充量为0.1g。用于吸附、脱附吸烟者尿液中典型暴露标志物尼古丁及可替宁的情况见表1。介孔材料的电子图如图3a、3b所示。由表1、图3a、3b可知，本发明中选用的介孔材料具有优异的吸附及脱附性能。表1尼古丁及可替宁吸脱附情况吸附物质材料制备条件检出量/ng检出率/％尼古丁6h@700℃3.93178.62可替宁6h@700℃3.13162.62注：标样浓度2000ng/mL，进样量10μL；6h@700℃表示在700℃温度下100％水蒸气中焙烧6小时实施例4分别准确移取10μg/mL的尼古丁标准储备溶液和10μg/mL的可替宁标准储备溶液0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、20mL于100mL容量瓶中，同时移入100ng/mL内标溶液0.1mL，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，配制成一系列不同浓度的含内标物的尼古丁和可替宁的标准溶液。将上述配制好的一系列不同浓度的标准工作溶液按实施例2中的3制备含有内标物的标准样品，并根据实施例2中的2的GC-MS色谱条件进行测定，获得尼古丁和可替宁成分的标准回归方程、相关系数和线性范围。具体结果见表2。由表2可知，尼古丁和可替宁在一定浓度的线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的相关系数均大于0.9997。并以样品中组分在仪器上产生3倍信噪比(S/N)所对应的分析物浓度分别计为方法检出限(LOD)，结果如下表2所示，尼古丁的LOD为0.5ng/mL，可替宁的LOD为0.4ng/mL。同时，取一个已知浓度的尿液样品6份，按实施例2中的4制备待测样品，并根据实施例2中的2的GC-MS色谱条件进行测定，计算测定结果的相对标准偏差，验证方法的精密度。具体结果见表2。由表2可知，其相对标准偏差均低于4％，方法的精密度良好。同时，取一个已知浓度的尿液样品，在样品溶液中加入低、中、高3个水平的尼古丁及可替宁，加入含量分别为10ng、100ng、200ng，每个水平重复6次，按实施例2中的4制备待测样品，并根据实施例2中的2的GC-MS色谱条件进行测定，计算回收率。具体结果见表2。由表2可知，高、中、低三个浓度的尼古丁加样平均回收率在97.28～103.71％之间，可替宁加样平均回收率在98.32～104.55％之间，其测定结果的回收率良好。表2尼古丁与可替宁的回归方程、相关系数和检测限(S/N≥3)(n＝6)实施例5用所建立的方法对吸烟及非吸烟者尿液中的尼古丁及可替宁进行了测定，结果表明非吸烟者尿液中尼古丁与可替宁含量均小于5ng/mL，而吸烟者尿液中尼古丁含量为259-1315ng/mL，可替宁含量为119-532ng/mL。由上可知，本发明所述建立的分析吸烟者尿液中尼古丁及可替宁含量方法便捷、高效、快速，适用于吸烟者尿液中尼古丁及可替宁分析。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页1 2 3